tlr4乙酰化%2f甲基化修饰激活对炎症免疫调节

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1、浙江大学博士学位论文中文摘要TLR4乙酰化／甲基化修饰激活对炎症免疫的调节浙江大学医学院病理学与病理生理学博士研究生王居平导师邵吉民秦樾摘要ToH样受体4(ToULike№印tor4，TLR4)在巨噬细胞的抗感染(特别是抗病毒)过程中发挥重要作用。TuM可与配体革兰阴性菌的脂多糖(Lipopolysacch撕de，LPs)结合，并与MD2、CDl4两个分子形成MD2厂ruH／CDl4复合体而活化。活化的TLR4激活两条经典的信号转导通路：一条是MyD88依赖性信号转导路径，主要接头蛋白为MAL(TI】队P)和MyD88，T

2、LR4通过招募Mal(TIRAP)／Myd88，激活一系列蛋白酸磷酸化激酶(如嗽l、Iloq，IK№，IKKp)、导致转录因子NF．心激活并入核而启动炎症因子基因表达．这些炎症因子如白介素6(Interleukin6，IL6)、ILl2、ILl7、肿瘤坏死因子a(n吼ornecrosisfactora，TNF仅)的表达释放参与巨噬细胞的炎症免疫反应。另一条是MyD88非依赖性信号转导途径，其主要接头蛋白为TRAM和TRIF．TLR4通过招募TRAM佻IF，激活另一些蛋白酸磷化激酶(如TBKl、删IⅪ陋)、导致转录因子干扰素

3、调节因子3(IFN．regulated南咖r3，IRF3)激活并入核，来诱导包括干扰素p(Int枷nbeta，IFNp)的转录，最终引起免疫反应．丝氨酸磷酸化被认为在TLIH的信号通路(尤其在两条通路的中下游)的激活，起到了至关重要的作用．然而至今为止，TLR4和TLR4的接头蛋白是如何被激活的，却毫无所知．最近，本实验室率先报道的蛋白乙酰化参与I型干扰素受体信号转导(Ref)为TLIH上游信号转导通路得激活提供了极为重要的线索。本论文研究证实了乙酰化和甲基化修饰对LPS引起的TLIM信号通路的激活，细胞因子合成释放以及巨

4、噬细胞的炎症免疫调控功能具有重大的生物学意义。nI浙江大学博士学位论文中文摘要(_)TLR4乙酰化修饰在LPs活化的炎症信号转导中的作用l、LPs刺激巨噬细胞系Raw264．7细胞后，利用泛乙酰化抗体进行免疫印迹检测发现TLR4可发生乙酰化修饰。免疫荧光法和免疫共沉淀法证实LPS刺激可促进cBP出核并与TLR4相互作用；抑制内源cBP表达后，TLR4乙酰化显著降低，表明cBP介导TLIH的乙酰化修饰。为探索TuH乙酰化修饰位点，我们构建了两个突变体即第732位和第813赖氨酸(K)分别突变为精氨酸(R)(K732R，K81

5、3R)，并与cBP共表达后检测乙酰化程度。结果表明，与野生型TLR4相比，两个突变体的乙酰化程度显著降低。质谱法检测到TLR4第813位K发生乙酰化修饰．此外，我们分别制备了K732和K813乙酰化修饰的特异性抗体，发现LPS刺激后TLR4的K732和K813乙酰化显著升高。以上结果表明，LPS刺激可促进CBP介导的TLIH第732位和第813位赖氨酸的乙酰化修饰。2、应用免疫共沉淀法分析TLR4及其两个突变体K732R和K813R与TRAM、TRIF和MvD88三个接头蛋白的相互作用，结果表明，K732R突变阻断了TLR

6、4与TRJF和MvD88的相互作用，而K813R突变阻断了TLR4与TRAM的相互作用。报告基因技术分析显示CBP过表达后，TLR4乙酰化程度增强，导致NF．1cB和Ⅱ江3反应元件活性增加。相反，K732R和K813R突变均可降低IRF3反应元件的活性，而K732R突变则还可以使NF．1(B反应元件活性降低。在TLlH．／-小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BoneMa玎0w．D甜vedMacrophage，BMDM)中，应用半定量l订．PCR的方法分析了乙酰化对TLR4两条不同通路终产物的影响，结果显示，K732R和K813R突变

7、可分别抑制IFN9的合成释放，而K732R突变还可抑制IL6合成释放。以上结果表明TuM第732位和第813位赖氨酸的乙酰化分别调控下游不同的信号通路。3、LPs刺激巨噬细胞系Raw264．7细胞，利用泛乙酰化抗体进行免疫印迹检测发现II心3可发生乙酰化修饰。抑制内源CBP表达后，瓜F3乙酰化显著降低，表明CBP介导瓜F3的乙酰化修饰。为探索IRF3乙酰化修饰位点，我们用质谱法检测到取F3第77位的K发生乙酰化修饰。在此基础上，我们构建了突变体K77R，浙江大学博士学位论文中文摘要并与cBP共表达后检测乙酰化程度。结果表明

8、，与野生型IRF3相比，突变体的乙酰化程度显著降低。免疫印记法分析表明，加入去乙酰化酶6(HistoneDeacetyl鹬e6，HDAC6)后，CBP／P300介导的Ⅱ江3的乙酰化程度显著下降，表明HDAC6介导IRF3的去乙酰化。免疫共沉淀法结果显示K77R突变阻断了IRF3二聚体的形成，而去乙酰化酶