嗜热链球菌crispr多样性分析及crispr编辑载体构建

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1、硕士学位论文嗜热链球菌CRISPR多样性分析及CRISPR编辑载体构建CRISPRDIVERSITYANALYSISOFSTREPTOCOCCUSTHERMOOPHILUSANDINITIALCONSTRUCTIONOFITSCRISPREDITINGVECTOR郝梦圆哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：TS252.1学校代码：10213国际图书分类号：579.2密级：公开工程硕士学位论文嗜热链球菌CRISPR多样性分析及CRISPR编辑载体构建硕士研究生：郝梦圆导师：崔艳华教授申请学位：工程硕士学科：化学工程所在单位：化工与化学学院答辩日期：2018年6月授予学位

2、单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:TS252.1U.D.C:579.2DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringCRISPRDIVERSITYANALYSISOFSTREPTOCOCCUSTHERMOOPHILUSANDINITIALCONSTRUCTIONOFITSCRISPREDITINGVECTORCandidate：HaoMengyuanSupervisor：Prof.CuiYanhuaAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineeringSpeciality：Chemi

3、calEngineeringAffiliation：SchoolofChemistryandChemicalEngineeringDateofDefence：June，2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus，S.thermophilus）是一种兼具发酵剂应用价值和生物学研究价值的重要乳酸菌，广泛用于发酵乳的生产。CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpa

4、lindromicrepeats）基因簇是一段成簇的短间距回文非编码序列，可通过整合新的间隔子序列实现对入侵外源DNA的记忆，而Cas（CRISPR-associatedprotein）蛋白则负责辅助CRISPR的转录产物crRNA(CRISPRRNA),对外源DNA进行切割。二者协作组成了生物体的CRISPR-Cas系统，发挥抵御外源DNA侵染的作用。近年来，CRISPR编辑系统的构建成为研究的热点。本课题以嗜热链球菌为研究对象，对其CRISPR-Cas系统的分类与多样性做了较为系统和深入的研究，并进行了基于常规同源重组及CRISPR基因编辑技术的两种基因编辑载体的构建，

5、旨在揭示嗜热链球菌CRISPR-Cas系统的多样性，同时为构建嗜热链球菌的CRISPR基因编辑系统奠定基础。本研究首先对分离自中国牧区传统发酵乳的22株嗜热链球菌的CRISPRs进行了鉴定，并对其重复序列的二级结构、间隔子的分布及其序列特征进行了分析。除3-Q、CS21和CS22菌株缺乏CRISPR3外，其余菌株均含有完整的四种CRISPR类型。对CRISPR重复序列（directrepeat，DR）二级结构的预测表明，所有四种DR序列都可以形成茎环结构，但茎、环的大小不同，进而导致其二级结构的稳定性不同。间隔子的同源性分析显示，大多数间隔子来源于外源DNA的部分序列，包括

6、多种噬菌体和质粒。值得注意的是，本研究发现了大量新型间隔子，推测这些菌株经历的独特噬菌体环境，尤其是3-Q菌株。此外，对22株嗜热链球菌cas基因的系统发育分析表明，不同菌株中相同cas基因的同源性非常高。然而，不同CRISPRs中同一种cas基因的同源性相对较低，为研究菌株间的亲缘关系提供参考。其次，本研究以嗜热链球菌的三个双组分系统（twocomponentsystem,TCSs）（hpk1/rr1、hpk2/rr2及hpk5/rr5）为目的基因，设计并构建了可用于基因敲除的pRV300重组载体，拟为菌株突变体的构建奠定基础。本实验分别将目的基因的上下游片段连接于pRV

7、300空载体上，最终获得了同时连有上下游片段的重组质粒pR1D(12)、pH2D(25)、pR2D(10)及pR5D(16)；此外，构建完成了仅连有目的基因上游片段的pH1U(10)和pH5U(10)两个载体。最后，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，本研究设计并构建了可用于嗜热链球菌基因编辑的pCasSth载体。该载体含有复制原点、启动子、Cas9序列、抗性基因以及用于质粒消除的repA基因等，可在连接间隔子、靶基因上下游同源臂后用于特定基因的敲除。根据靶基因设计并合成间隔子序列后，将其连接于pCasSth，