cu2+诱导小胶质细胞激活作用及其分子机制研究

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1、上海交通大学硕士学位论文（2013）上海交通大学硕士学位论文2+Cu诱导小胶质细胞激活作用及其分子机制研究ASTUDYOFCOPPER-INDUCEDMICROGLIALACTIVATIONANDTHEUNDERLYINGMOLECULARMECHANISMS学科专业：药理学作者姓名：胡竹琴指导教师：李娟副教授研究方向：神经药理申请学位级别：硕士资助基金项目：国家自然科学基金资助项目（批准号：30973538）培养单位：上海交通大学医学院基础医学院答辩日期：2013年5月3日I上海交通大学硕士学位论文（2013）上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下

2、，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日II上海交通大学硕士学位论文（2013）上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保

3、密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日III上海交通大学硕士学位论文（2013）2+Cu诱导小胶质细胞激活作用及其分子机制研究摘要小胶质细胞激活诱发的神经炎症及神经元损伤在阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）、帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）、多发性硬化症(Multiplesclerosis，MS)等神经退行性疾病病理生理机制中发挥了重要作用。2+过渡金属离子，特别是具有氧化还原活性的Cu，对于维持中枢神经系统的生理2+生化功能起着重要的作用。脑内Cu浓

4、度过高或过低均可能导致神经元损伤。有2+证据显示，神经退行性疾病患者或者动物模型脑内细胞内外Cu分布不平衡，细2+2+胞外Cu浓度升高，远远超出正常生理浓度，而细胞内Cu浓度降低；过高浓度2+的细胞外Cu可直接损伤神经元，但是否能够直接激活与神经元密切接触的小胶2+质细胞，尚无文献报道。基于此，本课题拟对Cu直接作用于小胶质细胞后，其功能状态的改变及其分子机制进行较深入探讨。本研究采用原代培养的大鼠小胶质细胞以及小鼠BV-2细胞株，应用ELISA、Greiss法和WST-1试剂测定小胶质细胞培养上清中的肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、一氧化氮（nit

5、ricoxide，NO）以及超氧化物（superoxide）含量；应用AmplexRed试剂测定小胶质细胞培养上清或分离线粒体组织中过氧化氢（hydrogenperoxide，H2O2）的含量；应用能够特异性检测活细胞线粒体内活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的荧光探针，检测线粒体内ROS含量；应用Westernblot检测诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）、IκB-表达以及Akt、胞外信号调节激酶（extracellularsignalregulatedkinase1/2，ERK1/2）磷酸化水平。2+2+研究

6、结果显示：1）Cu处理12h后，小胶质细胞呈现明显的激活状态；Cu（5-50μM）能够剂量依赖性地诱导小胶质细胞释放TNF-α和NO，并诱导iNOS2+2+表达；2）IκB-和IKK-2阻断剂能够显著抑制Cu诱导的TNF-α产生；Cu作用12h2+后小胶质细胞内IкB-α表达明显下降（为NF-кB激活标志之一），提示Cu激活小2+胶质细胞的作用为NF-кB依赖性；3）在激活小胶质细胞剂量下，Cu对原代海马神经元没有明显毒性，但其处理小胶质细胞后获得的条件培养液能够明显降低2+神经元活力；4）Cu处理后小胶质细胞培养上清中H2O2含量明显增加（该作用IV上海交通大学硕士学位论文（2013）2+

7、在Cu处理后5min即可产生）；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH）氧化酶（NADPHoxidase，NOX）阻断剂Apocynin（100μM）和Diphenyleneidonium(DPI，10μM)预处理对该作用没有明显影响；2+2+Cu处理后小胶质细胞培养上清中超氧化物水平没有明显变化；Cu能够促进分2+离的线