组织因子在人胚胎干细胞诱导分化过程中表达及调控的研究

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1、万方数据中图分类号UDCR孓r610博士学位论文学校代码10553组织因子在人胚胎千细胞诱导分化过程中表达及调控的研究TheexpressionandregulationofTissueFactor(TF)duringhumanemblVOnicstemceUdif氨erentiationdUrlngnUmanemDlyOnlCStemCe儿nlIIerenIlaⅡ0n作者姓名：俞妍慧学科专业：临床医学研究方向：血栓与止血学院(系、所)：湘雅医院指导教师：陈方平教授论文答辩日期垄!!：!!：兰；答辩委员会主席兰生!丛中南

2、大学二0一三年十一月万方数据原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：么社曰期：盟年卫月与日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；

3、学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：罅导师签名鹇魄迎年卫月与日万方数据本课题基金资助>国家自然科学基金(项目批准号：81170477)>中央高校基本科研业务费(项目批准号：2011QNzTl51)>教育部博士点基金(项目批准号：201101621200lo)万方数据博士学位论文中文摘要组织因子在人胚胎干细胞诱导分化过程中表达及调控的研究摘要在机体的发育过程中，

4、基因的表达受到精确的调控。这种调控使基因按照机体发育的需要，表达呈现出特异的时间和空间特异性。近年来基因与蛋白的特异性表达已经成为发育生物学中的研究热点。组织因子(Tissuef．actor’TF)，又称为凝血因子III、CDl42，是由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，在体内广泛表达，其在许多重要的生理及病理情况下，特别是维持机体凝血平衡和保护重要脏器方面具有重要作用。血栓与止血平衡是发育过程中最重要的稳态之一。在血细胞形成之前，由滋养层细胞(Trophoblast)表达的大量TF使胚胎稳定，在防止流产和妊娠大出

5、血方面有重要意义。在血细胞形成后，TF在不同的血细胞中表达水平不同，其具体调控机制目前尚未明确。人胚胎干细胞(hlIllanemb巧onicstemcells，11ESCs)由于其维持自我干细胞特性及多向分化潜能的特性，成为我们研究基因时间和空间特异性表达的良好模型。miRNA是一类约17．24个碱基的非编码单链小分子IⅢA。现在已知miRNAs这些微小的砌叮As控制着许多重要的生理或病理过程。而Akt和Erkl／2在包括发育、细胞增殖和肿瘤发生发展等过程中起重要作用。在本实验中我们以人类胚胎干细胞为体外模型，分化成造血

6、细胞及滋养层细胞，检测不同分化阶段细胞中TF的表达水平的变化。并lIl万方数据博士学位论文中文摘要进一步探讨在分化过程中，miI州A及Erkl／2对TF表达的调控。本研究分为以下三个部分：第一部分组织因子在人胚胎干细胞分化过程中的表达变化目的建立有效的人胚胎干细胞向造血细胞及滋养层细胞诱导分化体系，为后续实验提供可靠地细胞标本。检测分化过程中不同阶段TF的表达水平。方法①将人胚胎干细胞(艟SCs)诱导分化出造血干／祖细胞(hematopoieticstem／progenitorcells，HSPCs)及滋养层细胞；②将造

7、血干／祖细胞分化为粒．单细胞及红细胞；③流式细胞学检测造血细胞特异性标记，肌PCR检测滋养层细胞特异性标记；④磁珠分选CD34+，或CDl4+，或CDl5+细胞，检测TF(CDl42)表达水平；⑤qPCR，R1乙PCR及WeStemblot检测TF的mRNA及蛋白水平的表达。结果①人胚胎干细胞(11ESCs)与小鼠骨髓基质细胞(0P9)共培养第8天，流式细胞学检测CD34+细胞比例达到17．2％，磁珠分选后，流式细胞学检测TF表达为阴性；②添加不同细胞因子组合诱导粒．单细胞及红细胞，磁珠分选后检测TF表达，发现粒．单细胞

8、TF表达呈阳性，红细胞TF表达呈阴性；③RT-PCR检测BMP4方法诱导分化第0天、第2天、第5天的滋养层细胞，培养第0天可见OCT-4、Nanog表达；培养第5天可见滋养层特异性基因CDx2表达，TF表达：④粒．单细胞和滋养层细胞TF的m砌蛆和蛋白水平有表达，而人胚胎干细胞、造血干／祖细胞、红细胞TF不表达。结论我