对纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化探究研究

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1、对纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化探究研究【摘要】目的：总结对纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化的研究分析。方法：采用纹状体组织块与胚胎干细胞联合培养的方法，以基础培养基作为对照组；以基础培养基+人胚胎纹状体组织块作为实验组。在分化的第1、4、7、lid分别取出细胞爬片，经酪氨酸軽化酶免疫细胞化学染色后对分化细胞进行鉴定。结果：酪氨酸務化酶免疫细胞化学染色细胞阳性率，对照组为0.54%,实验组为7.48%,两组比较有统计学意义(P〈0.05)。结论：纹状体组织块能够很好的诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元方向分

2、化。【关键词】纹状体组织块；诱导；胚胎干细胞；定向分化【中图分类号】R321-3【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2012)08-0072-02胚胎干细胞是早期胚胎或原始性腺种分离出来的一种未分化的、具有多向分化潜能的细胞[1],它具有体外培养无限增殖、自我更新的特性，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的

3、向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。而近期国内一些学者也已成功从人胚胎海马组织中提取并培养出神经干细胞，为进一步的干细胞分化移植研究积累了宝贵的经验［2］。本文采用纹状体组织块与胚胎干细胞联合培养的方法，探索如何高效诱导胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元，取得了满意效果，现报告如下：1材料和方法1.1一般材料1.1.1主要试剂与仪器：Neuralbasal即用型神经细胞液体培养基（美国生命技术公司，批号F15971）；高糖、F12（Gibco公司，批号1459011）；B.疏基乙醇（Sigma公司，

4、批号05558311）；胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所，批号AB3101C190）；小牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；丝裂霉素C（浙江海正，批号050812）重组人表皮生长因子（EGF,英国Peprotech公司）；白血病抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor,LIF）（Sigma公司，批号064K1133）；酪氨酸務化酶（tyrosinehydroxylase,TH）单克隆抗体（SantaCruz公司）；人胚胎纹状体组织块（自备）。C02培养箱（美国SIM公司，E191TC

5、）；倒置显微镜（日本0lympus公司，CKX42）o1.1.2早期胚胎的收集与培养：分别取孕3.5、4.5d的母鼠，断颈处死，在无菌条件下取出子宫；用ImL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔；每侧子宫注入冲胚液0.2—0.5mL,冲胚液会将胚胎冲出；将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40-100倍的倒置显微镜下；用移液器(上海大龙公司，0.2—10uL,YR23777)收集胚胎；最后以文献[3]所示方法进行培养。1.1.3饲养层的制备：雌雄鼠合笼，于每天早上观察阴道

6、栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天；取孕12.5-14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成lmm3以下的碎块，用向培养基中加入10g/ml的丝裂霉素C,作用2-3h,充分洗涤后，接种在涂有0.1%明胶的四孔板中。1.1.4ES细胞的分离培养：无菌条件下分离孕14d的昆明小鼠鼠中脑腹侧脑组织，加入0.25%胰蛋白酶室温消化20min,离心弃上清后加入含B27(20mg/mL)、EGF(20ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、lOOu/mL青霉素和

7、100u/mL链霉素的DMEM/F12(1：1)无血清培养液，玻璃吸管轻柔吹打分散细胞，100目滤网过滤制成单细胞悬液。台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞浓度为5X105个/mL,接种入25mL培养瓶内，每瓶量约5mL。培养瓶置入C02：恒温培养箱(5%C02、95%02、37°C)内培养。每3、4天半量换液1次，培养7—10d后，选生长旺盛的ES细胞集落消化成单细胞悬液。1.1.5纹状体组织块的制备：在解剖镜下取新生昆明小鼠的纹状体，于无Ca2+、Mg2+Hanks液中反复冲洗去除血污，剥净脑膜后，切成0.5m

8、m长、0.5rnin宽、0.5mm高的组织块备用。1.2培养方法：实验组：基础培养基+人胚胎纹状体组织提取液(50ml/L)o分化的第1、4、7、lid取出细胞爬片进行抗TH免疫细胞化学染色。对照组只加入基础培养基,不加纹状体组织块，其他条件相同。每组3皿，重复3次实验。1.3统计学处理：采用x2检验的精确概率检验法。2结果TH免疫细胞化学染色组别阳性率实验组7.48%对照组0.54%【注】两组比较