microrna-208b调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyonMicroRNA-208bRegulatingOsteoblasticDifferentiationofVascularSmoothMuscleCellsByBaohuaShanSupervisor：Prof．XianguoZhaoSurgicaldepartmentTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay,2013学位论文原创性声明本人郑重声明：

2、所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：羊错日期：么移年厂月穹日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编

3、入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：军啤彳日期：历哆年广月刁Et摘要MicroRNA．208b调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的研究研究生单保华导师赵显国教授郑州大学第一附属医院泌尿外科中国郑州450052摘要研究背景和目的：心血管疾病(cardiovasculardisease，cvo)仍是终末期肾脏病(end．stagerenaldiseas

4、e，ESRD)患者的最主要死因。约50％ESRD患者死于心血管疾病。ESRD患者普遍存在血管钙化，血管钙化尤其是冠状动脉钙化是这类患者心血管疾病的重要危险因素，血管钙化会使心血管疾病的发病率和死亡率增加3．4倍。虽然血管钙化曾经被认为是钙、磷代谢失衡所导致的矿物质异位的结果，但现在人们认为血管钙化是一个与骨重塑相似的过程。研究证实，血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞表型转化在血管钙化过程中具有重要作用。这些成骨样平滑肌细胞中心肌蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、平滑肌a．肌动蛋白等平滑肌细胞的特异性标记物的表达减少，而碱性磷酸酶(AL

5、P)、骨钙素(OC)、核结合因子仪1(Cbfal／Runx2)等骨相关蛋白的表达增加。但到目前为止相关的机制尚未完全阐明。微小RNA(microRNA，miRNA)是Lee等于1993年通过分析突变体线虫的发育时间发现的。miRNA是长约18"～25个核苷酸构成的单链非编码RNA。迄今为止，miRBase记录了超过160个物种的20000个成熟miRNA序列。通过结合靶基因的3'-UTR，miRNA抑制特异靶基因的翻译和(或)促进它们转录的mRNAs的降解，从而负性调节基因的表达。MiRNAs在新陈代谢、分化、细胞凋亡等多个方面发挥

6、着重要作用。研究表明miRNAs在血管钙化中的作用在于miRNAs与平滑肌细胞表型转换有关。迄今为止，已经报道了miR．30b、miR．30c、miR．125b等miRNAs通过调控VSMCs向成骨样细胞分化来参摘要与血管钙化的发生。miR．208家族有两个成员即miR．208a矛lmiR．208b。miR．208a由Ⅸ．心肌肌球蛋白重链基因(Myh6)编码，miR．208b由p心肌肌球蛋白重链基因(Myh力编码。目前miR．208b在vsMCs向成骨样细胞分化过程中所起的作用鲜见报道。本实验首先检i贝tJmiR．208b在终末期肾

7、病患者桡动脉中的表达水平，在此基础上行体外动物实验，进一步研究miR．208b在VSMCs向成骨样细胞分化过程中的作用。方法：收集37例ESRD患者行动静脉瘘手术时的桡动脉标本及11例肾功能正常的患者行胃大部切除手术时的胃左动脉作为对照。茜素红染色测定钙盐沉积，Northern免疫印迹法检测桡动脉和胃左动脉标本中miR．208b的表达水平。体外培养大鼠VSMCs，用D．甘油磷酸钠(D—GP)诱导细胞钙化，分别检测成骨样细胞分化指标碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)和矿化结节量的变化，运用实时定量PCR技术检测miR．208b表

8、达水平的变化，Western免疫印迹法检测Runx2蛋白。用脂质体法将miR．208bmimics和miR．NC分别转染至两组大鼠VSMCs，未转染组作空白对照，用J3-GP诱导钙化，同样方法检测ALP活性、OC分泌量、矿化结节量、R