染色体步移技术研究进展

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1、万方数据·技术与方法·生物技术通报B10TECHNOLOGYBULLETIN2009年第10期染色体步移技术研究进展梁成真张锐郭三堆(中周农业科学院生物技术研究所国家农作物基因资源与基因改良重大科学3-程，北京100081)摘要：染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。综述了近年来染色体步移技术的发展情况，介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和基于PCR的染色体步移技术。同时总结了物理剪切法和限制性内切酶法构建亚克隆文库的优化步骤。以及连接成环PCR法、外源接头介导PCR法和半随机引物PCR法的原理，并

2、且比较分析了他们之间的优缺点。以期对实际操作起到借鉴作用。关键词：染色体步移侧翼序列BAC克隆反向PCR外源接头介导PCR半随机引物PCRProgressofChromosomeWalkingLiangChengzhenZhangRuiGuoSandui(BiotechnologyResearchInstitute，ChineseAcademy矿AgriculturalSciences，NationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovemem，Be讲ng1

3、00081)Abstract：Chromosomewalkingtechniquesarecommonlyusedforcloningtheknownflankingsequence．Inthisreview，chromo—somewalkingtechnologiesareintroducedinthisyears，includedgenomiclibrarytechniquesforchromosomewalkingtechnologyandthePCRamplificationtechniquesforchro

4、mosomewalking．Atthesametime，weestablishtheconstructionsystemofBACshotgunlibrary，agwellastheprinciplesoforbicular-ligationPCR。adapter·mediatedPCRandsemi·randomprimerPCR．Afteranalyzingtheadvantagesanddisadvantagesofthesedifferentstrategiesortechniquesinthesamestr

5、ategies，wediscussedtheapplicationfieldanddevelopmentprospectofcorrespondedtechniques．Keywords：ChromosomewalkingFlankingsequenceBACcloneI-PCRAdapter-mediatedPCRSemi-randomprimerPCR染色体步移(chromosomewalking)是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法⋯。对于

6、已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可以从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止，自然界中绝大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能进行染色体步移。因此，染色体步移技术在现代分子生物学研究中占有举足轻重的地位和重要的现实意义。染色体步移技术主要有以下5个方面的应用：(1)鉴定T—DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点；(2)根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件；(

7、3)用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接；(4)构建图位克隆中的重叠群；(5)转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等。目前，分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种，一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术，构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐，但是适于长距离步移，可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步，这种方法也将更加快捷，准确。另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移

8、距离相对较短，但是操作比较简单，尤其适合于已知一段收稿日期：2009-05-07基金项目：农业部国家转基因重大专项“转基因抗旱耐盐碱棉花新品种培育”(2008ZX005—004)作者简介：梁成真(1983-)，硕士研究生，研究方向为植物基因工程；Tel：010—82106128，E—mail：lian91983tian@163．corn通讯作者