crispr实验流程

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1、CRISPR/Cas9实验流程交流企鹅:2621697472（大家做哪块？）一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1确定待敲除基因的靶位点1.2设计识别靶位点的识别的一对DNAOligo（引物）1.3构建表达sgRNA的质粒1.4sgRNA活性检测1.5利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果

2、该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。1.2、设计识别靶位点的一对DNAOligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（http://crispr.mit.edu/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部

3、软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（ProtospacerAdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA

4、Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。1.3、构建可表达sgRNA的质粒（PrecutSgRNACloningkitandpSD-gRNAPlasmid构建试剂盒）企鹅:2621697472将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ulLB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37oC下250rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250

5、rpm培养过夜。1.4、sgRNA活性检测1.4.1sgRNA活性预检测--SSA活性检测（PrecutpSG-targetCloningkit&SSAassay检测试剂盒）企鹅:2621697472•SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可以选购我公司PrecutpSG-targetCloningkit自行构建报告载体用于检测，我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSAreporttarget质粒。•检测原理：SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRN

6、A的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase（Figure2），通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure3）。Figure2.RestoredisruptedluciferasefunctionviasgRNA-mediatedhomologousrecombinationFigure3.IncreasedFL/RLratioinCas9/sgRNAtransfectioncel

7、ls.1.4.2、CRISPR剪切活性检测--surveyorCRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor法）。Surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后