蟾酥缓释注射液增强疫苗免疫应答的作用机理研究

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1、蟾酥缓释注射液增强疫苗免疫应答的作用机理研究Studyonthemechanismofenhancementofvaccines-inducedimmuneresponsesbySustained-releaseInjectionofVenenumBufonis作者姓名：吴帅成专业名称：临床兽医学研究方向：兽医临床中药学与针灸指导教师：韦旭斌教授学位类别：农学博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年6月5日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位何启盖教授华中农

2、业大学主席陈振文教授首都医科大学宋晓平教授西北农林科技大学委员徐世文教授东北农业大学邓干臻教授华中农业大学邓旭明教授吉林大学郭世宁教授华南农业大学丁壮教授吉林大学葛铭教授东北农业大学刘波教授吉林大学杨勇军教授吉林大学岳占碰教授吉林大学2中文摘要蟾酥缓释注射液增强疫苗免疫应答的作用机理研究蟾酥是一味具有悠久应用历史的传统中药，具有解毒消肿、止痛开窍之功效，常用于治疗疮黄疔毒、咽喉肿痛和中暑神昏等病证。现代药理学研究证明蟾酥具有提高疫苗免疫效力、抗肿瘤、强心和镇痛等药理作用。兽医临床应用蟾酥原药治疗猪无名高热和猪气

3、喘病等取得了很好的治疗效果。然而蟾酥原药刺激性大，操作不便，限制了其在兽医临床上的应用。为此，我们运用现代兽药制剂技术将中药蟾酥制备成了蟾酥缓释注射液(SIVB），该制剂具有安全、长效和使用方便的特点。安全、有效和质量可控是现代兽药制剂的基本要求，因此，我们在前期安全性试验的基础上，按照我国兽药管理规范对SIVB进行药效学研究，为其进一步在临床上的应用奠定基础。根据相关文献报道，蟾酥可以提高疫苗免疫效力，具有免疫佐剂的活性。免疫佐剂可通过促进Th1、Th2或Th17免疫应答提高疫苗免疫效力。因此我们首先以鸡卵清

4、白蛋白（OVA）为模式抗原，研究SIVB对Th1、Th2和Th17免疫应答的影响。对ICR小鼠于第1d和第15d分别皮下注射免疫OVA（100μg），同时于第1d皮下注射SIVB（0.05ml、0.1ml和0.2ml）。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清OVA-specificIgG及其亚类IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，MTS法测定刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）诱导的脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定OVA刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ、IL-4和IL-17A水平。结果可知，SIV

5、B能显著提高OVA免疫小鼠血清OVA-specificIgG及其亚类IgG1和IgG2a水平，显著促进了ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，显著促进了脾淋巴细胞分泌IFNγ、IL-4和IL-17A。结果表明SIVB可以同时促进OVA诱导的Th1免疫应答、Th2免疫应答和Th17免疫应答。为阐明SIVB的药效物质基础，我们进一步研究了SIVB中远华蟾酥毒基（TBG）和华蟾酥毒基（CBG）两种成分对OVA诱导的Th1、Th2和Th17免疫应答的影响。对ICR小鼠于第1d和第15d分别皮下注射免疫OVA（100μg

6、）、TBG（10μg、20μg和40μg）+OVA（100μg）、CBG（10μg、20μg和40μg）I+OVA（100μg）。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清OVA-specificIgG及其亚类IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，MTS法测定ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定OVA刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ、IL-4和IL-17A水平，RT-PCR法测定T-bet、GATA-3和RORγtmRNA表达水平，流+式细胞法测定小鼠脾淋巴细胞CD3亚群比例。结果可知，T

7、BG和CBG可以提高OVA免疫小鼠血清OVA-specificIgG及其亚类IgG2a水平，促进脾淋巴细胞+++分泌IFNγ及其T-betmRNA表达，提高了小鼠脾淋巴细胞中CD3、CD3CD4++和CD3CD8比率。此外，TBG对OVA免疫小鼠血清OVA-specificIgG1水平无显著影响，对脾淋巴细胞IL-4和IL-17A分泌及其GATA-3和RORγtmRNA表达水平无显著影响；CBG显著降低OVA免疫小鼠血清OVA-specificIgG1水平，显著抑制脾淋巴细胞IL-4的分泌及GATA-3mRNA

8、表达水平，对脾淋巴细胞IL-17A的分泌及RORγtmRNA表达水平无显著影响。结果表明，TBG和CBG可以促进OVA诱导的Th1免疫应答，其机制可能与促进脾淋巴细胞表达T-betmRNA有关。前面的研究结果表明SIVB及其成分TBG和CBG具有促进疫苗Th1免疫应答的作用，我们推测SIVB及TBG和CBG可以作为胞内病原体疫苗的免疫佐剂，增强机体的抗胞内病原体作用。为此，我们进一步研