日本沼虾表皮几丁质合成酶基因的克隆及表达分析

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1、单位代码10476学号1204180301分类号Q955硕士学位论文日本沼虾表皮几丁质合成酶基因的克隆及表达分析学科、专业：生物学、生理学研究方向：细胞增殖分化的内分泌调控申请学位类别：理学硕士申请人：郭爱莲指导教师：宁黔冀教授二〇一五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对

2、本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。作者签名:关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）作者签名:ifi^.导师签名:CLONINGEPIDERMALCHITINSYNTHASEGENEANDEXPRESSI

3、ONANALYSISFROMMACROBRACHIUMNIPPONENSEADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFµlfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByGuoAilianSupervisor:Prof.NingQianjiMay,2015摘要日本沼虾（Macrobrachiumnipponense)有坚硬的表皮（又称外骨骼）

4、，生命的不断生长要靠周期性蜕皮来实现，周期性蜕皮与生长、发育和繁殖密切相关。几丁质是日本沼虾表皮结构的重要组成成分，每个蜕皮周期必须不断地合成和分解几丁质，显然，几丁质的合成对其生长是至关重要的。几丁质合成酶（Chitinsynthase，CHS）是几丁质合成路径中的关键酶，了解其基因的结构以及时空表达模式，可以为阐明日本沼虾等甲壳动物蜕皮周期的机理积累资料。本文根据同源基因的保守序列，设计特异性引物，利用SMARTRACE技术，首次从日本沼虾头胸甲组织克隆了几丁质合成酶基因cDNA全长序列。获得的目的基因

5、全长5133bp，开放阅读框（ORF）长度为4701bp，编码1567个氨基酸，提交该序列到GenBank注册号KP710198，并命名为MnCHS。利用ExPASy在线进行序列分析，该蛋白分子量为179.567kD，理论等电点（pI）为6.09。该蛋白共有16个跨膜螺旋，一个保守结构域Chitin_synth_C，9个保守基序，可分为结构域A、结构域B、结构域C。结构域B中含有7个保守域，并含有CHS的两个标签序列EDR和QRRRW。利用MEGA5.05软件，结合其他物种CHS基因，采用邻接法进行聚类分析

6、构建系统发育树，聚类分析表明属于A类几丁质合成酶基因。采用实时荧光定量PCR技术，分析MnCHS基因的时空表达，实验结果显示，MnCHS基因的转录物在多种组织均有表达，在蜕皮周期各阶段，不同组织MnCHS的表达量差异显著；头胸甲在A期达到最高，胃肠在D0和D4期均较高，尾扇和肌肉在D4期最高，肝胰腺则普遍较低。结果表明，MnCHS基因转录物不仅存在于表皮，在其它组织也有分布，且mRNA水平的变化与蜕皮周期有关，作为几丁质生物合成的关键酶，推测该基因的表达在新外表皮和内表皮的形成中发挥重要作用。关键词：日本沼

7、虾，几丁质合成酶基因，序列分析，时空表达IABSTRACTMacrobrachiumnipponensehavehardskin(alsocalledtheexoskeleton),torelyontheperiodicmoltingtoachievethegrowthoflife,theperiodicmoltingiscloselyrelatedtothegrowth,developmentandreproduction.ChitinisanimportantcomponentinMacrobrachi

8、umnipponenseepidermis,andeachmoltingcyclemustcarryonconstantlychitinsynthesisanddegradation,obviously,chitinsynthesisiscrucialforitsgrowth.Chitinsynthase(CHS)isakeyenzymeinthesynthesisofchitin,understandingof