实验一、染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列_final

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1、现代微生物学实验技术马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:myc0307@gmail.com实验内容♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣转座子随机突变及目的表型的筛选♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取用户名：xdwswsy@126.com密码：112233445566染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列—TAIL-PCR牛伯庆许梦秋实验目的掌握TAIL-PCR的原理，增强对PCR重要性的认识；掌握TAIL-PCR的实验流程，为将来课题研究奠定

2、基础。ahotarbitrarydegenerateprimers:AD1：5´-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3´；AD2：5´-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3´；AD3：5´-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3´；AD4：5´-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3´。TAIL-PCR的原理sp1sp2sp3已知序列未知序列特异引物序列：sp1:TGGAGAACTTGTAACCCTTGGTGsp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGTsp3:CGAGCAGATGGTTCTTG

3、GTAIL-PCR:ThermalasymmetricinterlacedPCRLiuetal.,1994TAIL-PCR的原理实例：微生物法生产丙烯酰胺最简单和最重要的酰胺化合物丙烯酰胺聚丙烯酰胺：百业助剂采油水处理造纸其它微生物法生产丙烯酰胺氮代谢网络PseudomonasBacillusRhodococcusNHaseNitrileHydratase(NHase)课题背景-腈水合酶代谢酶系研究进展腈水合酶代谢酶系研究进展RhodococcusrhodniiDSM43336T(X80621)RhodococcuscorynebacterioidesDSM20151T

4、(X80615)RhodococcusrhodochrousDSM43241T(X79288)RhodococcusgordoniaeDSM44689T(AY233201)RhodococcusterraeDSM43249T(X53202)RhodococcusgloberulusDSM43953T(X80620)RhodococcuscoprophilusDSM43347T(X80626)RhodococcusroseusATCC271T(X81921)RhodococcuspyridinivoransDSM44555T(AF173005)Rhodococcusphe

5、nolicusDSM44812T(AM933579)RhodococcuszopfiiATCC51349T(X81934)RhodococcusruberstrainTHRhodococcusruberDSM43338T(X80625)RhodococcusaurantiacusDSM20162T(X80628)RhodococcusobuensisDSM43896T(X80634)RhodococcusbronchialisDSM43247T(X79287)RhodococcuskyotonensisJCM23211T(AB269261)Rhodococcusfasc

6、iansATCC12974T(X81930)RhodococcuserythropolisATCC19566T(NSU82667)RhodococcusqingshengiiKCTC19205T(DQ090961)1008499781007984100561001001005282991000.1RhodococcuschlorophenolicusDSM43826T(X79292)NocardiaasteroidesATCC19247T(DQ659898)微生物法生产丙烯酰胺的菌株鉴定Neighbour-joiningtreeshowingthephylogeneti

7、cpositionofR.ruberstrainTHwithrespecttoRhodococcusspeciesbasedon16SrDNAgenesequence.Nocardiaasteroideswasusedasanoutgroup.Numbersatbranchingpointsrepresentbootstrapvaluesfrom1000replicates,andthecutoffwas50%.Bar,0.1substitutionspernucleotideposition.Scanningelectronmicrog