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1、第33卷第2期华中农业大学学报Vol.33No.22014年3月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityMar.2014,28~33利用细菌双杂交文库筛选华癸中慢生根瘤菌7653R中与外膜蛋白Opa22互作的蛋白李一星李芳周鑫兰谢福莉李友国华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070摘要为研究华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R外膜蛋白Opa22在共生固氮过程中的作用机制,构建了细菌双杂交基因组随机文库,并以Opa22为诱饵,钓取与其相互作用的候选靶蛋白。结果获得12个与Opa22蛋白互作的
2、阳性克隆,为后续研究Opa22的作用机制提供了新的线索和思路,同时也为开展根瘤菌蛋白互作的研究构筑了良好的技术平台。关键词华癸中慢生根瘤菌7653R;细菌双杂交文库;共生固氮;Opa22;互作蛋白中图分类号S154.38+1文献标识码A文章编号1000-2421(2014)02-0028-06根瘤菌和豆科植物的共生固氮是一个多基因参及相关近缘细菌中。结构域分析表明Opa22蛋白与的复杂过程,涉及到多种细胞信号传递途径及多属于外膜蛋白,具有β-barrel结构域,与不透明蛋白[1-2]个蛋白的相互作用。随着愈来愈多根瘤菌基因及相关的表面抗原COG3637、表面抗原2家族以及[
3、8]组测序的完成,更多的学者开始致力于共生固氮中外膜蛋白OmpW家族具有较高同源性。这3个蛋白互作网络的研究,以期从蛋白互作的角度进一家族在许多动植物的病原菌中均存在,COG3637家[9]步完善对根瘤菌共生固氮分子机理的认识。细菌双族参与细菌与宿主的相互识别、附着和侵染;表面杂交系统是一种在细胞内研究蛋白质互作的有效方抗原2家族可保护病原菌免受宿主免疫反应的伤[10]法,与酵母双杂交系统相比,它具有如下一些优点:害,引起免疫逃逸;而OmpW家族可保护细菌,大肠杆菌比酵母菌生长繁殖快、转化效率高、遗传操抵抗抗生素等不良因素的胁迫,免受宿主细胞的吞[11-12]作方便,可进行
4、快速高通量的研究;检测灵敏度高,噬。前期研究表明opa22的突变株不能在紫[3]降低了假阳性和假阴性的发生率;适用范围广,可云英根部结瘤,干扰了侵入线的形成。因此推测,[4]用于研究膜蛋白的相互作用等。因此细菌双杂交Opa22可能参与根瘤菌与宿主之间的相互识别,在系统被广泛应用于功能基因组学的研究,目前该系侵染过程中发挥作用。为了研究该蛋白在共生固氮[5]统也已被应用于固氮领域的研究。如廖贡献等利过程中的作用机制,本研究构建了华癸中慢生根瘤用大肠杆菌双杂交系统研究了阴沟肠杆菌固氮调节菌7653R细菌双杂交基因组随机文库,旨在筛选与[6]蛋白NifL和NifA的相互作用;王应
5、祥等建立了Opa22互作的候选靶蛋白,为后续的深入研究提供大豆根系细菌双杂交的cDNA文库,从中钓取并获新的线索、思路和材料。得与GmWNK1互作的蛋白。1材料与方法华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R可以与豆科植物紫云英共生固氮。前期工作1.1材料中我们利用Tn5转座子插入突变体库,从该菌中分报告菌株大肠杆菌EscherichiacoliXL1-Blue、离克隆到一个与早期结瘤相关的新基因opa22,它细菌双杂交载体pBT和pTRG均购自Stratagene[7]编码一个含有257个氨基酸残基的蛋白。Blastn公司;华癸中慢生根瘤菌76
6、53R(M.huakuii分析发现opa22同源基因存在于多个种属根瘤菌7653R)、大肠杆菌DH5α和DH10B均为华中农业收稿日期:2013-10-17基金项目:国家自然科学基金项目(31371549)、国家“973”计划项目(2010CB126502)和博士点基金项目(20110146110012)李一星,博士,讲师.研究方向:根瘤菌共生固氮的分子机理.E-mail:liyixing39@mail.hzau.edu.cn通信作者:李友国,博士,教授.研究方向:生物固氮、农业环境微生物.E-mail:youguoli@mail.hzau.edu.cn第2期李一星等:利用
7、细菌双杂交文库筛选华癸中慢生根瘤菌7653R中与外膜蛋白Opa22互作的蛋白29大学农业微生物学国家重点实验室生物固氮研究室CCGCCATAA-3′。按照100μL/管分别从80个甘保存。ExTaq酶、T4连接酶(Fermentas)、各种限油管中吸取菌液,加入200mLLB+Tet液体培养制性内切酶为Fermentas公司产品;AlkalinePhos-基中,30℃振荡培养过夜,次日收集菌体并抽提文phatase,Calfintestine(CIAP)购自Promega公司;库转化子的混合质粒,作为华癸中慢生根瘤
