bvdv荧光rt-pcr检测方法的建立和初步应用

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1、吉林农业大学硕士学位论文BVDV荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用姓名：李天松申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：胡桂学20050601独创性声明本人声明所早变的学位论文足木人稚：导帅指导下进行的研究工作及取榴的研究成果。据我所知，除了文r1I特别JJlI以标眭幂I敛谢的地疗外，论文·{t小包含其他人已经发丧或撰写过的研究成果，屹不包禽为捩待占稀农业大学或其他教育机构的学位iit!*而使用过的材料。与我同：r一作的同志对本研究所做的任何贡献均已往论文中作了够I确的说{删并表示谢意。学位论赚档名j姗签字日驯：‘如勺}年步_≯珀学位论文版权使用授权书本学位论文作督完全，解吉林农业大

2、学有关保留、僮j：{1f学位论文的规定，即吉林农、世大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权吉林农、世入学可以精学位论文的全都或部分内铎编入有关数掘库进行检索，可以采用影印、缩印或扣掘等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文盘解密后适用本授权牛5)学位沦文储签现稚锄签名签字日期：>国考筇6月≯阻签字口期学位论文作者毕业后去向：嗣之叠钦工觯位：忒啤天酗啦终、I乜证邮编石月啵I蓐难怵嵫吉林农业大学硕士学位论文BVDV时实定量荧光RT--PCR检测方法的建立和韧步应用摘要牛病毒·l生腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，B

3、VDV)是黄病毒科、瘟病毒属成员，病毒粒子呈球形，有囊膜，核酸为长约12～13kb的单股正链RNA，根据能否使培养细胞产生细胞病变将其分为两种生物型：产细胞病变型和非细胞病变型．BVDV主要侵害牛、鹿和猪等动物，引起以肠道疾病、繁殖障碍、呼吸系统疾病、胎儿畸形和持续性感染。BVDV的基因组包含5’一非编码区(5’-NTR)、编码一个大的聚合蛋白的开放阅读框架和3，-非编码区(3’-NTR)。研究表明5’-NTR能形成稳定的二级结构，具有核糖体进入位点，是BVDV的翻译和复制的调控元件。由于BVDV5，_NTR的序列高度保守，所以常根据这一区域设计引物，进行BVDV的检测。目前BVDV的检测方

4、法有病原分离、中和试验、直接荧光抗体试验、ELISA及核酸杂交技术、RT-PCR等多种方法，但血清学方法多存在费时、费力、准确率低等缺点，而分子生物学的常规方法虽然在某些方面可以弥补，但假阳性、环境污染、重复性不高等不足限制了推广应用，随着分子生物学的发展，实时定量荧光RT-PCR技术日益成熟，尤其是外标实时定量荧光PCR被认为是迄今为止最准确、重复性最好的定量方法，广泛应用于基因表达、病原体检测等诸多领域．因此为适应进出口检疲的要求建立一种快速、灵敏、特异、重复性良好的检测方法势在硌行。试验中应用MDBK细胞培养牛病毒性腹泻病毒标准株OregonC24V，72小时出现细胞病变(CPE)：细

5、胞变圆、细胞核固缩到边缘、胞浆内出现大量空泡、脱落．在长有单层细胞的96孔细胞培养板上依次加入10倍稀释的OregonC24V0．1mL，记录病变孔数及其出现的稀释倍数，根据Re庀xi-Mueneh法计算培养的OregonC24VTCIDs0；1013．以NADL、NewYork-1、Singer(Ia)、OregonC24V(Ib)、Draper(Ib)等参考BVDV毒株5’端非编码区为参考序列，设计合成了实时定量荧光RT-PCR引物和TaqMan荧光探针，设计目的片段大小94bp，TaqMan荧光探针5’端报告荧光为TAM，3’端淬灭荧光为TAMAR。初步设计反应参数后体系参数优化结果为

6、：25mMM矿5uL、5U／¨LTaq酶0．5¨L、20“M引物混合物1“L与20pM探针l，5uL，退火延伸温度为60E。进一步进行灵敏性、重复性、特异性试验，结果本方法最低可检测到0．1TCID50；特异性试验中，BVDV阴、阳性对照成立，检测猪瘟病毒、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒吉林农业大学硕士学位论文BVDV时实定量荧光RT--PCR检测方法的建立和初步应用为阴性。重复性试验鲒果曲线重合性良好。用建立的方法检测四平迭龙犊牛肛门拭子样品30份、辽源金昌成年牛拭于样品10、吉林万隆成年牛拭子样品15份、兴隆山苗苗奶牛场犊牛拭子样品20份、吉林农业大学奶牛场拭子样品25份，检测时每组样

7、品设立阴性、阳性对照。结果阳性，阴性对照成立，被检样品中成年牛10份，犊牛25份样品呈阳性结果，犊牛阳性率高于成年牛15％。检测死亡腹泻犊牛肠及内容物病料1份，结果阳性。通过试验证实，本试验建立的实时定量荧光RT—PCR方法是一种特异性强，敏感性高，快速安全的检测方法，可以用于BVDV的快速检测．关键词：牛病毒性腹泻；荧光RT-PCR；初步应用吉林农业大学硕士学位论文BVDV时实定量莞光RT--PCR植测方法