小鼠干扰素-γ基因克隆及其腺病毒载体的构建

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1、四川大学学‘医学版2o1oJSichuanUniv，MedSciEdi)。。’‘’；，4’l‘(一3)：●394。—3。97小鼠干扰素一丫基因克隆及其腺病毒载体的构建薛红利，蔺诗佳，何东，孟文彤，牛挺△1．四川大学华西医院血液科血液病研究室(成都610041)；2．四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞生物学研究室(成都610041)【摘要】目的构建含有小鼠干扰素一T(mlFN-7)基因的腺病毒载体，为探索IF7在肝纤维化治疗中的作用研究奠定基础。方法从含有mJFN_基因的质粒载体pORF5一mlFN-y中PCR扩增出mjFy基因片段，双酶切将该基因克隆人穿梭载体pAdTrac

2、k—CMV中，限制性内切酶PineI线性化pAdTrack-CMV-mlFN-7。转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌株BJ5183细胞，同源重组。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-mlFN-y，内切酶PacI线性化重组子，用磷酸钙法转染细胞株AD-293进行包装，收集病毒进行鉴定。结果PCR后测序获得m“N_基因，全长468bp，与GenBank中发表的mlFN-7基因核苷酸序列完全一致。经酶切和PCR证实各中问过程载体均含有目的基因。包装的病毒Ad-mJFN-y在转染的4～6d观察到荧光产生，8～IId荧光逐渐增加，12d收集病毒液。蛋白酶K裂解重组腺病毒，经PCR

3、和Westernblot方法鉴定，证实携带有目的基因mlFy。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的基因的腺病毒载体pAd-mIFN-7，重组子能够在AD-293细胞中进行包装和扩增，病毒包装的成功为进一步研究优JFN_y基因治疗小鼠肝纤维化提供了一个良好的转导载体。【关键词】mlFN-7基因腺病毒载体重组【中图分类号】Q78GeneCloningofmIFandConstructionofRecombinantAdenovirusXUEHong—liL，LINShi-jial，HEDongL。MENGWen—tong，NIUTing．1．DepartmentofH

4、ematology&ResearchLabofHematology。肌ChinaHospital，SichuanUniversity．Cbengdu610041．China；2．LaboratoryStemCellBiology，StateKeLaboratoryofBiotherapy，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China△Correspondingauthor，E-mail：tingniu@sina．com[Abstract]ObjectiveTodeveloparapidandefficientmetho

5、dforpreparingrecombinantadenoviruscontainingmoHselF卜(mlFN-r)genebyhomologousrecombinationinE．coli．inordertobuildatoundationforresearchintogenetherapyofliverfibrosis．MethodsThetargetgenemFN·ywasamplifiedbyusingPCRfromthevectorpORF5一mIFN—y．Onceverified，itwascutoutbydoubleendonucleases，thenconnect

6、edtotheshuttlevectorpAdTrack—CMV．ThenewlyconstructedvectorwaslinearizedbyPineIfollowingtransformationtotheEcoli．BJ5183，whichcontainedthebackbonevectorpAdEasy-1．ThecorrectrecombinantpAd-mIFN-7wasselectedbyendonucleasesandbyKanamycinresistance．Againitwas1inearizedwithPacI，thentransfectedtoAI)_293

7、celIsbymeansofCalciumPhosphatemethod．Finally，thetargetgenemJFⅣ一ywasidentifiedbyPCRandWesternblotmethods．ResultsThetargetgenenN。yamplifiedbyPCRwasidentifiedbyDNAsequencing，whichprovedthatthemIFN-geneconsistedof468nucleotidesandwasc