水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达

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1、分类号：UDC：密级：学校代号：11845学号：2111106025广东工业大学硕士学位论文(工学硕士)水葫芦谷氨酰胺合成酶基因的克隆及表达蒋丽花指导教师姓名、职称：使明龌塾握企业导师姓名、职称：玉专业或领域名称：生物丝工学生所属学院：鳌王丝王堂瞳论文答辩日期：垒Q!垒生墨旦Q墨目ADissertationSubmittedtoGuangdongUniversityofTechnologyfoltheDegreeofMasterofEngineeringScienceCloningandexpressionanalysisofGlutamineSy

2、nthetasegeneGSfromEichhomiacrassipesCandidate：JiangLihuaSupervisor：Prof．FuMinghuiMay2014SchoolofChemicalEngineeringandLightIndustryGuangdongUniversityofTechnologyGuangzhou，Guangdong，P．R．China，510006摘要谷氨酰胺合成酶(GS)在高等植物氮代谢中起着重要的作用，是参与氨同化过程的关键酶。植物GS具有多种同工酶，根据亚细胞定位，分为胞液型谷氨酰胺合成酶(GSl

3、)和质体型谷氨酰胺合成酶(GS2)。水葫芦在富营养化水体中泛滥生长，会破坏水体生态平衡。但水葫芦具有过度吸收氮磷营养元素的特点，适量的水葫芦可用来净化水质。本文基于大豆、小麦等植物GSl基因保守序列，以水葫芦根部RNA为模板经过两步法RT-PCR法扩增出水葫芦GSl的保守序列片段，再经RACE(Rapid．amplificationofcDNAends)法，克隆了3个完整的GS1基[](Eichhorniacrassipesglutaminesynthetase，分别标号为EcGSla，EcGSlb，EcGSlc)，3个基因全长分别为1434bp、

4、1455bp、1508bp。EcGSla编码一个356个氨基酸残基的多肽，推测的多肽分子量大小为39．3kDa，PI=5．52。EcGSlb编码一个354个氨基酸残基的多肽，推测的多肽分子量大小为39．0kDa，PI=5．95。EcGSlc编码一个356个氨基酸残基的多肽，推测的多肽分子量大小为39．3kDa，PI=5．94。通过氨基酸序列和结构分析显示EcGSla、EcGSlb和EcGSlc蛋白包都含了ATP结合区域，N．糖基化序列，GSbeta．Grasp功能区和GS催化功能区，这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。通过亚细胞定位预测Ec

5、GSla、EcGSlb和EcGSlc蛋白都为胞质型蛋白。通过BLAST分析及进化树构建可知EcGSla、EcGSlb和EcGSlc氨基酸序列与橡胶树的相似性最高。本实验还对清水、铵态氮及硝态氮三种不同培养条件下，水葫芦根部和叶部的EcGSla、EcGSlb和EcGSlc转录水平和GS活性进行了分析。在根部，EcGSla和EcGSlc基因的转录主要受硝态氮影响；EcGSlb基因的转录受外界氮素形态影响不大；GS活性在氮胁迫和铵态氮处理初期受到了抑制，随着处理时间GS活性的抑制解除，GS活性在硝态氮处理2h和6h时受到了明显的抑制。在叶部，在清水，氯化

6、铵，硝酸钾处理下，EcGSla，EcGSlb和EcGSlc基因的转录都提高了，EcGSla基因的转录受氮胁迫的影响最为显著，表现为氮胁迫转录增强；EcGSlb和EcGSlc基因的转录受硝酸钾的影响最显著；GS活性不受氮胁迫的影响，在氯化铵处理2h时和硝酸钾处理4h时下明显提高。关键词：水葫芦；谷氨酰胺合成酶；克隆；RACE；转录；荧光定量PCR；酶活广东工业大学硕士学位论文ABSTRACTGlutaminesynthetase(GS)playsacentralroleinnitrogenmetabolisminallplantsplants，whi

7、chisakeyenzymeduringammoniaassimilation．PlantGSoccursasanumberofisoenzymeformsandtheseGSisoformsarelocatedeitherinthecytosol(GS1)orplastid(GS2)．Eichhorniacrassipescangrowrampantlyineutrophicwatergrowth，whichmadetheecologicalsystemoutofbalance．ButE．crassipescanexcessivelyabsorb

8、thenitrogenandphosphorus，SOE．crassipescanbeusedtopurifywater．