逆转座子LINE1与细胞低温适应关系的初步研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150110183上海海洋大学硕士学位论文逆转座子LINE1与细胞低温适应关系的题目：初步研究PreliminaryStudyontheFunctionof英文题目：RetrotransposonLINE1inColdAdaptationofCells专业：生物学研究方向：分子生物学姓名：储旭指导教师：陈良标二O一八年五月二十九日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经

2、明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文

3、属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李轩中科院上海植物生理生态研究所研究员主席许强华上海海洋大学教授委员关桂君上海海洋大学教授委员陆颖上海海洋大学研究员委员彭司华上海海洋大学副研究员委员王映上海海洋大学博士秘书答辩地点水产与生命学院A211答辩日期2018.5.29上海海洋大学硕士学位论文逆转座子LINE1与细胞低温适应关系的初步研究摘要逆转座子是一段反向的转录酶介导的核酸重复序列，常见于多细胞生物中，并且在基因组进化中起

4、了很重要的作用。其中一种长散在的重复的核酸序列（LINEs）在脊椎动物基因组中很常见，在基因组中的进化可以追溯到6亿年前。它在人类基因组中占21%，在斑马鱼基因组中占10%以上。LINE1（L1）一般包含两个主要的开放阅读框：ORF1和ORF2，其中ORF1编码核酸结合蛋白，ORF2编码了一种重要的酶，在形成逆转座核酸蛋白复合物的时候起到逆转录酶和核酸内切酶的作用。LINE1的扩增通过“复制和粘贴”的方式，包括了几个主要的过程：转录、转运至细胞质、翻译、形成核酸蛋白复合体，返回至细胞核内、靶位点逆转录转座和插入新的位点。本实验室前期对鳞头

5、犬牙南极鱼（Dissostichusmawsoni）进行了转录组测序，通过对测序结果的分析发现，多个逆转座子表达量显著性升高。我们分析得到一条完整且具有生物学活性的转座子序列并命名为DissostichusmawsoniLINE1（dmL1），猜测这个转座子可能与鱼类低温适应有关系。为了探究LINE1与低温适应的关系，我们首先构建了含有人类human-L1（hmL1）片段的表达载体pc-L1-1FH，分析其在人类Hela细I上海海洋大学硕士学位论文胞中的表达情况。通过westernblot检测和免疫荧光实验我们发现hmL1具有转录活性，并

6、且在细胞质中的表达量很高。通过对转染pc-L1-1FH和空载质粒进行转录组分析，分析出了一些差异表达基因和细胞连接相关通路。然后，我们分别利用人类和南极鱼的LINE1片段设计了一个报告系统来研究LINE1在低温下逆转座的发生机制及功能。这个报告系统在ORF2区域包含一个反向含内含子的EGFP，当L1发生逆转录时，EGFP表达。因此我们可以通过EGFP的表达来分析L1的逆转座情况。本研究中我们在Hela细胞中分别过表达dmL1和hmL1，然后将细胞放在37℃，28℃，18℃培养7天，通过RT-qPCR检测细胞中EGFP及L1表达量，结果显示

7、低温下L1mRNA的转座活性水平提高。于是我们猜想低温可以诱导L1的逆转录转座活性。另外我们注意到低温下随着L1的逆转录转座活性增强，活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的含量也显著增强，并伴随着DNA链的断裂。有研究表明活性氧ROS的产生与转座子有一定联系。为了验证低温下L1的逆转录转座与ROS的关系，我们通过向Hela细胞加入梯度增加的H2O2，检测细胞中的L1的逆转座活性。结果显示，随着H2O2量的增加，L1的mRNA表达水平升高，在0.5mM时达到最大值。我们通过加入抗氧化剂（N-acetylcystein

8、e，NAC）清除细胞内部的ROS，发现L1的逆转录转座活性降低。于是我们初步判断L1在低温下的逆转录转座是通过细胞内部ROS的释放来介导的。我们实验室前期工作中还发现低温下转染了dmL1的He