甲羟戊酸途径合成β-榄香烯的相关代谢酶的体外重组表达及催化研究.pdf

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1、分类号：Q936单位代码：10346密级：学号：2015111010054硕士学位论文（学术学位）中文论文题目：甲羟戊酸途径合成β-榄香烯的相关代谢酶的体外重组表达及催化研究英文论文题目：Invitrorecombinantexpressionandcatalyticstudyoftheenzymerelatedtothesynthesisofβ-elemenebymevalonatepathway申请人姓名：朱琳芳指导教师：谢恬合作导师：王秋岩专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：微生物化学与分子生物所在学院：生命与环境科学学院论文提交日期2018年5月杭州师范大学硕士学位论文致谢II杭

2、州师范大学硕士学位论文致谢致谢时光总在不经意中流逝，三年的研究生生涯转眼即逝，翻开厚厚的实验记录本，看着上面记录着的一天一天的密密麻麻的数据，才意识到自己真的要毕业了。在这三年里，我要感谢很多人，让我不仅学到了知识和技能，更让我学会了成长。我的导师谢恬教授，首先要特别感谢您，您总是一有时间就与我们交流近期的学术进展，及时了解我们的动态，时刻提醒我们要有精益求精、勇于创新的精神。您对科研的不懈追求精神以及不断充实自身知识储备的态度深深地感染着我，让我在遇到困难的时候有了坚持下去的动力。同时我也要感谢王秋岩老师，您有着渊博的专业知识和独到的科研见解，是您教会我做科研时要不断地开阔自己的思路，要尝

3、试用多种方法解决问题，您严谨的科研态度和一丝不苟的工作作风更是令我受益终生。您在课题的选取和论文的写作中都倾注了大量的心血，更是在实验过程中给与了细致耐心的指导，在此向您表示衷心的感谢！除了以上两位老师，实验过程也得到了殷哓浦老师、王淑玲老师、曾昭武老师、陈侠斌老师、谌容老师、赵淑娟老师等人的指点和帮助，你们在实验结果的分析以及论文的写作上都提出了宝贵的意见，更是在生活中给了我无微不至的关心和呵护，谢谢你们带给我的温暖！此外，实验室的伙伴们也给了我很大的帮助，师兄庞潇卿、赵荣、杜鹏飞、林骥光，师姐马转转、曾义英、吴慧丽，你们的悉心指导，让我从一个分子生物实验的新手蜕变成能够独立地操作自己的课

4、题。感谢师妹张路路、朱瑶、张娜娜、张若男、李晨曦，师弟张超在实验过程中提供的方便，让我的实验进程加快。还有同门周晓晓、吴萼、张瑞、蒋伊俐、孙建锋，有了你们的陪伴，实验之余总是充满了各种欢乐，科研生活也增添了许多乐趣。同时也要感谢下沙的小伙伴何燕、原野、黄双玉、汪钱等，及时向我传达学院各种动态，让我的实验无后顾之忧！同时，感谢参加本论文评阅评议的各位专家、教授，你们辛苦了！最后，感谢一路伴我成长的家人，感谢你们关心我支持我，理解我包容我，我会努力变得更加优秀，成就更好的自己！三年的成长离不开各位良师益友，感谢生命中遇到的你们，愿大家都能拥有灿烂的人生！I杭州师范大学硕士学位论文摘要摘要β-榄香

5、烯是抗癌药物榄香烯中的有效成分，是从中药温郁金中提取分离而来的。由于其抗癌谱广，疗效确切，且毒副作用轻微，目前临床上可用它治疗多种恶性肿瘤。因而提高β-榄香烯的产量对于医学、药学以及生命科学等众多领域都具有重大的研究意义。体外多酶催化是在体外反应体系中加入纯化好的酶以及辅酶,使底物经历顺序的多步反应,获得最终目标产物的过程。相对于传统的利用生物体内的代谢途径合成目标产物，体外催化能减少宿主细胞自身对某些物质的代谢需求，使反应体系中的酶全部用于催化最终产物的生成，具有产量高，速率高，生物条件易控制,产物易分离,底物可选择性等优点，成为合成生物学领域发展非常迅速的一种研究方法，且它可以不去阐明生

6、物体内复杂的细胞代谢,大大提高了研究效率。本研究利用已经阐明的生物体内甲羟戊酸途径合成β-榄香烯中的相关代谢酶，成功地体外过量表达了MVA下游途径的5个酶（MK,PMK,MVD1,idi,ispA），其表达的可溶性蛋白占到总蛋白的90%。本研究通过镍柱亲和层析的纯化方法，得到了这5个纯酶，其浓度分别为0.9mg/mL、0.8mg/mL、2.5mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL。吉马烯A合酶是生物合成β-榄香烯过程中催化前体物质法尼基焦磷酸(FPP)生成吉马烯A的关键酶，产物吉马稀A在体外可以通过简单Cope重排直接获得β-榄香烯。本研究选取了西洋蓍草来源的GAS，并成功地进行了体

7、外过量表达，实验结果显示，与蓝细菌来源的GAS（包涵体占76%）相比，西洋蓍草来源的GAS表达的可溶性蛋白占到总蛋白的80%，由此得到了可溶性更高GAS，并通过镍柱纯化得到了纯酶，其浓度为1.2mg/mL。将纯化得到的MVA下游途径的5个酶以及西洋蓍草来源的GAS进行体外催化反应，气相检测无明显的目标产物的峰，对结果进行分析，可能是酶纯化后在体外常温条件下活性降低，催化能力很弱，因此如何提高酶在体外反应中的活