枯草芽孢杆菌J-5的鉴定及其抑菌能力的分析

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文枯草芽孢杆菌J-5的鉴定及其抑菌能力的分析论文作者：金伟伟学生类别：全日制专业学位类别：工程硕士领域名称：生物工程指导教师：宋水山职称：研究员DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiologicalEngineeringCharacterizationofBacillussubtilisJ-5andanalysisforitsabilitytoinhibitBotrytiscinereabyJinW

2、eiweiSupervisor:Prof.SongShuishanMay2017河北工业大学硕士学位论文摘要灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢菌（Botrytiscinema）引起的侵染性疾病，已成为近几年危害最大的病害之一，是我国蔬菜水果生产地的主要病害。目前还没有有效地防治方法，因此寻找出安全有效的生物防治菌株来防治灰霉病具有重要的意义。实验室前期分离了六株对灰霉菌有抑菌效果的菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5和J-6，本论文通过抑制菌丝生长速率法筛选到一株对灰霉病抑制作用最强的生防菌株J-5。通过对该菌株进行观察培养形态特征、了解其生理生化实验

3、、16SrDNA编码序列以及结合系统发育树的分析最终确定该菌株为枯草芽孢杆菌，该菌的中国微生物菌种保藏号为CGMCCNo.11750，16SrDNAGenBank登录号为KY357320。首先对菌株J-5最适培养条件和产抑菌物质的最适条件进行研究，通过改变温度、pH、装液量和培养时间确定J-5菌株的最适培养条件和最适产生抑菌物质的条件，实验结果证明培养条件与产生抑菌物质的的条件是相同的，最适温度为37℃，最适装液量为50mL，最适培养时间为24h，最适pH值为7。本研究采用抑制菌丝生长速率法对菌株J-5发酵上清液进行研究，平板实验和离体法测定结果表明该

4、上清液对番茄灰霉菌有显著的抑制作用，并且发现该菌产生的挥发性物质对灰霉菌也有显著的抑制作用。对发酵上清液的稳定性研究表明，该菌株的发酵上清液对温度（37℃-121℃）、碱（pH8-11）、蛋白酶（蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶）以及储存都有一定的耐受性，但是对酸和紫外较敏感。通过盐酸沉淀法获得了脂肽粗提物，然后通过AKTApure分离有效物质，可以确定有三种成分能够有效抑制灰霉菌。通过抗生素合成基因的检测发现该菌中含有合成iturin、fengycin、surfactin的相关基因。将J-5菌株DNA基因组进行全基因组测序，并进行比较基因组学分析，测序结

5、果如下，全基因组大小为4,117,900bp，GC含量为46.11%，预测得到的基因数为4312，在基因序列上共找到87个tRNA，27个rRNA，9个sRNA。该测序结果已提交至GenBank数据库，登录号为：CP018295。使用比较基因组学软件与NCBI中其它已测序的四株枯草芽孢杆菌进行序列分析，结果显示J-5中存在1105个特有基因。在COG数据库中有关次级代谢物生物合成的基因包括110个，其中就包括合成iturin、fengycin、surfactin的基因，并且还有一些未知基因值得我们研究。关键词：番茄灰霉病，生物防治，枯草芽孢杆菌，脂肽类

6、抗生素，全基因组测序I河北工业大学硕士学位论文ABSTRACTGraymoldisthemostharmfulanddifficultcontroldiseasewhichcausedbyBotrytiscinereaandinfectedmanykindsoffruitsandvegetablesinChina.Soitisimportanttofindsafeandeffectivebiologicalcontrolstrainstocontrolthedisease.Inthisstudy,sixbacteriawithinhibitoryeff

7、ectonBotrytiscinereawereisolated.TheJ-5strainhadthehighestinhibitionratetothemycelialgrowthofBotrytiscinerea.ThestrainJ-5wereidentifiedasBotrytiscinereabytheanalysisofmorphologicalandphysiologicalandbiochemicalpropertiesand16SrDNAcodingsequence.thestrainhasCGMCCNo.11750,theGenBa

8、nknumberKY357320.Theoptimumcultureconditionsand