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《SUMO修饰调控组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化的分子机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
2018届研究生博士学位论文分类号学校代码：10269密级学号：52131300048EastChinaNormalUniversity博士学位论文DOCTORALDISSERTATIONSUMO修饰调控组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化的分子机制研究院系：生命科学学院专业：生物化学与分子生物学研究方向：表观遗传学指导教师：翁杰敏教授论文作者：王志强2018年3月 Dissertationfordoctoraldegreein2018Universitycode:10269StudentID:52131300048EastChinaNormalUniversityTheroleofSUMOmodificationincontrolofHistoneAcetylationandHistonemethylationDepartment:SchoolofLifeScienceMajor:BiochemistryandMolecularBiologyResearchdirection:EpigeneticsSupervisor:Prof.JieminWongCandidate:ZhiqiangWangMarch,2018 华东师范大学博士学位论文 华东师范大学博士学位论文王志强博士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称单位备注王纲研究员中国科学院生物化学与细胞生物学研究所主席于明研究员上海交通大学余健秀研究员上海交通大学蓝斐研究员复旦大学李晓涛教授华东师范大学 华东师范大学博士学位论文摘要SUMO修饰是一种保守的蛋白质翻译后修饰，可通过改变底物蛋白的构象、结合、定位或稳定性,参与调控细胞周期、基因转录、染色质重塑、干细胞干性维持及分化、DNA损伤修复及核糖体生物合成等。既往研究表明，SUMO修饰与转录抑制密切相关。组蛋白的翻译后修饰，特别是组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化，被认为是调控转录的一大因素。因此，我们研究重点是SUMO修饰与组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化之间的交互调控作用。我们前期的研究表明，PIASxβ特异性介导的HDAC1/2SUMO修饰增强其组蛋白去乙酰酶活性，导致组蛋白乙酰化水平降低。我们进一步通过ChIP-Seq证实SUMO修饰促进HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性，同时RNA-Seq表明HDAC1/2SUMO化抑制细胞整体转录。根据文献报道，我们构建了HDAC1/2SUMO修饰位点突变体（HDAC1K444R/K476R、HDAC2K462R）。该突变使HDAC1/2的SUMO修饰水平显著降低，不改变其亚细胞定位，但降低其蛋白稳定性。同时，HDAC1/2SUMO修饰突变体不影响含HDAC1/2复合体的形成。此外，HDAC1/2SUMO修饰突变体在染色质上的富集显著减少。由此表明，SUMO修饰一方面增加了HDAC1/2的蛋白稳定性，另一方面促进了其在染色质上的富集，增加了其与底物的结合，从而增加其去乙酰化酶活性。已有研究报道SENP1可以去除HDAC1的SUMO修饰，但并未证实SENP1去除HDAC1SUMO修饰后是否影响其组蛋白去乙酰化酶活性。外源过表达SENPs（SENP1-7），发现SENP6能显著增加组蛋白乙酰化水平，且SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖其去SUMO酶活性。进一步的研究发现，SENP6能特异性去除HDAC1/2的SUMO修饰，且导致HDAC1/2蛋白稳定性降低，在染色质上的富集减少。此外，我们通过细胞增殖实验发现，在293T细胞中外源过表达SENP6，细胞增殖受到抑制。这提示我们，SENP6可能通过调控HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性参与肿瘤的发生、发展的过程。总之，我们的研究为SUMO修饰调控组蛋白乙酰化提供了一种新见解。I 华东师范大学博士学位论文既往研究发现，许多组蛋白甲基转移酶（HMTs)和组蛋白去甲基转移酶（HDMs）是SUMO修饰的底物，但SUMO修饰是否调控组蛋白甲基化水平的研究尚不十分明确。因此，我们探究SUMO修饰能否通过影响HMTs或HDMs调控组蛋白甲基化。通过外源过表达SUMO-1蛋白及SUMO修饰的唯一E2结合酶UBC9,Westernblot检测组蛋白甲基化水平（H3K4、H3K9、H3K27和H3K36）。研究发现,过表达SUMO-1和UBC9能够特异性升高H3K4me3水平，敲低UBC9能特异性降低H3K4me3水平。进一步的研究发现，H3K4me3甲基转移酶MLL/SET1复合体的共同亚基WDR5能够发生SUMO修饰。SUMO修饰整体水平的改变不影响WDR5的转录水平，WDR5的SUMO化促进其蛋白稳定性。该研究仍需许多后续工作，但也表明，SUMO修饰可能通过对靶蛋白稳定性的调控，从而影响组蛋白甲基化。关键词：SUMO修饰；HDAC1/2；SENP6；WDR5；组蛋白乙酰化；组蛋白甲基化II 华东师范大学博士学位论文AbstractSUMOmodificationisoneoftheconservedproteinpost-translationalmodificationsandplaysakeyroleinmanybiologicalprocesses,includingcellcycle,transcriptionalregulation,chromatinremodeling,stemcellpluripotencyanddifferentiation,DNArepairandribosomalbiosynthesis.Sumoylationmayalterstheconformation,binding,localizationorstabilityofthesubstrateproteins.Previousstudieshaveshownastrikingcorrelationbetweensumoylationandtranscriptionrepression.Thepost-translationalmodificationsofhistone,especiallyhistoneacetylationandhistonemethylation,arethoughttobeamajorfactorinregulatingtranscription.Ourstudyfocusesonthecross-talkbetweenSUMOmodificationandhistoneacetylationandhistonemethylation.OurpreviousstudiesshowedthatPIASxβ-mediatedHDAC1/2sumoylationdramaticallyenhanceditshistonedeacetylaseactivity,resultinginitsdecreasedhistoneacetylation.WefurtherconfirmedbyChIP-SeqthatSUMOmodificationpromotesHDAC1/2histonedeacetylaseactivity.RNA-SeqresultsalsoshowedthatsumoylationofHDAC1/2repressedtranscription.Accordingtothepreviousreports,weconstructedsumoylationdeficientmutantsofHDAC1/2(HDAC1K444R/K476R,HDAC2K462R).SumoylationmutantsofHDAC1/2didnotchangetheirsubcellularlocalizationandtheformationofHDAC1/2containingcomplexes.However,theHDAC1/2-sumoylationmutantsexhibitedadecreasedproteinstabilityandreducedbindingofchromatin,thusleadingtoimpairedhistonedeacetylaseactivity.ItwasreportedthatHDAC1canbedeSUMOylatedinvivobySENP1.However,itisnotclearthatwhichSENPaffectshistonedeacetylaseactivityofHDAC1/2invivo.Throughexogenousover-expressionofallSENPs(SENP1-7),wefoundthatSENP6butnototherSENPscansignificantlyincreasethecellularlevelofhistoneacetylation.TheeffectonhistoneacetylationisdependentondesumoylationactivityofSENP6.III 华东师范大学博士学位论文Moreover,HDAC1andHDAC2canbedeSUMOylatedbySENP6.SENP6notonlydecreasestheproteinstabilityofHDAC1/2butalsoinhibitsitsbindingtochromatin.Inaddition,SENP6inhibitedtheproliferationof293Tcells.OurstudyrevealsakeyroleofSENP6inregulationofHDAC1/2histonedeacetylaseactivityandprovidesanewinsightintocross-talkbetweenSUMOylationandhistoneacetylation.Massspectrometryresultsrevealedthatmanyhistonemethyltransferases(HMTs)andhistonedemethylase(HDMs)aresubstratesofsumoylation.Currently,howSUMOmodificationregulateshistonemethylationisnotyetclear.WefoundthatexpressionofUBC9andSUMO-1specificallyincreasedthelevelofH3K4me3.WhileknockingdownofUBC9specificallyinhibitedH3K4me3.WefurthershowedthatWDR5,acommonsubunitoftheH3K4me3methyltransferaseMLL/SET1complexes,wasasumoylationsubstrate.ThecellularSumoylationleveldidnotaffectWDR5’stranscriptionallevelbutinhibititsdegradation.Thedetailedmechanismneedstotobefurtherstudied.However,currentresultssuggestthatSUMOmodificationmayaffecthistonemethylationthroughproteinstabilityregulation.Keywords:Sumoylation;HDAC1/2;SENP6;WDR5;Histoneacetylation;HistonemethylationIV 华东师范大学博士学位论文目录摘要.........................................................................................................IAbstract.....................................................................................................III第一章文献综述......................................................................................11.1表观遗传学简介................................................................................................11.2蛋白质翻译后修饰............................................................................................41.2.1组蛋白翻译后修饰....................................................................................41.2.2非组蛋白翻译后修饰................................................................................51.3SUMO修饰........................................................................................................61.3.1SUMO蛋白.................................................................................................61.3.2SUMO修饰通路.........................................................................................71.3.3SUMO修饰基序.........................................................................................81.3.4SUMO修饰酶系.........................................................................................81.3.5去SUMO化蛋白酶.................................................................................111.3.6SUMO修饰去除蛋白家族SENPs和基因表达调控.............................121.4SUMO修饰与染色质......................................................................................141.4.1SUMO富集于染色质...............................................................................141.4.2SUMO修饰与组蛋白...............................................................................151.5SUMO修饰与组蛋白乙酰化..........................................................................171.6SUMO与组蛋白甲基化..................................................................................221.7SUMO修饰介导的生物学功能......................................................................261.7.1SUMO修饰与细胞周期调控...................................................................261.7.2SUMO修饰与DNA损伤修复................................................................261.7.3SUMO修饰与染色质重塑.......................................................................261.7.4SUMO修饰与转录调控...........................................................................271.7.5SUMO修饰与泛素生物学功能相关性...................................................281.8SUMO修饰与疾病的相关性..........................................................................281.8.1SUMO修饰与肿瘤...................................................................................281.8.2SUMO修饰与心脏疾病...........................................................................291.8.3SUMO修饰与神经退行性疾病...............................................................301.8.4SUMO修饰和与免疫性疾病...................................................................30V 华东师范大学博士学位论文第二章实验材料与方法........................................................................322.1实验材料...........................................................................................................322.1.1实验细胞系...............................................................................................322.1.2原核细菌..................................................................................................322.1.3质粒信息..................................................................................................322.1.4实验仪器..................................................................................................332.1.5实验试剂..................................................................................................342.1.6引物序列..................................................................................................352.1.7相关实验试剂的配制..............................................................................382.2实验方法..........................................................................................................412.2.1分子克隆..................................................................................................412.2.2细胞培养..................................................................................................512.2.3蛋白质印迹..............................................................................................522.2.4细胞免疫染色........................................................................................542.2.5免疫共沉淀..............................................................................................562.2.6核质分离..................................................................................................582.2.7真核细胞组蛋白抽提..............................................................................592.2.8真核细胞基因组抽提..............................................................................602.2.9细胞稳系构建..........................................................................................612.2.10qPCR........................................................................................................622.2.11原核表达蛋白的纯化............................................................................632.2.12考马斯亮蓝染色....................................................................................642.2.13体外SUMO修饰反应...........................................................................652.2.14染色质免疫共沉淀（ChIP）................................................................65第三章SUMO修饰调控HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性的........68分子机制研究............................................................................683.1前言..................................................................................................................683.2实验结果..........................................................................................................72第一部分：HDAC1/2的SUMO修饰功能研究···································723.2.1ChIP-Seq证明SUMOmimic修饰促进HDAC1H3去乙酰化酶活性..723.2.2代表性基因转录水平分析表明HDAC1SUMO修饰抑制靶基因转录73VI 华东师范大学博士学位论文3.2.3HDAC1/2mimicSUMO修饰不影响其亚细胞定位..............................763.2.4HDAC1/2SUMO修饰位点的鉴定.........................................................773.2.5HDAC1/2SUMO修饰位点突变部分抑制其组蛋白去乙酰化酶活性.793.2.6HDAC1/2SUMO修饰突变体蛋白稳定性降低.....................................803.2.7HDAC1/2SUMO修饰突变体不影响HDAC1/2复合体形成...............813.2.8HDAC1/2SUMO修饰突变体抑制其染色质定位.................................83第二部分：SENPs去除HDAC1/2的SUMO修饰研究·························843.2.9SENP家族蛋白中，SENP1/6/7可以去除HDAC1/2SUMO修饰......843.2.10过表达SENP6能够明显增加组蛋白乙酰化水平...............................853.2.11SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖于其去SUMO化酶活性...........873.2.12SENP6抑制HDAC1/2蛋白稳定性......................................................883.2.13SENP6抑制HDAC1/2与染色质结合..................................................903.2.14SENP6抑制细胞增殖............................................................................923.3总结与讨论......................................................................................................93第四章SUMO修饰调控组蛋白甲基化的分子机制研究....................964.1前言..................................................................................................................964.2实验结果..........................................................................................................974.2.1外源过表达SUMO-1和UBC9能增加H3K4/9/27me3水平..............974.2.2敲低SUMO修饰的E2结合酶UBC9能降低H3K4/9/27me3水平...994.2.3MLL复合体中的WDR5能发生SUMO修饰.....................................1004.2.4SUMO修饰不影响WDR5的转录水平...............................................1024.2.5WDR5发生SUMO修饰增强WDR5蛋白稳定性..............................1034.3总结与讨论....................................................................................................104参考文献.................................................................................................107附录（缩略语）....................................................................................120在学期间所取得的科研成果................................................................121致谢.........................................................................................................122VII 华东师范大学博士学位论文第一章文献综述1.1表观遗传学简介表观遗传学概念的前身“epigenotype”一词，最早由英国科学家ConradWaddington于1939年在《现代遗传学导论》中提出。此后，Waddington受亚里士多德“epigenesis”词的启发，于1947年，正式提出“Epigenetics。Epigenetics这个词由Epi+genetics构成；“Epi”的中文意思是“位于…之上”（upon）或者“超越”（over）。顾名思义，Epigenetics这个术语的研究范围既包括经典遗传学，又超越经典遗传学研究的范畴[1]。Waddington认为：表观遗传学是一门在以进化生物学为基础的遗传学与发育生物学以及生态学的交叉学科[2]（图1-1-1）。在“Epigenetics”一词诞生的最初30年中，除了Lovtrup于1974年在他的书中提到以外，很少有人用到该词语。尽管Lovtrup提到“Epigenetics”，但Lovtrup本意或多或少指的是发育生物学的同义词，而不是表观遗传学。直到1980s才有少数人倾向把“Epigenetics”理解为Waddington所定义的表观遗传学。1982年一本生物学字典把表观遗传学定义为：“表观遗传学通过与遗传因子以及发育过程相互作用将基因型转换成表型”。1983年Medawar认为表观遗传学是执行受精卵中的所有遗传信息的过程，即遗传学规定目的，表观遗传学来执行。随后，Hall于1992年在他的《进化发育生物学》书中，把表观遗传学定义为：“表观遗传学或者表观遗传调控是在胚胎发育和分化过程中，通过遗传因子与非遗传因子的相互作用，调控着不同细胞特定基因的表达，从而产生复杂表型的过程”。由于Hall将表观遗传学的研究范围仅仅局限于研究胚胎发育和分化方面，因此此时表观遗传学的研究范围比最初Waddington提出的表观遗传学研究范围要小。随着基因表达调控的分子机制以及细胞表型可以遗传的发现，表观遗传学又有了新的内涵。1990年HollidyR对表观遗传学进行了新的定义：“表观遗传学是研究在复杂有机体发育过程中，基因在特定时间、空间上表达调控机制的一门学科”。HollidyR强调遗传物质除了1 华东师范大学博士学位论文经典的位于DNA上的遗传密码以外，还应包含表观遗传信息。1994年，HollidyR又重新定义了表观遗传学即“表观遗传学是研究有机体的不同细胞里的基因表达发生改变的分子机制以及一些改变了的基因表达，可以通过细胞有丝分裂传递给子细胞”。随后，1996年一本叫做《基因表达调控的表观遗传机制》的书，将表观遗传学重新定义为：“表观遗传学是研究不能够通过DNA序列的改变来解释的基因表达发生了改变，并且这些改变能够通过细胞有丝分裂或者减数分裂传递给子代现象的一门学科”。2006年DavidAllis等科学家对表观遗传学做了进一步的定义即：“表观遗传学是指DNA序列没有发生改变，但是基因表达产物发生了可遗传的改变，并且这种变化可以稳定的遗传给子代”[3]。此后，2008年12月由班伯里会议中心和冷泉港实验室共同举办的以染色质为基础的表观遗传学会议上将表观遗传学定义为：“DNA序列没有发生改变，由染色质的改变引起的可遗传的变异”[4]。图1.1-1Waddington定义的表观遗传学[2]表观遗传学研究的内容可以分为两大类，即基因特异性表达调控和基因转录后调控。前者的研究内容包括：DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑、基因印记、X染色体失活；后者研究内容包括：基因组中的非编码RNA、微小2 华东师范大学博士学位论文RNA（miRNA）、反义RNA、内含子、核糖开关等。可稳定遗传的表观遗传状态的建立需要三种信号通路来完成，即表观遗传诱导信号（Epigenator）、表观遗传起始信号（EpigeneticInitiator）和表观遗传维持信号（Maintainer）。表观遗传诱导信号包括染色质状态发生改变前的所有上游信号，既包含胞外的环境信号，又包含胞内的表观遗传起始者将接受的胞外表观遗传诱导信号，传递给表观遗传起始者过程的信号。表观遗传起始信号包括DNA结合蛋白、非编码RNA以及能够协调染色质的结构以便使其重塑的因子。表观遗传起始者的作用是将接收到的表观遗传诱导信号，精确的传递给染色质，并在染色质上相应的位置上建立表观遗传信息。表观遗传维持信号包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、组蛋白变异体、核小体位置的改变等。表观遗传维持信号的作用是将染色质上建立的表观遗传信息稳定下来，并传递给子代[4](图1.1-2)。图1.1-2表观遗传通路[4]3 华东师范大学博士学位论文1.2蛋白质翻译后修饰1.2.1组蛋白翻译后修饰组蛋白是高度碱性的核蛋白。它们代表DNA缠绕在哪个线轴上，并在基因表达的调控中发挥重要作用。有五个主要的组蛋白家族：H1/H5、H2A、H2B、H3和H4。H1/H5被称为接头组蛋白，而H2A、H2B、H3和H4被称为核心组蛋白。连接组蛋白在DNA的入口和出口位点结合核小体，从而将DNA固定在适当的位置。核心组蛋白形成二聚体，四个二聚体形成一个八聚体核小体核心。每个典型的组蛋白—H3、H4、H2A和H2B—共有一个由3α螺旋（α1，α2和α3）组成的共同结构域，由称为组蛋白折叠的两个环（L1和L2）分开，促进了H2A与H2B和H3与H4形成异二聚。每个核小体由约145-147个碱基对的短片段DNA组成，并被组蛋白八聚体核心吞噬，该核心由每个核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）的四个二聚体组成（图1.2.1-1）。图1.2.1-1核小体[5]染色质不是一种惰性结构，而是一种有启发性的DNA支架，可以响应外部信号来调节DNA的多种用途。在这个调节中起关键作的是组蛋白的修饰。H2A、H2B、H3和H4这四种核心组蛋白能发生各种蛋白质翻译后修饰（PTMs），包括4 华东师范大学博士学位论文乙酰化（Acetylation)、甲基化(methylation）、泛素化(Ubiquitination）、磷酸化（Phosphorylation）、巴豆酰化（Crotonylation）和SUMO化（Sumoylation)等。组蛋白PTMs在许多生命活动过程中发挥重要的调控作用，如细胞分化、细胞凋亡、DNA修复、基因表达调控、染色质凝集等。组蛋白PTMs一方面可通过直接的物理作用改变染色质结构来发挥功能（例如组蛋白乙酰化带负电荷，可中和组蛋白尾巴上的正电荷，从而削弱DNA结合到染色质上，使得染色质变得松散），另一方面，组蛋白尾巴上的各种修饰可组合成一套特殊的密码，成为特定蛋白的结合和识别位点，通过特定蛋白与染色质的互作改变染色质结构(图1.2.1-2）。这些表观遗传调控互相影响，因此了解组蛋白PTMs在此框架中的作用对于破译染色质生物学至关重要[6]。图1.2.1-2表观遗传调控染色质和核小体结构[7]1.2.2非组蛋白翻译后修饰关于非组蛋白蛋白质，各种各样的翻译后修饰已被认定为与细胞凋亡、代谢和许多其他细胞信号级联途径的启动和调节密切相关。迄今为止，已经确定了200多种类型的非组蛋白PTMs。近期大量关于非组蛋白的翻译后修饰，如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化等的研究表明，非组蛋白翻译后修饰参与调节细胞应答和稳定性的关键途径。由于这些动态修饰的失调，直接或间接地影响癌症、炎性疾病和神经退行性疾病的发生发展。5 华东师范大学博士学位论文1.3SUMO修饰小泛素相关修饰物蛋白(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)是一种特殊的类泛素样蛋白。SUMO修饰（SUMOmodification）或SUMO化（sumoylation）是表观遗传调控中一种保守的蛋白质翻译后修饰，是通过一系列的酶促反应共价连接到靶蛋白的过程，此过程是可逆的、动态的。SUMO修饰可改变底物蛋白的结合、构象和定位。蛋白质SUMO化在大多数真核生物中至关重要，参与调节许多细胞过程，包括线粒体动力学、核糖体生物合成和DNA修复等[8]。1.3.1SUMO蛋白图1.3.1泛素、SUMO1、SUMO2和SUMO3结构与序列的比较[9]目前，在低等生物中，只发现了一种SUMO基因，经翻译后即为SUMO-1蛋白；在脊椎动物中，已鉴定出三种能与靶蛋白共价连接的SUMO蛋白（SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3），而SUMO-4被认为仅参与蛋白-蛋白的相互作用，不参与共价结合[10]。SUMO-2和SUMO3同源性达97%，但与SUMO-1仅具有约50%的序列相似性。相比于SUMO-3，SUMO-4更接近于SUMO-2（图1.3.1）。6 华东师范大学博士学位论文SUMO-4的具体作用尚不十分明确，其表达仅限于肾脏、脾脏和淋巴结等组织。UBC9和SUMO2的敲除在小鼠中是胚胎致死的[11,12]，可能是由于SUMO-2的补偿作用，SUMO-1或SUMO-3的敲除小鼠的表型不受严重干扰[12,13]。在哺乳动物中，SUMO-2/3/4可以通过其N末端的内部共有SUMO位点（KX(E/D)）形成多SUMO链，并参与泛素依赖性蛋白降解。在生理条件下，SUMO1是SUMO家族成员中最广泛存在的一种[14]，由于缺乏KX(E/D这种基序，通常只发生单修饰，导致目标蛋白的功能改变。然而，在核蛋白RanBP2存在的情况下，也有报道显示SUMO-1聚合链的存在[15]。SUMO靶向的泛素连接酶（STUbLs），如RNF4可以识别多聚SUMO化的蛋白质或带有多个SUMO标签的蛋白质，这可能导致靶蛋白的泛素化和降解，例如已经被报道的PML[16]，c-Myc[17]和PARP-1[18]。1.3.2SUMO修饰通路图1.3.2SUMO修饰通路[19]SUMO与泛素样蛋白（ubiquitin-likeprotein,UBL）家族的其他成员一样，以与泛素-蛋白缀合相似的过程共价连接至靶蛋白[20]（图1.3.2）。首先，SUMO被合成为具有C-末端肽延伸的无活性前体。随后，SUMO蛋白酶中的SENPs家族7 华东师范大学博士学位论文蛋白在C端近侧的Gly-Gly基序之后，将无活性前体切割以形成具有缀合活性的成熟SUMO，再以ATP依赖性方式被SUMO激活酶E1活化并形成高能硫酯键。然后，SUMO被转移至SUMO结合酶E2的活性位点半胱氨酸，再转移至靶蛋白的赖氨酸侧链。蛋白质的SUMO化常常在E3连接酶（如PIAS家族蛋白、PC2、RanBP2、UHRF2等）的辅助下增强其偶联特异性[20]。同时，SENPs家族蛋白也负责从目标蛋白上去除SUMO，因此该修饰是高度可逆的。1.3.3SUMO修饰基序SUMO化通常发生在ψ-K-x-E/D序列（其中ψ是大体积脂肪族酸性氨基酸，X是任何残基）的靶蛋白赖氨酸上[14]。很多研究已经描述了这种共有位点的变异[14]，能在该基序外部的赖氨酸上发生的SUMO化修饰。靶蛋白可以在单个赖氨酸位点上发生单SUMO化，在多个赖氨酸位点上发生单SUMO化，或者在单个或多个赖氨酸位点上产生延伸的SUMO链（多聚SUMO化）（图1.3.3）。图1.3.3SUMO修饰形式[21]1.3.4SUMO修饰酶系1）E1激活酶在哺乳动物中，已鉴定出的SUMO激活酶E1是一个异源二聚体，由SAE1和SAE2组成。在酵母中为Aos1和Uba2。2）E2结合酶目前，UBC9是迄今为止SUMO修饰中发现的唯一一个E2（SUMO结合酶）。UBC9由UBE21基因编码，是一个表面带正电荷的，由158个氨基酸残基构成的小分子蛋白，只与带负电荷的SUMO结合，而不能与带正电荷的泛素结8 华东师范大学博士学位论文合。UBC9是一种核蛋白，它可定位到核孔复合物（nuclearporecomplex，NPC）的胞浆侧和核质侧。UBC9第93号位半胱氨酸残基可通过硫酯键与SUMO蛋白C端的甘氨酸残基相结合，从而形成SUMO-UBC9硫酯中间体，也能促进赖氨酸（Lys）基团形成牢固的异肽键，进而使SUMO分子结合到靶蛋白上。体外SUMO化研究揭示，仅有UBC9足以使SUMO部分共价连接到底物上[22,23]。3）E3连接酶E3连接酶（SUMO-ligatingenzyme）不与SUMO直接结合，但很多E3本身也存在SUMO修饰，它们作为连接酶，主要增强UBC9将SUMO转移到底物上的效率，可活化UBC9，缩短UBC9与靶蛋白之间的距离，从而增强其特异性。E3连接酶的种类很多，其主要包含以下几大类：PIAS（proteininhibitorofactivatedSTAT）家族[24]、RanBP2[15]、Pc2[25]、TOPORS[26]、TRAF7[27]和MPAL[28]，其可通过促进多SUMO链形成或引入新的SUMO受体位点来刺激结合效率。PIAS家族是E3连接酶中最大的一族，并且含有大量的SUMO靶标库。PIAS在哺乳动物中有四个基因，转录为五种同工型（PIAS1，PIASxα，PIASxβ，PIAS3和PIASy）[29,30]（图1.3.4）。作为SUMO修饰的E3连接酶，PIAS蛋白活化后连接到RING结构域，增强其SUMO化效率，PIASy还可以促进SUMO与YY1的连接，而不依赖其RING指结构域[31]。PIAS蛋白作为研究最为广泛的E3，具有SUMO种型和底物的特异性。例如，PIAS1和PIASxα，而不是PIASy和PIASxβ，可催化雄激素受体的SUMO修饰[32]；只有PIASxα和PIASxβ可刺激SUMO-2与Nkx2.5结合[33]。同时，我们前期还发现，只有PIASxβ可以调控HDAC1/2的去乙酰化酶活性，而PIASxα并不具备这一功能。这些研究结果表明，SUMOE3连接酶对于SUMO种型的底物特异性和调节SUMO化反应的强度很重要。9 华东师范大学博士学位论文图1.3.4PIAS家族蛋白的结构及其在肿瘤中的意义[21]值得注意的是，PIAS蛋白的功能并不总是严格地与它们的SUMOE3连接酶活性相关联，这表明它们的酶活性可能仅仅是它们的功能之一。PIAS蛋白最初被鉴定为STAT转录因子的抑制剂，但越来越清楚地研究表明它们调控更广泛的蛋白质。例如，PIAS家族成员调节核运输，DNA损伤修复，NF-kB信号传导，几种转录因子和许多核受体[24,34,35]。在生物体层面，PIAS成员参与胚胎发育，造血功能，先天性和适应性免疫反应，空间学习和长期记忆[36-38]。PIAS家族蛋白常常和肿瘤发生密切相关(图1.3.4)：PIAS1在前列腺癌中过10 华东师范大学博士学位论文表达，抑制p21，导致细胞增殖速率增加[39,40]；PIAS1过度表达与多发性骨髓瘤的不良临床结果相关[41]；PIAS3通常在结直肠癌中过度表达[42]。PIAS1和PIASxα是肿瘤抑制因子PML的E3，PML的SUMO化促进CK2的招募，从而促使PML泛素化和降解[43]。MYC在各种人类癌症中发挥关键的致癌活性。研究报道，PIAS1介导MYC的K51/52两个位点的SUMO化修可延长了MYC半衰期，抑制其蛋白酶体降解，且增强MYC的转录活性。同时，PIAS1介导的SUMO化维持了原发性B淋巴瘤细胞中MYC的致癌活性[44]。。1.3.5去SUMO化蛋白酶SUMO化过程具有动态可逆性，而且即使只是一小部分靶蛋白的快速修饰，也有可能产生巨大的功能变化[45]。在SUMO蛋白酶的作用下，从靶蛋白上去除SUMO修饰和催化SUMO蛋白的成熟，是SUMO修饰可逆性的关键。哺乳动物中，已鉴定出的去SUMO化蛋白酶主要是SENP蛋白家族（SENP1-3和SENP5-8）[46]。在酵母中，去SUMO化主要由必需蛋白质Ulp1和非必需蛋白质Ulp2两种酶完成[46]。研究显示，Ulp1与Ulp2定位不同，Ulp1与SENP1和SENP2同源，Ulp2与SENP6和SENP7同源[47]。SENP8对SUMO修饰具有非特异性，已被鉴定为一种特定的类泛素化修饰neddylation蛋白酶[48]。Ulp/SENP的C-末端含有不同的催化结构域，而N-末端序列常常决定其亚细胞定位。大多数SENPs倾向于定位在细胞核或共定位于可区分的亚核室中。例如，密切相关的SENP1和SENP2，通过与核孔复合体（NPC）连接定位于核内[49]。有趣的是，在细胞周期进程或细胞应激过程中，它们的定位可以发生变化[46,50,51]。特定亚细胞定位有助于其功能特异性，扮演不同的角色，表明它们的活性和功能是受空间定位调控的[52]。此外，不同的SENPs蛋白特异性去除的SUMO不同[53]。SENP1从靶蛋白或者poly-SUMO-2/3链上去除SUMO-1时，具有强大的活性，然而从底物上去除SUMO2/3的能力一般，因此它在解除SUMO-2/3链长方面显示出特殊的作用[54]。11 华东师范大学博士学位论文表1.3.5各种去SUMO化酶的定位及其性质除了上述SENPs，最近还有新的去SUMO化蛋白酶被鉴定出。例如，DeSI1特异性地去除转录阻遏物BZEL的SUMO修饰[55]。USPL1是另一种新的蛋白酶，其独特地定位在细胞核内的胶质体中，意味着除了催化功能之外，其在细胞分裂中具有潜在作用[56]。1.3.6SUMO修饰去除蛋白家族SENPs和基因表达调控蛋白质去SUMO化是通过SUMO蛋白酶进行的，任何SUMO蛋白酶的失活或缺失常都会导致细胞中SUMO化蛋白质的积累。SUMO蛋白酶还参与许多生物过程，包括基因转录，核质转运，细胞增殖和早期胚胎发生[57,58]。表1.3.6中，列出了不同SENPs去SUMO化的底物及其细胞内的功能及意义。尽管SENPs功能的潜在分子机制尚不十分明确，但已有研究表明，SENP敲除或突变的小鼠是胚胎致死的，暗示SENP的作用是必不可少的[59-61]。12 华东师范大学博士学位论文表1.3.6SENP去SUMO化的底物及其细胞内的功能及意义SENP1的一个经典作用是参与维持Elk-1SUMO化的动态平衡[62]。SENP1的缺失阻断了Elk1的转录激活，并且通过积累SUMO化的TBL1-TBLR1来增强Wnt靶基因的活化[63]。同时，SENP1也可通过PGC-1a的去SUMO化来调节线粒体的生物合成和功能，并随后促进其转录活性[64]。肌细胞中特异性增强子因子-2（MEF2）是在胚胎发育中起重要作用的转录因子，SENP2能直接去除MEF2A上的SUMO，并增强其转录活性[65]。在内皮细胞中，SENP2调控ERK513 华东师范大学博士学位论文活性也显示出类似的机制[66]。除了直接调控基因表达外，一些SENPs通过影响DNA表观遗传修饰而发挥间接作用。例如，SENP2通过改变Pc2/CBX4在启动子上的互作，从而调控Gata4和Gata6的转录。在SENP2敲除的胚胎中，Pc2/CBX4处于高SUMO化水平，显著地促进PcG靶基因启动子上的Pc2/CBX4水平，增加H3K27me3，导致Gata4和Gata6转录抑制从而胚胎致死[61]。类似的，SENP3能去除RbBP5的SUMO化[67]。Nayak等[67]研究确定了动态的去SUMO修饰在HOX基因表达调控中的作用，如由MLL1/MLL2组蛋白甲基转移酶复合物调控的基因表达。RbBP5是MLL1/MLL2复合物的四个调节亚基之一，被SENP3去SUMO化后，可以依次将MLL组分Ash2L和menin招募到HOX基因的亚组。装配好的MLL1/MLL2复合体催化H3K4me3并招募RNApolII到HOX基因的启动子区域，从而启动基因表达。这些发现揭示了SENPs以转录调控的方式参与关键发育调节。P53是一种众所周知的肿瘤抑制因子，它通过触发检测点来防止非整倍性突变，在处理损伤或诱导细胞凋亡以消除受影响的细胞方面发挥重要作用。许多研究发现SENPs对p53活性进行调控，目前阐明得最清楚的是SENP2调控小鼠滋养层发育中的p53/Mdm2通路[60]。SENP2的全长异构体是不可或缺的，足以负调控p53的活性。但在敲除SENP2的细胞中，p53的降解受到抑制，进而改变SUMO和Mdm2的亚细胞分布。有意思的是，SENP2的重新表达，会通过去除Mdm2的SUMO化促进p53降解，从而减轻了这种缺陷[66,68]。值得注意的是，核仁SUMO特异性蛋白酶SENP3也参与调控Mdm2-p53途径。SENP3会通过与p53竞争Mdm2结合，使Mdm2介导的泛素-蛋白酶体降解p53途径受到抑制，从而使p53蛋白稳定性增加[69]。1.4SUMO修饰与染色质1.4.1SUMO富集于染色质成纤维细胞mRNA-Seq结果显示，SUMO-1和SUMO-2/3标记的基因主要富集在组蛋白基因、翻译相关的基因（如RP基因）、RNApolIII转录的tRNA基14 华东师范大学博士学位论文因和RNApolI转录的rRNA基因，表明SUMO修饰在调节蛋白质合成具有重要的功能。热休克导致整体SUMO化水平剧烈增加，尤其是热休克因子HSF1和HSF2，以及许多染色质相关蛋白和其他转录因子本身上的SUMO化水平[70-72]。Niskanen[73]和Seifert[74]等近年的基因组研究揭示了热休克反应中染色质与SUMO结合的变化：整体的SUMO-2/3修饰在哺乳动物基因组中因热休克而剧烈变化，SUMO-2/3主要富集在活性转录基因的启动子区域。然而，SUMO-2/3并不是简单的刺激这些基因区域的转录。在白血病和前列腺癌细胞中，采用siRNA敲低UBC9或PIAS1（降低整体SUMO修饰水平），导致正常条件下SUMO-2/3富集在启动子的热休克基因表达增加[73]。这表明SUMO-2/3修饰通常抑制热休克诱导的基因表达，可能与防止急性温度应激期间热激基因的过度激活有关。这些全基因组的ChIP-Seq研究揭示了热休克反应中通过染色质观察到的SUMO修饰的动态变化。这种大规模的SUMO修饰的变化，可能涉及到多个信号通路的协调。例如，在热休克期间，某些染色质结合因子不能被SUMO化，SUMO化蛋白偶联物可能被其他机制完整地去除。哺乳动物的SUMO蛋白酶SENP6在热休克期间被招募到具有转录活性的DNA区域[74]。研究影响SUMO与染色质结合的不同应激的动力学的因素，可以更深入地了解SUMO在热休克和其他细胞环境变化中调节基因表达的功能。1.4.2SUMO修饰与组蛋白许多染色质相关蛋白都可以SUMO化，除了转录因子、染色质重塑因子和其他染色质修饰酶之外，染色质的核心组分组蛋白的赖氨酸侧链也能被SUMO化。组蛋白SUMO修饰已在不同物种中被发现，包括植物和疟原虫。在芽殖酵母中，所有四种核心组蛋白蛋白和组蛋白变体H2A.Z都可以以SUMO化的修饰形式被检测到[75,76]，然而在哺乳动物细胞中只鉴定出了SUMO化的H3和H4[72,77]。由此说明，组蛋白SUMO修饰是一种非常保守且具有重要意义的染色质翻译后修饰，也使得已经非常复杂化和多样化的组蛋白编码由于大量组蛋白翻译后修饰的存在变得更加复杂。理解这些不同修饰之间的相互作用，对于阐明15 华东师范大学博士学位论文组蛋白的改变对基因调节的复杂性是必要的。2003年首次在哺乳动物细胞中发现组蛋白SUMO修饰，且其发挥着抑制转录的作用[77]。在人细胞中，SUMO化的组蛋白H4将组蛋白去乙酰化酶HDAC1和易染色质蛋白1（HP1）招募到DNA上，参与转录抑制并维持基因组的沉默区域。在酵母中，四种核心组蛋白均可发生SUMO修饰，同哺乳动物中观察到的一样，SUMO修饰的组蛋白抑制转录[75]，其可能的机制是拮抗激活组蛋白修饰（如组蛋白乙酰化）。总的来说，组蛋白SUMO化可能有多种转录调控模式，包括将转录抑制因子招募到基因启动子上并阻断激活组蛋白的修饰。有趣的是，Hendriks[72]等人的报道表明人（HeLa）细胞中的组蛋白乙酰化可能刺激附近赖氨酸残基的SUMO化。通过质谱分析发现人类组蛋白H3的SUMO修饰位点在Lys19，同时Lys24能发生乙酰化修饰。当用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理HeLa细胞时，组蛋白H3SUMO修饰也增加。相反，组蛋白乙酰转移酶抑制（姜黄素）导致H3SUMO修饰的相应减少。这些结果提示两个不同组蛋白修饰之间互相串联干扰的新例子，但其具体功能仍有待确定。体外研究表明，组蛋白SUMO化在调节染色质结构和远程染色质相互作用中也发挥作用[78]。Dhall等人创建了二硫键连接的SUMO-3组蛋白H4（在Lys-12）缀合物，显示SUMO-H4容易并入组蛋白八聚体和12-mer核小体阵列，但阻碍核小体压缩。福斯特共振能量转移（FRET）测量核内核小体间相互作用显示，组蛋白H4SUMO修饰减少了两个相邻单核小体之间的亲和力，说明组蛋白H4的基本N-末端尾巴对于染色质压缩是十分重要的，因此，改变该区域内的残基会导致染色质结构和组织的变化[79]。H4Lys-12SUMO化的染色质重排机制在体内是否成立尚待确定，但提供了组蛋白SUMO修饰介导染色质调节的另一种潜在模式。尽管这些研究探讨了组蛋白SUMO化的功能，但我们对组蛋白SUMO化的理解仍然有限，如整个基因组中位点特异性组蛋白SUMO化的分布、SUMO修16 华东师范大学博士学位论文饰组蛋白的动力学等问题仍未解决。1.5SUMO修饰与组蛋白乙酰化蛋白质赖氨酸侧链ε位置上的NH3基团可发生乙酰化修饰（图1.5-1）。组蛋白赖氨酸乙酰化修饰调控转录激活，主要有以下两个机制：1）组蛋白赖氨酸残基带正电荷，与带负电荷的DNA结合紧密，而乙酰基带负电荷，直接通过物理作用使组蛋白与DNA的结合变得松散,导致DNA暴露更多，更容易被转录因子识别并结合；2）组蛋白乙酰化通过招募转录相关的识别蛋白促进转录。图1.5-1赖氨酸乙酰化机制及其识别结构域[80]组蛋白乙酰化是一个由两个酶家族调节的动态过程：HATs和组蛋白脱乙酰酶（HDACs）。以乙酰-CoA为辅因子，HATs催化乙酰基转移至组蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基。HATs包含许多酶，包括CREBBP（CBP），EP300（p300），KAT2B（PCAF），GNAT，KAT5（Tip60）和KAT6A（Mo2）等。HATs根据其定位分为A、B两类（图1.5-2）。A类HATs包括CBP、p300、GNAT和MYST家族，主要定位在细胞核。B类HATs主要包括HAT1和HAT4,主要定位于细胞质，催化细胞质内新合成的组蛋白H4发生乙酰化，促进其入核参与染色质组装。17 华东师范大学博士学位论文图1.5-2HATs的分类及细胞内定位[81]由于CBP和P300是功能最强大的一类HATs，其在哺乳动物中具有相似的结构，所以被统称为CBP/p300。CBP/P300不需要形成复合体，其单体就具有乙酰转移酶活性。CBP/p300由固有无序区域和折叠功能域构成。HAT区域侧翼为BRD、CH2和CH3区域，这些侧翼结构域能调控乙酰转移酶活性和底物特异性（图1.5-3）。BRD、CH2、HAT和CH3区域的结构域在高等生物体中高度保守。CH1区域主要是TAZ1结构域。CH2区域包括RING结构域和PHD结构域。CBP/p300的BRD结构域与组蛋白H2A，H2B，H3和H4乙酰化的赖氨酸混杂结合[82,83]，能促进HAT结构域在乙酰化核小体中的功能[84]。CH3区域由ZZ型锌指（ZZ）和转录适配器锌指-2（TAZ2）结构域组成。TAZ2域通过蛋白质-蛋白质相互作用，招募许多蛋白质至共激活因子复合物。有报道发现p300的SUMO修饰可将HDAC6招募至靶基因启动子区域，从而抑制靶基因转录[85]。已发现ZZ结构域能与SUMO-1相互作用，但这种相互作用的功能未知[86]。值得注意的是，位于CBP/p300BRD区域N端的细胞周期调控结构域1（CRD1）的SUMO化介导转录抑制[85,87]。最新的研究表明，BRD、PHD和ZZ结构域能与SUMO-1和UBC9相互作用，并作为E3连接酶促进CRD1的SUMO化[88]。18 华东师范大学博士学位论文图1.5-3CBP结构[88]GNAT家族主要包括GCN5和PCAF。GCN5又被称为KAT2A，其结构和功能非常保守，是最早鉴定出的转录激活相关的HAT。GCN5可以催化组蛋白H3和H4的乙酰化修饰，在DNA损伤修复和转录调控等中扮演重要角色。2006年的文章报道，在酵母中发现Gcn5是SUMO修饰底物，SUMO化不影响Gcn5的组蛋白乙酰转移酶活性，然而，SUMOmimicGcn5减少了SAGA激活依赖的TRP3基因转录[89]。目前还未有PCAF发生SUMO修饰的研究报道。在哺乳动物中，Tip60，MOZ，MORF，HBO1和HMOF属于MYST家族的乙酰转移酶。MYST家族蛋白的底物非常广泛，除了组蛋白外，越来越多的受MYST调控的非组蛋白不断被发现。不同MYST酶在基因调控，DNA复制、修复和重组，细胞分裂/分化和发育过程中发挥着至关重要的作用。Tip60是迄今为止最著名的非组蛋白乙酰转移酶。2008年的研究报道，Tip60的K430和K451位点上存在SUMO修饰，在紫外线照射造成的p53依赖的DNA损伤修复反应过程中，SUMO化的Tip60从核质迁移到早幼粒细胞白血病（PML）小体处；而Tip60SUMO修饰缺失的2R突变体,消除了p53依赖性DNA损伤应答，说明TIP60的SUMO修饰响应紫外线照射的重要性[90]。随后的文章报道，PIAS介导Tip60的SUMO化增加p53K120乙酰化，促进细胞凋亡[91,92]。目前尚无关于MOZ，MORF，HBO1和HMOF的SUMO修饰的研究报道。赖氨酸去乙酰化酶（KDACs）或HDACs于1995年首次发现，以相反的方式起作用，从组蛋白赖氨酸中除去乙酰基团。随后发现了多种去乙酰化酶，他们中的大多数对多种底物显示出活性，主要包括SIRTs(SIRT1-7)和HDACs(HDAC1-19 华东师范大学博士学位论文HDAC11)。在高等真核生物中，将KDACs分为4大类（表1.5）：I类，II类和IV类是Zn2+依赖性酰胺水解酶[93]，III类（也称为SIRTs)使用NAD+作为其催化活性的共同底物。I类和II类在其催化结构域中具有高度同源性。Zn2+依赖性KDACs主要定位于细胞核和细胞质中，而SIRTs主要定位于线粒体中。I和II类的底物通常是组蛋白和各种转录因子。它们通常与核内的转录抑制复合物如Sin3，NuRD/NRD/Mi2，CoREST和SMRT/N-CoR相关。唯一的例外是HDAC8，它是一种单体。IV类只有一个已知的代表HDAC11，它与Zn2+依赖性酵母蛋白Rpd3（I类）和HDA1（II类）以及NAD+依赖性Sirt2，在系统发育上存在差异，因此形成了自己的子类[94]，主要定位于细胞核中的HDAC11（IV类）通过调节抗原呈递细胞中IL-10的表达而维持免疫激活和免疫耐受之间的平衡[95]。这是迄今为止HDAC11唯一已知的生理功能。表1.5HDAC/KDAC家族成员亚细胞定位及其底物蛋白大量的研究报道已表明，HDACs受到各种翻译后修饰，包括磷酸化，蛋白水解切割，氧化，泛素化和SUMO化。HDACs能被SUMO化，且参与染色质重塑。最早的研究发现HDAC1被SUMO1在体内和体外SUMO化，在体外被SUMO-2/3SUMO化[96-98]。两个独立的研究发现将HDAC1的SUMO化位点20 华东师范大学博士学位论文在赖氨酸K444和K476上，但其生物学作用尚不明确[96]。野生型HDAC1的过度表达诱导了细胞周期G2期细胞的积累，表明HDAC1的SUMO化突变体可能会影响一些生物学功能[97]。其他研究已经报道SUMO修饰，增强含HDAC1/HDAC2的复合物如Elk1或Mi-2/NuRD调控的转录抑制[99,100]。此外，还评估了HDAC1KK444/476RR突变体多聚泛素化的能力：虽然野生型和2R突变体显示一致的普遍的泛素化，但后者似乎泛素化程度降低[97]。这一点提示我们，这两个赖氨酸可能是作为泛素结合的靶残基，或者更复杂的SUMO化和泛素化之间的交叉调控点。SimonaCitrod等[101]的研究发现，SUMO1修饰的HDAC1促进HDAC1泛素化和降解。在非致瘤性乳腺上皮细胞中HDAC1优先与SUMO-1缀合导致HDAC1蛋白水解，而在乳腺癌细胞中HDAC1更多地缀合到SUMO2上，促进HDAC1蛋白稳定性。在乳腺癌细胞中过表达的SUMOE3连接酶PIASy选择性地促进HDAC1与SUMO-2的结合。值得注意的是HDAC1的无磷酸化突变体S421A，S423A的SUMO化相对于野生型增加[96]。这一发现尚未被进一步研究，但猜测CKII磷酸化与SUMO化之间可能存在负相关关系。体内实验已证实，HDAC1能被SENP1去SUMO化[102]。HDAC1抑制AR基因转录[103]，并且SENP1显示增强雄激素受体（AR）驱动的基因的配体依赖性转录。HDAC1和HDAC2在AR基因启动子处与SENP1形成复合物，且SENP1的转录促进作用依赖于对HDAC1的去SUMO化。野生型HDAC1可以抑制AR活性高达90％，而2RHDAC1突变体只有60％，这与之前的结果相一致[102]。目前研究表明，HDAC2K462是SUMO修饰位点[104]。值得注意的是，HDAC2的SUMO位点不像HDAC1那样完全保守，但它在蛋白质序列中的位置介于HDAC1上两个SUMO位点的位置之间。这表明SUMO化调控HDAC1和HDAC2可能存在细微的差异。SUMO化的HDAC2更易于与p53结合，并且介导p53K320位点的去乙酰化，从而阻断启动子相关复合物招募p53，抑制p53依赖性基因的表达，从而调控细胞周期和细胞凋亡[104]。目前尚无研究报道21 华东师范大学博士学位论文HDAC2的去SUMO化酶。由于蛋白质可通过SIM以非共价方式与SUMO相互作用，HDAC2可参与招募SUMO结合的转录因子，如Elk1和CBP等，从而抑制靶基因的转录[87,99]。体外实验中，SUMO化的Elk1特异性促进HDAC2的结合，这表明HDAC2上存在SIM基序。此外，其他的研究发现，在HeLa细胞中，SUMOE3RanBp2能催化HDAC4的SUMO修饰，SUMO-1修饰的组蛋白去乙酰化酶HDAC4能增强其去乙酰化酶活性[98]。有趣的是，与HDAC4或HDAC5的相互作用促进了MEF2的SUMO化，其使MEF2转录失活，并且HDAC4的SUMO位点突变体抑制了其对MEF2依赖性基因转录的抑制作用[105,106]。1.6SUMO与组蛋白甲基化组蛋白甲基化修饰是一个非常重要的生物过程，通过它可以调控许多基因的表达。组蛋白可以在赖氨酸或精氨酸残基上被甲基化。赖氨酸残基可以是单甲基化的，二甲基化的和三甲基化的。精氨酸残基可以是单甲基化或二甲基化的。组蛋白的甲基化不改变染色质的电荷，因此和组蛋白乙酰化不同是，它不能通过直接的物理作用调控染色质。组蛋白的甲基化是一个动态平衡过程。通过S-腺苷基-甲硫氨酸（SAM）-依赖的甲基转移酶将甲基基团添加到组蛋白氨基酸残疾上，完成甲基化修饰；由黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的LSD1（也称为KDM1A）和LSD2（也称为KDM2A）为代表的特异性去甲基化酶和α-酮戊二酸（α-KG）依赖性脱甲基酶的JmjC家族蛋白，完成去甲基化。特定赖氨酸残基的甲基化由特定的甲基转移酶催化：H3K4甲基化由含有SET结构域的甲基转移酶MLL1（KMT2A）和MLL2（KMT2D）催化；H3K9甲基化由MECOM（EVI1）和PRDM16催化；H3K27甲基化由EZH1和EZH2催化；H3K36甲基化由SETD2和WHSC1催化；H3K79甲基化由DOT1L甲基化；H3K9二甲基化和三甲基化是由EHMT2（G9a)和SUV39H1催化。组蛋白-赖氨酸甲基化可导致转录激活或转录抑制，如H3K4甲基化促进转录起始，H3K36甲基化促进转录延伸，H3K79甲基化拮抗基因沉默22 华东师范大学博士学位论文[107]；而H3K9和H3K27的二甲基化和三甲基化与转录抑制相关[107,108]。SET1/COMPASS是在酵母中第一个发现的H3K4甲基转移酶复合体[109]。人源细胞中，与SET1同源性最高的是SET1A/B[110]，而MLL1-4与SET1同源性较远[111]。到目前为止，在人类细胞中已发现哺乳动物中至少6种SET1/MLL相关复合体（SET1A/SET1B/MLL1/MLL2/MLL3/MLL4），且这6种H3K4甲基转移酶的功能并不完全冗余，任意敲除其中一个都是胚胎致死的[112-114]。其中SET1A/B和MLL1/2能催化H3K4me1/2/3，而MLL3/4只负责H3K4me1的催化[113]。SET1家族甲基转移酶成员通过催化组蛋白H3K4me2/3，来拮抗Polycomb组蛋白（PcG）的抑制作用,参与基因激活。所有SET1/MLL复合物的活性和功能,由一个WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY-30组成的常见多亚基核心复合物所调控（图1.6-1）。与催化亚基一起，该染色质相关复合物对于H3K4me2/3是必需的，并且核心复合物任何亚基的丢失，均可导致H3K4甲基化的减少。图1.6-1.WRAD模块[115]。A.WDR5，RbBP5，ASH2L和DPY-30的域架构；B.WRAD模块与SET-1家族蛋白的Win-motif和SET结构域部分。通过检测MLL1与从昆虫细胞或细菌中纯化的单个WRAD亚基的成对相互23 华东师范大学博士学位论文作用，已经证明每个亚基以分层相互作用的形式排列（MLL1═WDR5═RbBP5═ASH2L═DPY-30)。WDR5的β螺旋WD40结构域，与MLL1的非结构化区域(Win基序）进行强烈的1：1相互作用，Win基序位于SET结构域催化位点的约139个氨基酸N-末端。WDR5的β螺旋桨结构域的相对面，可以同时与邻近其铰链区的RbBP5区域直接相互作用。除与WDR5相互作用外，RbBP5直接与ASH2L的SPRY结构域结合，可与MLL1发生较弱的直接物理相互作用。ASH2L直接与DPY-30的同源二聚体结合。基于这些相互作用，WDR5和RbBP5被认为是WRAD复合体的支架。ArnabNayak等[67]研究发现，RbBP5K397位点能被SUMO-2修饰，该修饰能SENP3去除。在缺乏SENP3的情况下，RbBP5的SUMO修饰上升，Menin和Ash2L与DLX3基因的关联受损，导致H3K4甲基化减少和活性RNA聚合酶II招募减少，从而抑制HOX基因的表达。此外，他们还发现，SENP3能去除WRD5的SUMO化，但该SUMO化的意义尚未深入的研究。发生在H3K9和H3K27水平的甲基化，代表了哺乳动物细胞中两种主要的基因沉默机制。H3K9me2和H3K9me3是转录抑制标记，H3K9me1、K3K27me1是基因激活标记[116]。H3K9me2在由GLP（KMT1D或EHMT1）与G9a（KMT1C或EHMT2）构成的的异源二聚体催化。YajuWang等[117]研究发现转录因子Sharp-1的K240和K255位点处能发生SUMO修饰，该修饰能招募G9a从而抑制转录。Suv39H1能将H3K9me1催化为H3K9me3。目前尚无研究表明Suv39H1能发生SUMO修饰，但Suv39H1能在体内、体外实验中通过招募UBC9增强HP1α的SUMO修饰水平，从而将HP1α招募至H3K9me3[118]。在HP1α富集期间，Suv39h1将起到KMT的作用，导致H3K9三甲基化，从而为HP1α提供结合位点，从而导致其积累/保留[118]。研究发现，EVI1的K533、K698和K874位点能被SUMO1修饰，SUMO修饰的EVI1降低其与DNA的结合效率，并且负控其转录活性。PIASy增强EVI1的SUMO化从而介导转录抑制，同时能与EVI1相互作用，并且不依赖于其连接24 华东师范大学博士学位论文酶活性而削弱EVI1转录活性。但该研究没有探讨PIASy介导的EVI1的SUMO修饰对H3K9甲基化的影响[119]。最新的研究表明，Setdb1是一种SUMO化蛋白，Setdb1的SUMO化促进了其在Pparg和Cebpa基因的启动子基因座上的占位，并通过H3K9me3水平升高抑制它们的表达。SENP2可以通过去SUMO化抑制Setdb1功能[120]。多梳抑制复合物2（PRC2）能够催化组蛋白H3k27me1/2/3，而组蛋白H3k27me2/3是转录抑制的标志。图1.6-2显示了PRC2复合体的亚单位，及其形成的主要类型的复合物。研究发现PRC2两种亚基SUZ12和EZH2，在体外和体内能被SUMO化。此外，SUZ12与E2缀合酶UBC9在体外和体内都相互作用，并且SUZ12SUMO化位点（K72、K73和K75）的突变不会影响这种结合。E3连接酶PIASxβ在体内增强SUZ12的SUMO化，表明PIASxβ可以作为SUZ12的E3连接酶起作用。但SUZ12的SUMO修饰，不影响其对H3k27me3的催化活性[121]。NSD1（KMT3B）、NSD2（KMT3G）和SMYD2（KMT3C）催化H3K36me1/2，SET2（KMT3A）催化H3K36me3。目前尚无研究报道SUMO修饰调控H3K36甲基化水平。图1.6-2.PRC2复合体IvoAHendriks等[72]利用高通量质谱分析，在大约1,600种蛋白质中共鉴定出超过4300个SUMO化位点。其中，几乎所有的组蛋白赖氨酸去甲基化酶都是25 华东师范大学博士学位论文SUMO修饰的底物。例如，组蛋白赖氨酸去甲基酶KDM5B，其K242和K278位点能在SUMOE3连接酶PC2介导下发生SUMO修饰，但不改变其去甲基化酶活性[122]。1.7SUMO修饰介导的生物学功能1.7.1SUMO修饰与细胞周期调控细胞增殖是细胞繁殖和器官发生必不可少的过程。越来越多的证据表明SUMO修饰在调控有丝分裂染色质结构、细胞周期进程、着丝粒功能和胞质分裂方面发挥重要作用[123]。在有丝分裂期间，E3连接酶RanBP2增强TopoII的SUMO修饰是正常细胞分裂时着丝粒的正确定位所必需的。E3连接酶PIAS3和PIASy所介导的SUMO化修饰，是染色体分离所必需[124,125]。通过RNAi敲低SENP5导致细胞增殖抑制[126]。在病理生理条件下，如氧化应激，SENP3水平增加，使SUMO-2/3从PML解偶联，导致细胞增殖增加[127]。这些研究表明，SUMO系统在脊椎动物细胞增殖中发挥关键作用。1.7.2SUMO修饰与DNA损伤修复既往研究表明，Rad1的SUMO化修饰促进其从Rad1-Rad10复合体上解离，从而有更多的Rad1富集到DNA损伤位点，增加DNA修复效率[128]。核苷酸切除（Nucleotideexcisionrepair,NER)中的两个关键蛋白，XPC和Centrin-2能被SUMO化，在UV暴露条件下，XPC发生SUMO化修饰，从而抑制其降解[129]。同时，也有越来越多的研究表明，SUMO化修饰调控DNA修复路径以维持基因组完整性。1.7.3SUMO修饰与染色质重塑表观遗传调节是基因激活/沉默的必要前提，许多染色质重塑因子已被鉴定为SUMO修饰的底物。HDAC1在K444和K476上被SUMO化，其突变体降低HDAC1的转录抑制活性[97]。DNA甲基转移酶DNMT3a的SUMO修饰破坏其与HDAC1/2的结合，从而抑制其功能[130]。组蛋白H3的甲基转移酶Ezh2能发生SUMO修饰，但其功能尚不清楚[121]。此外，一些SUMO路径的组分，如26 华东师范大学博士学位论文SENP1和UBC9本身就是染色质重塑复合体的一部分[131]。综上，SUMO修饰通过调节染色质重塑因子及其复合物的活性，从而实现转录激活或沉默调控。1.7.4SUMO修饰与转录调控SUMO修饰底物包含多种转录相关蛋白，例如转录因子、共激活子和共抑制子，通过抑制转录，参与基因表达的调节[132]。共阻遏物N-CoR的抑制功能，通过其K152，K1117和K1330的SUMO修饰而增强[133]，而P300依赖性转录激活通过SUMO修饰被抑制[134]。此外，还有许多TFs的活性受SUMO修饰调控，其中大多数被SUMO共价结合所抑制。然而，在芽殖酵母中，SUMO修饰能有效地将RNApolII招募至需表达的基因处，从而调控相应的诱导型基因的激活或失活[135,136]。此外，几个全基因组ChIP研究表明，SUMO在酵母和人类中都存在于许多组成型基因的启动子上，包括核糖体蛋白基因[137-139]。目前参与转录的蛋白质（如转录因子等）的SUMO修饰已被广泛报道[62,140-142]。我们课题组在SUMO介导转录抑制的分子机制这一课题中研究发现,PIAS1可以介导CDK9发生SUMO修饰，从而抑制其与CyclinT1形成p-TEFb磷酸化酶活复合体，导致RNApolIISer2号位的磷酸化水平降低，抑制转录延伸。同时，c-MYC作为转录延伸的激活因子，可以拮抗CDK9的SUMO修饰，从而实现转录调控的一个平衡。根据已有研究，我们归纳出SUMO修饰调控转录的分子机制包括以下几点：1）SUMO修饰会占据底物蛋白上赖氨酸残基，从而使靶蛋白失去DNA结合能力；2）SUMO修饰导致转录因子的构象改变，从而抑制其转录活性；3）SUMO修饰导致转录因子定位改变，从而抑制其转录活性；4）SUMO与DNA序列相结合，导致转录因子不能结合到DNA相应位置上，从而抑制转录；5）转录因子发生SUMO修饰后，可能会招募转录共抑制因子进而抑制转录；6）CDK9的SUMO修饰导致RNApolII丝氨酸2号位磷酸化降低，抑制转录延伸，从而抑制整体转录；7）组蛋白去乙酰化酶（HDACs)发生SUMO修饰后，增强其去乙酰化酶活性，导致组蛋白乙酰化降低，从而抑制整体转录。27 华东师范大学博士学位论文1.7.5SUMO修饰与泛素生物学功能相关性蛋白质SUMO化和泛素化都发生在Lys氨基酸残基，在靶蛋白质上甚至会发生竞争性修饰。SUMO修饰往往增加蛋白的稳定性，如在胚胎和生殖细胞发育期间，Oct4的SUMO化显著提高Oct4稳定性和与DNA的结合能力[143]。一些蛋白质可以同时发生SUMO或泛素修饰，介导不同甚至相反的调控作用。例如，SENP1在通过调节HIF1α稳定性在缺氧反应的调控中起关键作用，在该调控过程中，HIF1α的SUMO化可以作为VHL的泛素依赖性降解的直接信号[144]。当暴露于三氧化二砷时，早幼粒细胞白血病蛋白（PML）可以被SUMO化和泛素化。亨廷顿蛋白（HTT）蛋白的致病片段，可以在相同的Lys残基处被SUMO-1和泛素修饰，SUMO化增加神经变性，而其泛素化在亨廷顿疾病模型中降低神经变性[145]。PCNA能发生泛素化和SUMO修饰以响应DNA损伤[146]。SUMO修饰已被证明在大多数情况下与普遍的Lys残基泛素化相互作用，另一方面，SUMO修饰也与泛素化协同调节生物化学功能。1.8SUMO修饰与疾病的相关性（图1.8）1.8.1SUMO修饰与肿瘤SUMO修饰与肿瘤发生发展、治疗及预后是目前研究的热点。鉴于SUMO修饰对于所有细胞是必需的，SUMO修饰路径各组分的功能缺失性突变不可能是导致肿瘤性疾病发生的机制。肿瘤的发生通常与细胞的异常转录和翻译水平相关，这其中又包含了癌基因的激活和抑癌基因的失活。从蛋白表达水平上，SUMO修饰的E1，E2和E3几乎在所有肿瘤中高表达[147]。例如，在腺癌和卵巢癌细胞中，UBC9的表达上调；在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌中,PIAS3也有不同程度的表达上调[147]；在肝细胞癌患者的癌组织中，SAE1/2的表达显著上调[148]。肿瘤的发生与SUMO修饰的底物蛋白密切相关。例如，SUMO化的MAFB通过细胞周期调控促进结直肠癌发生[149]。在肿瘤中过表达的SUMO以及SUMO修饰相关酶，增加SUMO缀合物能力。然而，SUMO修饰水平增加常常28 华东师范大学博士学位论文与肿瘤不良预后相关[150,151]。目前在体外和体内模型中，一些抑制整体SUMO修饰的小分子化合物已显现出运用前景。例如，在急性粒细胞性白血病（AML）移植瘤的小鼠模型中，E1的小分子抑制剂漆树酸可降低其对化疗药物的耐药性[152]。目前，针对SENPs活性的一些抑制剂存在非特异性，但在依赖SENPs活性的一些肿瘤中，如前列腺癌、乳腺癌和胃癌等，可能具有应用前景。也有观点认为，针对某一关键分子SUMO修饰的靶向调控，相比于针对整体SUMO修饰的靶向治疗可能是一种更加优异的治疗方式。因此，阐明SUMO修饰在肿瘤发生发展中的作用机制，探索针对SUMO系统的特异性小分子化合物，有望为临床提供新的治疗方式。图1.8SUMO修饰与疾病的相关性[19]1.8.2SUMO修饰与心脏疾病SUMO化和去SUMO化的平衡对于正确的心脏发育、新陈代谢和压力适应十分重要[153-155]，SUMO化或许能成为治疗心脏疾病的一大突破口。UBC9介导的SUMO化的增加，或许能作为增加自噬通量和改善蛋白毒性心脏病发病率的新策略[154]。UBC9/PML/RNF4（SUMO靶向的泛素连接酶）通路在心脏纤维化中起着重要作用，通过调节信号通路为心脏纤维化和心力衰竭的治疗提供潜29 华东师范大学博士学位论文在的治疗靶点[155]。1.8.3SUMO修饰与神经退行性疾病神经退行性疾病通常与异常蛋白质聚集体和毒性蛋白质聚集体的形成有关，这被认为是神经退行性疾病发生和发展的主要因素。越来越多的证据表明，SUMO化对神经元的干扰，促成了许多病理状况和神经疾病[156-158]。例如，已知HTT蛋白质修饰异常与霍廷顿氏病（Huntington’sdisease,HD）相关。HTT的致病性片段的赖氨酸残基被SUMO-1修饰，增加HD模型中的神经元变性。另外，HTTSUMO化抑制了泛素-蛋白酶体途径的降解，导致HTT的积累，最终导致霍廷顿氏病[145]。此外，在大脑中高度表达并与帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）相关的α-突触核蛋白，可被SUMO-1修饰[159]。阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种年龄依赖性，进展性的神经退行性疾病，其特征在于淀粉样蛋白-β（amyloid-b,Aβ）斑块形成和由过度磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结。SUMO-1修饰可以稳定阿尔茨海默β-分泌蛋白BACE1，从而促进Aβ的产生[160]。tau蛋白既能发生SUMO化也能发生泛素化，其SUMO化修饰与AD的发展有关[161,162]。1.8.4SUMO修饰和与免疫性疾病SUMO调控多种参与内在免疫和先天免疫的宿主蛋白，从而有助于调控病毒感染期间干扰素的产生[163,164]。对于DNA病毒，SUMO化促进DNA传感器cGAS和衔接子STING的稳定性，从而调节其对DNA病毒的应答动力学[165,166]。SUMO修饰是TANK结合激酶1（TBK1）的一种新发现的蛋白质翻译后修饰，其激酶活性依赖于SUMO-1或SUMO-2/3的结合。K694上的SUMO修饰促进TBK1的抗病毒功能，而病毒蛋白Gam1拮抗这种翻译后修饰[163]。另一项研究证实，SUMO-1是炎症性乳腺癌发生的关键基因[163]。TRIM38作为泛素E3或SUMOE3，靶向关键的细胞信号传导分子，调节先天性免疫和炎症反应[167]。NEMO作为NF-kB的必需分子，其SUMO化增强NF-kB活性，促使NF-kB依赖性细胞因子的产生和胰腺炎症产生[168]。总之，深入的研究30 华东师范大学博士学位论文SUMO修饰，对于开发潜在的治疗策略至关重要。综上所述，以及我们前期的课题研究的积累，我们知道SUMO修饰抑制转录，其抑制转录的一大分子机制为HDAC1/2的SUMO修饰显著增强其组蛋白去乙酰化酶活性，使组蛋白乙酰化水平降低，染色质浓缩，从而抑制整体转录。这些带给我们新的思考，HDAC1/2SUMO修饰后其组蛋白去乙酰化酶活性增强的具体机制是什么？SENPs家族蛋白中哪些成员能够去除HDAC1的SUMO修饰？SENPs蛋白去除HDAC1/2的SUMO修饰，是否影响其去乙酰化酶活性，从而影响整体转录水平？这些问题都值得我们开展进一步的研究。31 华东师范大学博士学位论文第二章实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验细胞系HEK293Tcellline：人胚肾细胞系培养条件为：DMEM基本培养基+10%胎牛血清+1%的双抗培养HeLacellline：人宫颈癌细胞系培养条件为：DMEM基本培养基+10%胎牛血清+1%的双抗培养A549cellline：人肺癌细胞系HCT116cellline：结肠癌细胞系培养条件为：5A培养基+10%胎牛血清+1%的双抗培养2.1.2原核细菌DH5α感受态细胞：用于质粒扩增（天根生物公司）Top10感受态细胞：用于质粒扩增（天根生物公司）BL21感受态细胞：用于质粒扩增（天根生物公司）2.1.3质粒信息（一）原核表达载体：PGEX-4T1：构建蛋白的N端含有一个GST标签，构建了GST-SUMO-1/2/3，GST-Ubc9，GST-WDR5，用来纯化相应蛋白。（二）真核表达载体：pCDNA3.0-HA/GFP/Flag载体：T7启动子，构建质粒GFP-SUMO-1，Flag-Ubc9，Flag-SUMO-1，Flag-SUMO-2，Flag-SUMO-3，HA-CyclinT1，HA-SENP1，HA-SENP2，HA-SENP3，HA-SENP5，HA-SENP6，HA-SENP7a，HA-SENP7b，GFP-SENP1，GFP-SENP2，GFP-SENP3，GFP-SENP5，GFP-SENP6，GFP-SENP7a，GFP-SENP7b。pCDNA3.1-3×Myc载体：32 华东师范大学博士学位论文CMV启动子，构建质粒3×Myc-HDAC1，3×Myc-HDAC2。p3×Flag载体：CMV启动子，构建质粒Flag-HDAC1，Flag-HDAC2，Flag-SUMO-1，Flag-SUMO-1-HDAC1，Flag-SUMO-2-HDAC1，Flag-SUMO-1-HDAC2，Flag-SUMO-2-HDAC2。（三）shRNA表达载体：pLKO.1-PURO载体：含有嘌呤霉素抗性，U6启动子，构建质粒Ubc9shRNA，SENP6shRNA。pLKO.1-GFP载体：带有绿色荧光蛋白，U6启动子，构建质粒Ubc9shRNA，SENP6shRNA。2.1.4实验仪器名称品牌名称品牌细胞培养箱Thermo37℃恒温细菌培养箱上海精宏倒置显微镜OlympusTHZ-100恒温摇床上海一恒离心机Eppendorf超声仪宁波新芝4℃离心机BeckManScientz-10N冷冻干燥机宁波新芝制冰机SANYO落地式离心机耐圣卡兰-80℃冰箱ThermoUV-2000紫外凝胶成像仪上海天能紫外分光光度计Thermo紫外交联仪宁波新芝PCR仪Bio-RAD垂直电泳仪上海天能-20℃冰箱海尔公司转膜仪上海天能4℃冰箱海尔公司细胞冻存管Thermo液氮罐成都金凤25/75cm2细胞培养瓶WHB电热恒温水槽上海精宏6/10cm细胞培养皿WHB电子天平上海精宏15/50mL离心管WHB超净工作台东联电子5/10mL移液管WHB33 华东师范大学博士学位论文HZQ-C振荡器东联电子1mL/200μL/10μLTipsQSP涡旋振荡器上海琪特1mL/200μL/10μL移液枪Eppendorf2.1.5实验试剂2.1.5.1细胞培养试剂名称品牌名称品牌DMEM培养基GBICODMSOSigmaRPMI-1640培养基GBICOLipo2000invitrogen1XPBSGBICOC-Lipo南京慧基0.25%胰酶上海源培B-LipoBiotoolPS（双抗）Millipore4%多聚甲醛生工生物胎牛血清GEMINITrizolTakaraOpti-mumGBICO2.1.5.2大肠杆菌培养试剂胰蛋白胨（OXOID）酵母粉（OXOID）琼脂粉（OXOID）氯化钠（上海强顺化学）氨苄霉素（Amresco）卡那霉素（Amresco）2.1.5.3分子生物学试剂名称品牌名称品牌菌检PCRmixBiotekeDNA聚合酶KODFXToyoboAPS上海鼎国DNA聚合酶KODplusNeoToyoboTEMED上海鼎国蛋白酶抑制剂PIcocktailBiotoolSDS上海鼎国Tris-SDS(pH6.8)分离胶缓冲液生工生物DTTAmrescoTris-SDS(pH8.8)浓缩胶缓冲液生工生物34 华东师范大学博士学位论文PMSFAmresco30%聚丙烯酰胺生工生物NC膜QIAGEN逆转录试剂盒全式金生物GSTbeadsGE凝胶回收试剂盒BiotekeProteinABiotoolPCR产物纯化试剂盒天根生物M2beadsBiotool质粒小提试剂盒天根生物HAbeadsBiotool质粒大提试剂盒天根生物MycbeadsBiotool2×Q-PCRmix全式金生物siRNA序列吉玛分子克隆引物LifeDAPISigmashRNA序列Life2.1.5.4抗体信息名称品牌及货号名称品牌SUMO1SantaCruz,#sc-5308HAAbmart#M2003SUMO1ABclonal,A2130GFPAbmart#M2004LSUMO2/3CST,#4971SFlagSigma#F7425HistoneH3Huaan#M130918MycAbmart#M2002HistoneH4Proteintech#16047-1HDAC1ABclonal#A0238AcH4Millipore#05-1355HDAC2ABclonal#A2084AcH3实验室自制兔多抗Sin3AABclonal#A1577RbAp46ABclonal#A6967Sin3ASantaCruz,#sc-767RbAp46SantaCruz,#sc-82722.1.6引物序列2.1.6.1PCR引物序列HindⅢ-HDAC1-FTATAAGCTTATGGCGCAGACGCAGGGCACBamHI-HDAC1-RTATGGATCCTCAGGCCAACTTGACCTCCTEcoRI-HDAC2-FTATGAATTCAATGGCGTACAGTCAAGGAGGBamHI-HDAC2-RTATGGATCCTCAAGGGTTGCTGAGTTGTT35 华东师范大学博士学位论文HindⅢ-SUMO1-FTATAAGCTTATGTCTGACCAGGAGGCAAANotI-SUMO1-RGTCGCGGCCGCAACTGTTGAATGACCCCCCGHindⅢ-SUMO2-FTATAAGCTTATGGCCGACGAAAAGCCCAANotI-SUMO2-RGTCGCGGCCGCGTAGACACCTCCCGTCTGCTXbaI-HDAC1-FTATTCTAGAATGGCGCAGACGCAGGGCACBamHI-HDAC1-RGCTGGATCCTCAGGCCAACTTGACCTCCTUBC9-BamHI-FTTGGATCCATGTCGGGGATCGCCCUBC9-XhoI-RTTCTCGAGTTATGAGGGCGCAAACTSENP1-EcoRI-FCCGAATTCAATGGATGATATTGCTGSENP1-KpnI-RCCGGTACCTCTCACAAGAGTTTTCGSENP2-EcoRI-FCCGAATTCAATGTACAGATGGCTSENP2-KpnI-RCCGGTACCTCTCACAGCAACTGCSENP3-NotI-FAAGCGGCCGCAATGAAAGAGACTATASENP3-BamHI-RCCGGATCCTCTCACACAGTGAGTSENP5-NotI-FAAGCGGCCGCAATGAAAAAACAGSENP5-BamHI-RCCGGATCCTCTCAGTCTCAGTCCATGAGCSENP6-NotI-FAAGCGGCCGCAATGGCGGCCGGCAASENP6-BamHI-RCCGGATCCTCTCAATCTGAGATACTSENP7a/b-NotI-FAAGCGGCCGCAATGGACAAGAGAASENP7a/b-KpnI-RAAGGTACCCTAGCTACTGCTGCCCSENP1-EcoRI-FCGGGAATTCTGATGGATGATATTGCTGATAGGSENP1-NotI-RTAAGCGGCCGCTCACAAGAGTTTTCGGTGGASENP2-EcoRI-FCGGAATTCTGATGTACAGATGGCTGGTTAGSENP2-NotI-RTAAGCGGCCGCTCACAGCAACTGCTGATGAASENP3-BamHI-FTCGGATCCATGAAAGAGACTATACAAGGG36 华东师范大学博士学位论文SENP3-NotI-RTAAGGCGGCCGCTCACACAGTGAGTTTGCAGSENP5-BamHI-FCGGGGATCCATGAAAAAACAGAGGAAAATSENP5-XhoI-RTAACTCGAGTCAGTCCATGAGCCGGCACTSENP6-BamHI-FTAAGGATCCATGGCGGCCGGCAAGAGCGGSENP6-NotI-RTGGCGGCCGCTCAATCTGAGATACTATTGASENP7a/b-NotI-FTCGCGGCCGCTATGGACAAGAGAAAGCTCGGSENP7a/b-ApaI-RTAGGGCCCCTAGCTACTGCTGCCCTTCT2.1.6.2siRNAs,shRNAs引物序列NCsiRNAUUCUCCGAACGUGUCACGUUBC9siRNA#1GAGGAAAGCAUGGAGGAAAUUUBC9siRNA#2CCAUCUUAGAGGAGGACAAUUUBC9siRNA#3GGGAAGGAGGCUUGUUUAAUUSiRNA-Senp6GACUUAACAUGUUGAGCAAUUSiRNA-Senp2GGGAGUGAUUGUGGAAUGUUUSiRNA-Senp3GCUUCCGAGUGGCUUAUAAUUshUBC9-15’-CCGGAGCAGAGGCCTACACGATTTACTCGAGTAAATCGTGTAGGCCTCTGCTTTTTTG3’-AATTCAAAAAAGCAGAGGCCTACACGATTTACTCGAGTAAATCGTGTAGGCCTCTGCTshUBC9-25’-CCGGAGAAGTTTGCGCCCTCATAAGCTCGAGCTTATGAGGGCGCAAACTTCTTTTTTG3’-ATTCAAAAAAGAAGTTTGCGCCCTCATAAGCTCGAGCTTATGAGGGCGCAAACTQTCTshSENP6-15’-CCGGGGGTGATAAAGCCTGTAAATTCTCGAGAATTTACAGGCTTTATCACCCTTTTTG3’-AATTCAAAAAGGGTGATAAAGCCTGTAAATTCTCGAGAATTT37 华东师范大学博士学位论文ACAGGCTTTATCACCC2.1.6.3RT-qRCR引物序列Senp6-Qpcr-FGCTGTAATTGATTCCAATCCSenp6-Qpcr-RAGTCAATCTGAGATACTATTGACAChSET1B-Qpcr-FACCCAACTCCTATGGACAGGGhSET1B-Qpcr-RGCTGAAGAGGTATGAGGGTGThSET1A-Qpcr-FTTGCCATGTCAGGTCCAAAAAhSET1A-Qpcr-RCGTACTTACGGCACATATCCTTChGAPDH-Qpcr-FGGAGCGAGATCCCTCCAAAAThGAPDH-Qpcr-RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGHDAC1-Qpcr-FCTACTACGACGGGGATGTTGGHDAC1-Qpcr-RGAGTCATGCGGATTCGGTGAGHDAC2-Qpcr-FATGGCGTACAGTCAAGGAGGHDAC2-Qpcr-RTGCGGATTCTATGAGGCTTCA2.1.7相关实验试剂的配制2.1.7.1细胞培养基配制基本培养基500mL胎牛血清（FBS）终浓度10%双抗（青霉素+链霉素）终浓度1%2.1.7.2细菌培养基、相关抗生素配制蛋白胨酵母粉氯化钠琼脂粉2×YT培养基（1L）16.5g10g5g0gLB液体培养基（1L）10g5g5g0gLB固体培养基（1L）10g5g5gNacl15g氨苄霉素（10mL）Q水配制，母液100mg/mL，1:1000稀释使用卡那霉素（10mL）Q水配制，母液50mg/mL，1:1000稀释使用38 华东师范大学博士学位论文2.1.7.3分子克隆相关试剂配制100𝛍MPCR引物：12000rpm，3min条件下，将引物粉末离心，后向EP管中加入Q水（体积=引物干粉nmol数*10），溶解后即得到100μM的引物。注意：PCR扩增时，所需引物浓度10μM。oligo退火，所需引物浓度100μM。RNA抽提用75%乙醇：30mL无水乙醇+10mLDEPC水，混匀即可。50×TAE(1L)：57.1mLaceticacid+242gTris+18.61gNa2EDTA.2H2O2.1.7.4WesternBlot相关试剂配制Buffer名称配方10×RunningBuffer(1L)30.2gTris+188gGlysine+10gSDS10×TransferBuffer(1L)30.3gTris+144gGlysine10×PBSBuffer(1L)36.3gNa2HPO4.12H2O+80gNaCl+2gKCl1×PBST(500mL)450mLQ水+50mL10×PBS+250μLTween20丽春红(500mL)0.5g丽春红+25mL冰醋酸胎牛血清（FBS）终浓度10%双抗（青霉素+链霉素）终浓度1%3%BSA：用于配制一抗和二抗，选用1×PBS配制。5%脱脂奶粉：用于封闭，选用1×PBS配制。WB一抗、二抗：均使用3%BSA配制。2×SDSLoadingBuffer(200mL)：甘油40mL+8gSDS+2.9gTris,加水至200mL，调pH至6.8，再加入0.08g溴酚蓝，混匀即可室温保存。使用时，现用现加β-巯基乙醇（终浓度2%）。2.1.7.5免疫染色相关试剂配制1%TritonX-100(500mL)：通透用，5mLTritonX-100+495mL1×PBS,混匀。5%BSA：用于封闭，选用1×PBS配制。0.2%PBST(500mL)：1mLTritonX-100+499mL1×PBS,混匀。IF一抗、二抗：均使用1%BSA（0.2%PBST配制）配制。39 华东师范大学博士学位论文DAPI：使用0.2%PBST进行配制，母液浓度5mg/mL，1:1000稀释使用。2.1.7.6Immunoprecipitation(免疫沉淀)相关试剂配制IPLysisBuffer:终浓度500mL所需Tris-HClpH7.550mM1M母液25mLNaCl/KCl150mM3M母液25mLTritonX-1001mM100%原液5mLEDTA1%0.5M母液0.5mL甘油8%40mL甘油DTT和PI现用现加现用现加变性IPlysisbuffer的配制，相比于非变性lysisbuffer，将1%TritonX-100换成1%SDS、150mMKCl换成150mMNaCl，即可。IPBindingBuffer：终浓度500mL所需Tris-HClpH7.550mM1M母液25mLNaCl/KCl150mM3M母液25mLTritonX-1000.1mM100%原液0.5mLEDTA1%0.5M母液0.5mL甘油8%40mL甘油DTT和PI现用现加现用现加IPWashBuffer：与IPbindingbuffer相比，甘油不需要添加，其他的各组分相同。40 华东师范大学博士学位论文2.1.7.7蛋白纯化相关试剂配制50mLBufferA:1×PBS甘油1MDTT200mMPMSF100×PIβ-巯基乙醇45mL5mL50μL25μL500μL17.5μL10mLWashingBuffer:1×PBS1MDTT200mMPMSFTritonX-100100×PIβ-巯基乙醇补齐10μL5μL5μL100μL3.5μL20mLElutionBuffer:谷胱甘肽1MTris-HclpH8.0β-巯基乙醇Q水0.12292g1mL7μL补齐至20mL最后使用1MNaOH溶液，进行pH调节至8.0。另外，1mMDTT+0.1mMPMSF+PI现用现加。配制好的ElutionBuffer可置于冰箱-20℃保存备用。1L考马斯亮蓝染液：甲醇冰醋酸R-250H2O500mL100mL2.5g400mL1L脱色液：甲醇冰醋酸H2O300mL100mL600mL2.2实验方法2.2.1分子克隆2.2.1.1原始克隆构建选取表达某目的基因丰度相对较高的细胞或组织为材料，进行总RNA的抽提。以总RNA为模板，使用反转录试剂盒反转得到cDNA。以cDNA为模板，通过PCR反应扩增得到目的基因。通过酶切和连接，将目的基因片段连接到选取的真核或者原核表达载体（带有某种标签或者抗性）上。41 华东师范大学博士学位论文1）总RNA提取（以六孔板的一个孔的细胞为例）注意：RNA易降解，抽提过程中所需试剂及枪头需保证RNA酶free。A.胰酶消化将六孔板的一个孔的细胞消化下来，收集到RNA酶free的1.5mLEP管中，4℃12000rpm,离心30秒。B.去上清，1XPBS洗一遍细胞，然后加入1mLTriozol(RNAisoPlus)，用1mL的移液枪反复吹打，直至看不到明显的细胞沉淀后静置5分钟。C.4℃12000rpm条件下离心5分钟，将上清转移至新的RNA酶free的1.5mLEP管，加入200μL氯仿，用移液枪吹打混匀后室温静置5分钟。D.4℃12000rpm条件下离心15分钟，将上清转移至新的RNA酶free的1.5mLEP管，加入等体积异丙醇，吹打混匀后室温静置10分钟。E.4℃12000rpm条件下，离心10分钟，去上清，可看到管底有白色沉淀，即为沉淀出来的总RNA,加入1mL由DEPC水配制75%乙醇，轻摇震荡清洗沉淀。F.4℃12000rpm条件下，离心5分钟，重复洗一次。用1ml移液枪吸去75%乙醇，室温干燥5分钟，加入20-30μL的DEPC水溶解即可。2）逆转录逆转录体系（20μL体系）逆转录程序TotalRNA3μg25℃10minRandomprimer/OligodT1μL42℃30min2×TsReactionmix10μL85℃5minTransScriptRT/RIenzymemix1μLgDNARemover1μLDEPC水补足20μL3）设计目的基因引物通过NCBIGene网站查询出目的基因CDS序列，用生物学软件Snapgene对该目的基因进行酶切位点分析，选取可用的酶切位点，务必确保目的基因片段42 华东师范大学博士学位论文序列内不含载体上已选择的酶切位点。【正向引物】设计原则为:3个左右的保护碱基+酶切位点序列+补齐用碱基+目的基因的正向5’→3’的20个碱基。【反向引物】设计原则为:3个左右的保护碱基+酶切位点序列+补齐用碱基+目的基因的反向5’→3’的20个碱基。备注：上述引物设计，是针对tag设计在目的基因N端的载体。如果是tag设计在目的基因的C端的载体，设计反向引物是时，首先务必关注反向引物是否会移码，进而采取是否添加碱基，其次要去掉目的基因的终止密码子。3）PCR扩增PCR体系（50μL体系）PCR程序KOD-plus-neo1μL预变性94℃3min循10×KODplusneobuffer5μL变性94℃30s环2525mMMg2+3μL退火58℃30sI342mMdNTP5μL延伸68℃1Kb/min次10μMForwardprimer2μL再延伸68℃10min10μMRerverseprimer2μL14℃ForeverTemplate80ngQ水补足50μLPCR扩增步骤结束后，从50μLPCR产物中取3μL进行凝胶电泳，观察并分析目的基因的扩增情况。（可选，以便实验不成功时查找问题。）4）PCR产物纯化A.吸附柱平衡：向每个吸附柱加500μL的平衡液，常温条件下12000rpm离心1分钟，倒掉平衡液，柱子备用。B.取一只新的1.5mlEP管，将PCR产物移至其中，然后加5被提及的结合液PB，用移液枪吹打混匀后转移至吸附柱中，之后在转速12000rpm条件下离心1分钟过柱，倒掉废液。43 华东师范大学博士学位论文C.重复步骤B。D.向吸附柱中加入漂洗液PW600μL，在转速12000rpm条件下离心1分钟过柱，倒掉废液。E.重复步骤D，12000rpm条件下，吸附柱空离2分钟。F.室温静置5分钟晾干，加入60μLQ水，室温静置2分钟（时间越长，越有利于洗脱）浸泡吸附柱。G.转速12000rpm条件下，离心2分钟，将从吸附柱上洗脱下来的DNA片段进行收集。纯化步骤结束后，可取其中3μLPCR纯化产物，进行琼脂糖凝胶电泳实验，观察和分析PCR产物纯化是否成功。（可选，以便实验不成功时查找问题。）5）酶切酶切PCR纯化产物（50μL体系）酶切载体（50μL体系）PCR纯化产物40μL载体3-5μg10×NEBbuffer5μL10×NEBbuffer5μLNEBE11.5μLNEBE11.5μLNEBE21.5μLNEBE21.5μLQ水2μLQ水补齐50μL酶切条件：37℃，酶切时长3-4h6）DNA切胶回收A.向上一步50μL酶切产物中加入5.5μL10×DNAloadingbuffer,震荡混匀后离心，全部用于琼脂糖凝胶电泳。B.紫外割胶仪中割胶，切割下来的凝胶放入2mL离心管，并加入600μL溶胶液DB，置于65℃水浴锅中，放置一段时间（10分钟左右即可），凝胶完全溶解，取出冷却。C.将混合液转移至硅胶柱中，静置1分钟,转速12000rpm条件下，离心1分钟。离心下去的混合液再重复过柱一次。44 华东师范大学博士学位论文D.弃废液，向每个硅胶柱加600μL漂洗液PW，转速12000rpm条件下,离心1分钟。重复一次。E.弃废液，转速12000rpm条件下空离心2分钟。室温晾干5分钟，然后向每个硅胶柱样加40μLQ水，溶解即得到DNA切胶回收产物。DNA切胶回收步骤结束后，可取出3μL切胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，观察和分析DNA切胶回收步骤是否成功。（可选，以便实验不成功时查找问题。）7）连接10μL连接体系（1.5mLEP管）T4Ligase1μL10×T4ligasebuffer1μL目的基因片段5μL载体片段3μL在16℃温度下，静置连接4h或过夜。8）转化A.向连接产物中加入30μLDH5α感受态细胞，轻弹混匀后冰浴30分钟。B.然后42℃水浴锅内热激90秒,再次冰浴5分钟。C.加入500μL2×YT空白培养基，然后放置于37℃，200rpm摇床上复苏培养1-3h，然后全部用于涂板（注意抗性，如氨苄霉素或者卡那霉素）。D.平板倒置放在37℃培养箱中，培养16h左右后会看到菌落形成。9）菌落PCR鉴定阳性克隆A.通常每个平板挑选3个克隆即可。对6只灭菌的1.5mLEP管进行编号1、2、3，每个管中加入10μLQ水，注意要加到管底。B.用10μLtip头在平板上挑菌，每挑取一个克隆，即放入一只含有Q水的EP管，震荡数秒使菌落在Q水中散开均匀分布。PCR时，从每个10μL的菌落混合液中取1μL，即可作为PCR模板使用。45 华东师范大学博士学位论文C.菌落PCR体系和程序PCR体系（15μL体系）PCR程序2×Biotekepowerfulmix7.5μL预变性94℃3min10μMForwardprimer1.5μL变性94℃30s循10μMRerverseprimer1.5μL退火58℃30s环25次Template1μL延伸72℃1Kb/minQ水4μL再延伸72℃10min14℃ForeverD.将PCR产物进行DNA凝胶电泳实验，观察和分析结果鉴定阳性克隆。根据鉴定结果挑选出对应编号的的阳性克隆剩余菌液（9μL），然后接种到含相应抗性的2×YT培养基中，37℃，220rpm转速条件下扩菌16h。9）质粒小提A.收菌：用2mL离心管将菌液分装，转速12000rpm条件下离心2分钟。B.重悬：向收集的大肠杆菌沉淀中加250μL的已加RNAaseP1溶液，Vortex充分形成菌落悬液。C.裂解：再向每个EP管中加入250μL的P2（含有NaOH和SDS），上下颠倒离心管6-8次以便充分混匀，室温静置裂解2分钟。D.核酸复性：再向每个EP管中加入350μL的P3溶液，上下颠倒离心管6-8次以便充分混匀，室温静置1分钟使核酸充分复性。E.转速12000rpm条件下，离心10min，会看到白色的沉淀和透明上清液。F.平衡硅胶柱：每个硅胶柱加BL平衡液500μL，转速12000rpm条件下离心1分钟，倒出收集管中的平衡液。G.将步骤E中的上清液用平衡好的硅胶柱离心过柱，过柱前室温静置1分钟以便于质粒被充分吸附。将收集管中的上清液倒回柱内，重复过柱。H.弃去收集管中的上清，每个硅胶柱内加650μLPW漂洗液，转速12000rpm条件下离心1分钟，弃去收集管中的漂洗液。重复一次。空离心246 华东师范大学博士学位论文分钟。I.取出硅胶柱放入新的1.5MlEP管中，室温下开盖晾干5分钟。每个加100μL洗脱缓冲液EB或Q水，室温静置5分钟。J.转速12000rpm条件下，离心2分钟，将收集的洗脱液吸回吸附柱，重复洗脱一次。K.使用Nannodrop仪器测量所得质粒的浓度。10）测序每个样品取10μL送测序公司进行测序，测序结果回来后与目的基因序列进行序列比对，更进一步鉴定阳性克隆。11）质粒大提将测序鉴定得到的阳性克隆，重新摇菌，进行质粒大抽。A.小摇：取15mL离心管编号，加入4mL含有相应抗性的2×YT培养基，挑单克隆接种，37℃转速220rpm条件下摇菌12h。B.大摇：准备灭菌的500mL锥形瓶，加入200mL2×YT抗性培养基，将第一步的小摇菌液接种进去，37℃转速220rpm条件下摇菌12h。C.收菌：将菌液倒入50mL离心管中，转速8000rpm条件下离心3分钟。200ml菌液需分5-6次进行收集。此步也可选用500mL收集瓶进行收菌。D.向每个样品菌中，加入含RNaesA的P1溶液8mL，借助震荡仪或用1mL枪头吹打等方式将菌充分重悬。E.向上一步的重悬菌液中加8mLP2溶液，上下颠倒离心管6-8次以便充分混匀，然后室温静置5分钟以便充分裂解菌体，呈透明粘液状。F.向上一步裂解菌液中加8mLP4溶液，上下颠倒离心管6-8次以便充分混匀，可看到白色分散絮状沉淀，然后室温静置10分钟。G.静置期间，每个硅胶柱CP6加2.5mL平衡液BL，转速8000rpm条件下离心2分钟，完成硅胶柱的平衡。47 华东师范大学博士学位论文H.将步骤F中的样品在转速8000rpm条件下离心10分钟。I.将上一步得到的上清液转移至过滤器CS1中，进行过滤到预先准备好的洁净的50mL离心管中。然后加入异丙醇（0.3倍体积）充分混匀，室温条件下静置1分钟。J.将上一步中的混合液转移到前面步骤中平衡好的硅胶柱中，转速8000rpm条件下离心2分钟，需分几次进行离心过柱。可重复过柱以增加质粒得率。K.弃上清，向硅胶柱中加漂洗液（PW）10mL，转速8000rpm条件下离心2分钟，弃收集管中的漂洗液。重复一次。L.向漂洗后的硅胶柱中加3mL无水乙醇，然后再转速8000rpm条件下离心2分钟，弃收集管中的无水乙醇。空离5分钟后取出CP6，开盖并室温条件下晾干5分钟。M.将晾干后的硅胶柱放入新的收集管，向每个硅胶柱加1mLElutionbuffer，室温静置10分钟充分溶解硅胶柱上吸附的质粒。N.转速8000rpm条件下离心2分钟，收集管中即为抽提的质粒。第一次洗脱后，可以向硅胶柱中再次加入Elutionbuffer，进行第二次洗脱，然后第三次洗脱。2.2.1.2亚克隆构建与以上原始克隆构建步骤相比，亚克隆构建过程中的PCR模板是含有目的基因的质粒，区别于原始克隆构建的PCR扩增所需要的totalRNA反转录得到的cDNA。2.2.1.3shRNA构建1）通过文献和sigma等网站查找得到目的基因的shRNA序列。当然，也可以根据shRNA设计原则自行设计。2）通常选用载体plko.1-puro/GFP，有两种：一种具有Puro抗性，另一种带有GFP绿色荧光蛋白标签。但这个载体比较特别，可用的酶切位点只有AgeⅠ48 华东师范大学博士学位论文和EcoRⅠ两个。所以在shRNA序列合成时要注意，两端要添加AgeⅠ酶切位点粘性末端序列（5’-CCGG-3’)和EcoRⅠ酶切位点粘性末端序列（3’-TTAA-5’）。3）Oligo退火oligo退火体系（50μL体系）退火程序100μMshRNAForwardprimer5μL95℃5min100μMshRNAReverseprimer5μL70℃10min10×NEBBuffer25μL自然降温至室温即可Q水35μL4）酶切载体酶切载体（50μL体系）plko.1-puro/GFP3-5μg10×NEBbuffer5μLAgeⅠ(NEB)1.5μLEcoRⅠ(NEB)1.5μLQ水补齐50μL酶切条件：37℃，酶切时长3-4h。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收试剂盒进行酶切后载体片段回收。5）连接10μL连接体系（1.5mLEP管）T4Ligase1μL10×T4ligasebuffer1μLshRNAoligo5μL酶切后纯化的plko.1-puro/GFP3μL在16℃温度下，静置连接4h或过夜。6）之后的【转化】→【复苏】→【涂板】→【菌检】→【测序】等一些步骤，与原始克隆构建和亚克隆构建过程中步骤相同。49 华东师范大学博士学位论文2.2.1.4质粒定点突变构建1）引物设计根据密码子表，将目的基因的突变点原有的氨基酸密码子更换为目标氨基酸密码子，然后以突变点为起点向上下游各选取15bp，即“上游15bp+突变密码子+下游15bp”的形式，共33bp左右即为正向引物。正向引物的完全互补序列为反向引物序列。注意：正反向引物合成时，要按照5’→3’的方向来写。同时，引物序列内的GC含量尽可能控制在40%-60%，以便后续的PCR扩增。2）PCR扩增PCR体系（25μL体系）PCR程序KOD-plus-neo1μL预变性94℃3min循10×KODplusneobuffer2.5μL变性94℃30s环2525mMMg2+1.5μL退火58℃30sI342mMdNTP2.5μL延伸68℃1Kb/min次10μMForwardprimer1.5μL再延伸68℃10min10μMRerverseprimer1.5μL14℃ForeverTemplate80ngQ水补足25μL3）从25μLPCR产物中取3μL进行凝胶电泳，观察并分析PCR扩增情况。（可选，以便实验不成功时查找问题。）4）DpnⅠ酶消化：DpnⅠ酶可以切割PCR产物留下的具有甲基化的模板质粒DNA，以减少后续的假阳性克隆。处理为向余下的PCR产物中加入1μLDpnⅠ和2.4μLNEBcuttersmartbuffer，在37℃水浴锅中消化2h。5）从消化后的PCR产物中取6-7μL出来，进行后续的【转化】→【复苏】→【涂板】→【菌检】→【测序】等一些步骤，参考原始克隆构建和亚克隆构建过程中步骤。50 华东师范大学博士学位论文2.2.2细胞培养1）细胞传代以10cmdish的HCT116细胞传代为例，在显微镜下观察到细胞长满后，拿到超净台，用吸引器吸去培养基，加入1.5mlPBS轻柔清洗后用吸引器吸走，加入1.5ml0.25%胰酶，放入37℃培养箱中，定timer60s后，在显微镜下观察到细胞变圆、浮起、脱落。加入3ml培养基，终止消化，用巴氏吸管轻轻将细胞吹打下来，收集在15ml离心管内。离心机700rpm配平离心3min后取出，倒上清，用1ml新鲜DMEM重悬，接种至新皿中。2）细胞冻存A.提前配制冻存液：0.5mlDMSO和4.5ml培养基混匀（1:9）。B.提前将冻存盒置于37℃水浴锅中，检查冻存盒内异丙醇是否足够。C.将需冻存的细胞消化离心后，用步骤A中配制的冻存液重悬，分装至冻存管中。D.将冻存管放入温度为常温的冻存盒内，盖紧盖做好标注，放入-80℃冰箱。E.次日取出，转移至液氮罐内。3）细胞复苏A.在细胞房超净台中提前准备好已预热的培养基，取6ml加入15ml离心管中备用。B.遵循“速融”原则，从液氮罐中取出细胞后快速放入37℃水浴锅中，手捏顶部不断在水中摇晃.C.管中液体完全融化后，拿到超净台中将解冻的细胞液加入步骤A中备好的离心管中，离心机700rpm离心180s。D.倒掉上清，用移液枪尽可能的吸去上清，加入1ml培养基，用移液枪轻柔的反复吹打重悬10次左右。E.取6cmdish，加入4ml培养基，将步骤D中的重悬液加入皿内，轻轻摇匀，放入培养箱内。51 华东师范大学博士学位论文2.2.3蛋白质印迹（WesternBlot）1）制备样品（以6孔板的一个孔的细胞为一个样品）转染质粒48h后，将六孔板取出，用1XPBS轻轻清洗细胞3次，吸干PBS，然后每孔加150μL细胞裂解液，脱色摇床上100rpm震荡5分钟至裂解液与细胞充分混匀，冰上静置裂解30分钟，收集至1.5mL离心管中，转速12000rpm4℃条件下，离心15分钟。转移上清至新的离心管，然后加入等体积的2×SDS-Loadingbuffer，vertex震荡混匀后，插入100℃金属浴相应的孔内加热变性10分钟，转速12000rpm条件下离心3分钟，即获得WB样品。同时，也可直接采用SDS-Loadingbuffer裂解法。转染质粒48h后，将六孔板取出，用1XPBS轻轻清洗细胞3次，吸干PBS，然后每孔加150μL2×SDS-Loadingbuffer，vertex震荡混匀后转移至1.5ml离心管，超声仪中选用直径2mm超声探头，200W功率超声4次（打断Chromatin），插入100℃金属浴相应的孔内加热变性10分钟，转速12000rpm条件下离心3分钟，即获得WB样品。2）SDS-PAGE凝胶电泳SDS-PAGE胶配方：SeparatingGel配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积成分5ml10ml15ml20mlH2O2.72ml5.44ml8.16ml10.88ml30%丙烯酰胺混合液(1:29)1ml2ml3ml4ml6%4×Tris-Cl/SDSpH8.81.25ml2.5ml3.75ml5ml10%APS20ul40ul60ul80ulTEMED10ul20ul30ul40ulH2O2.42ml4.74ml7.16ml9.58ml30%丙烯酰胺混合液(1:29)1.3ml2.7ml4ml5.3ml8%4×Tris-Cl/SDSpH8.81.25ml2.5ml3.75ml5ml10%APS20ul40ul60ul80ul52 华东师范大学博士学位论文TEMED10ul20ul30ul40ulH2O2.02ml4.14ml6.16ml8.18ml30%丙烯酰胺混合液(1:29)1.7ml3.3ml5ml6.7ml10%4×Tris-Cl/SDSpH8.81.25ml2.5ml3.75ml5ml10%APS20ul40ul60ul80ulTEMED10ul20ul30ul40ulH2O1.72ml3.44ml5.16ml6.88ml30%丙烯酰胺混合液(1:29)2ml4ml6ml8ml12%4×Tris-Cl/SDSpH8.81.25ml2.5ml3.75ml5ml10%APS20ul40ul60ul80ulTEMED10ul20ul30ul40ulH2O1.22ml2.44ml4.66ml4.88ml30%丙烯酰胺混合液(1:29)2.5ml5ml7.5ml10ml15%4×Tris-Cl/SDSpH8.81.25ml2.5ml3.75ml5ml10%APS20ul40ul60ul80ulTEMED10ul20ul30ul40ul4%StackingGel配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积成分1ml2ml4ml5ml6ml8ml10mlH2O600ul1.2ml2.4ml3ml3.6ml4.8ml6ml30%丙烯酰胺溶液136ul264ul536ul664ul800ul1ml1.36ml4×Tris-Cl/SDS6.8250ul500ul1ml1.25ml1.5ml2ml2.5ml10%APS(ul)481620243240TEMED(ul)24810121620蛋白marker和蛋白样品上样完成后，遵循“先80V恒压浓缩条带至一条线，然后120V或者更高电压进行不同大小蛋白的分离”的原则，根据所需检测53 华东师范大学博士学位论文目标蛋白分子量大小控制跑胶结束时间。跑胶的同时，可以准备转膜所需物品和试剂等3）转膜：配制1L转膜缓冲液的方法为100mL10×Transferbuffer+200mL甲醇+700mLQ水，稍微降温后将转膜所需NC膜浸泡其中5分钟，已到达活化效果。转膜时，制备“三明治”的方法可以是：打开转膜夹，正极一侧的夹子向负极一侧的夹子之间依次为：一层海绵→两张滤纸→NC膜→蛋白胶→两张滤纸→一层海绵，注意“三明治”之间不要留下气泡。夹紧夹子，安装正负极的正确放置顺序插入转膜槽，盖上盖子连通电源开始转膜。一般情况下，蛋白大小在300KD大小以内，基本上恒压80V转膜85分钟即可。转膜时间的长短取决于目标蛋白分子量大小、PAGE胶的厚度以及转膜电压大小。4）牛奶封闭：将转膜结束的NC膜取出，放入丽春红染液中染色查看转膜情况，转膜没有问题后根据目标蛋白大小进行裁膜，有需要的话也可以在膜的边缘部分做标记等。裁膜结束后，将膜放入装牛奶的暗盒中封闭，封闭条件为：5%牛奶中1h或7%牛奶中2h，室温下置于脱色摇床上转速80rpm轻摇。5）一抗孵育：将暗盒中的牛奶倒掉，加入Q水，洗去残留在NC膜表面的牛奶。目标蛋白的一抗选用3%BSA配制，NC膜一抗孵育条件为：室温孵育2-3h,或4℃冰箱内孵育过夜。6）二抗孵育：将好用的一抗进行回收，加入PBST洗膜液，3分钟每次，重复洗2次共3次。二抗选用3%BSA配制，NC膜二抗室温孵育1h。7）扫膜：用PBST洗膜3分钟每次，重复洗2次共3次。洗膜后，用Odyssey仪器进行扫膜。2.2.4细胞免疫染色(Immunofluorescencestaining)1）细胞铺板：25cm2细胞培养Flask中长满后，合适浓度的胰酶消化，培养基及时终止消化，转移至15mL离心管中800rpm转速离心收细胞，去上清，3mL培养基将细胞重悬，用200μL的枪头吸取40μL细胞悬液滴入24孔板的一54 华东师范大学博士学位论文个孔中，然后每孔加460μL培养基，至总体积为500μL，轻轻晃动使细胞均匀分布。2）质粒转染：及时观察细胞状态，等到90%以上细胞完全贴壁并伸展开时，进行质粒转染。24孔板一个孔内质粒标准转染量为0.4-0.6μg，但是当质粒本身表达不太好的情况下，可适当增加转染转染量。转染的具体方法为：两只EP管中分别加入50μLOpti-mum，然后分别加入转染试剂（脂质体）和质粒，分别混合均匀。将“质粒-Opti-mum混合物”滴加入“脂质体-Opti-mum混合物”，形成总体积约100μL的染质粒-脂质体复合物，轻轻混匀，室温条件下静置20分钟。24孔板每个孔原有的500μL培养基中吸出100μL培养基丢弃，补充加入混匀静置好的质粒-脂质体复合物，放回培养箱继续培养，8小时后换液，即转染完成。3）免疫染色后续步骤A.转染36-48h后，即可开始后续免疫染色实验步骤。用1mL枪头或者真空泵吸去孔板里的培养基，然后用预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。B.向每孔滴加200μL预冷4%多聚甲醛，室温下静置15分钟固定细胞。C.使用真空泵将4%多聚甲醛吸掉，用预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。D.向每孔滴加200μL用1×PBS配制的1%TritonX-100，室温条件下静置15分钟对细胞进行通透。预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。E.向每孔滴加200μL浓度5%BSA（用含有0.2%TritonX-100的1XPBS配制），放置于37℃恒温箱中封闭1h。预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。F.向每孔滴加200μL浓度为1%BSA配制的对应的一抗，放置于37℃恒温箱中孵育2h或4℃冰箱内过夜孵育（其中1%的BSA由0.2%TritonX-100配制而成）。预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。G.向每孔滴加200μL浓度为1%BSA配制的对应的二抗，放置于37℃恒温箱中孵育1h，该步骤注意避光进行。预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次。H.向每孔滴加200μL由0.2%TritonX-100配制的浓度为1μg/mL的DAPI55 华东师范大学博士学位论文溶液，室温条件下避光孵育15分钟。I.吸进DAPI溶液后，用预冷的1XPBS快速轻柔漂洗2次，然后加200μL1XPBS，至此便可拿到荧光显微镜下进行拍照。4）补充说明A.1%TritonX-100溶液和0.2%TritonX-100溶液，都可以用灭菌的1XPBS溶液一次性配制500mL,放在室温条件下保存即可。B.通常情况下，免疫染色过程中的一抗首选稀释比例为1:1000，孵育结束后，可进行回收用于westernblot实验。若此稀释比例使用效果不佳，可适当提高稀释比例。通常情况下，荧光二抗以稀释比例1:500使用，不需要回收。DAPI母液浓度为5mg/mL，稀释比例为1:1000即可。C.如果需要进行使用confocal仪器拍照，则需要在一开始细胞铺板时，将细胞铺在圆形小玻璃片上。首先，配制浓度为0.2%的明胶并灭菌备用。然后用酒精浸泡的镊子将75%乙醇预先浸泡过的圆形玻璃片放入24孔板的孔中，开盖置于超净工作台下，紫外灯打开照射2h，1XPBS漂洗一次后，加入200μL灭菌的0.2%凝胶，置于细胞培养箱20分钟，吸出明胶溶液，1XPBS溶液漂洗一次，然后开始细胞铺板。D.在DAPI溶液染色结束并用1XPBS漂洗后，开始制备confocal片子。载玻片用75%乙醇擦洗处理至洁净，然后在中心位置滴加5μL荧光防淬灭剂。小心用镊子将注射器针头以合适角度折弯，轻轻勾起24孔板中的玻璃圆片，小心用镊子将片子夹出来，在吸水纸上稍停顿，以便将片子上的水分尽可能吸去，然后反扣于载玻片上的防荧光淬灭剂，尽量保证玻璃片下无气泡。然后用小块滤纸从圆玻片边缘吸干多余的防淬灭剂，轻沾即可。最后，用透明指甲油将圆玻璃片的边界周围封上，注意不要将指甲油涂到玻璃片上。同时，整个过程注意避光进行。2.2.5免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)以6cmdish长满的细胞样品为例：56 华东师范大学博士学位论文A.通过胰酶消化收集转染后48h细胞样品，用预冷的1XPBS快速洗2次，注意离心时选用4℃离心机。B.向每个细胞样品中加200μL预冷的lysisbuffer（蛋白酶抑制剂PI和DTT等现用现加），vortex震荡或者用枪头吹打混匀，冰浴裂解30分钟。C.裂解细胞的同时，平衡后续需要使用的beads，步骤如下：使用600μL离心管，每个加400μL预冷bindingbuffer（此时不需要加PI和DTT），再加入8μL纯beads，连续上下颠倒8-10次进行漂洗，转速2500rpm条件下离心3分钟，弃上清，再重复漂洗2次。D.取出步骤B中裂解完成的细胞样品，放入提前预冷的4℃离心机，在转速12000rpm条件下，离心15分钟。E.从离心后的样品上清中取出20μL至新的EP管，加入等体积的2×SDSLoadingbuffer震荡混匀,放置于金属浴中煮样12分钟,转速12000rpm条件下离心2分钟，即得到input样品，-20℃冰箱中保存备用。F.向步骤C中完成平衡的beads中，加400μLbindingbuffer（预冷，且已加蛋白酶抑制剂PI和DTT）和2μL目的蛋白抗体，随后将步骤E中剩余的180μL左右的细胞裂解液也加入其中。放置于4℃冰箱中rotation6-8h或直接过夜进行孵育。G.取出上一步孵育后的样品，放入预冷的4℃离心机中，转速2500rpm条件下离心3分钟，轻轻吸去上清，然后加600μL预冷过的Washbuffer,4℃冰箱内rotation5分钟，转速2500rpm条件下离心3分钟，吸去上清。再重复漂洗beads两次，最后一次漂洗时，尽量吸干漂洗液。H.向每个IP样品中加20μL1×SDSLoadingbuffer，然后放置于金属浴中加热煮样8分钟，转速12000rpm条件下离心2分钟，至此IP蛋白样品制备完成。I.WesternBlot实验进行免疫共沉淀结果的检测。57 华东师范大学博士学位论文2.2.6核质分离1）裂解缓冲液配制Buffer1（50mL体系，PH7.9）Buffer2（50mL体系，PH7.6）1MHepes-NaOHPH7.9500μL1MHepes-NaOHPH7.9500μL3MKCl167μL3MKCl7mL3MMgCl225μL3MMgCl233.3μLβ巯基乙醇2μL20%NP-402μLQ水补足50mLQ水补足50mL蛋白酶抑制剂PI、DTT及PMSF现用现加2）以6cmdish长满的细胞样品为例A.合适浓度的胰酶消化后，收集细胞至离心管中，用1XPBS溶液快速洗细胞，在预冷4℃离心机内转速1500rpm条件下离心2分钟，重复洗一次。B.每个细胞样品中加250μL预冷的buffer1（蛋白酶抑制剂PI、DTT及PMSF现用现加），移液枪吹打使得细胞充分悬起来，冰浴裂解20分钟，期间可以拿起轻弹几次。C.裂解后，再次震荡均匀，取30μL细胞裂解液，加入等体积的2×SDSLoadingbuffer震荡混匀,放置于金属浴中煮样12分钟,转速12000rpm条件下离心2分钟，即得到input样品，-20℃冰箱中保存备用。D.向每个细胞样品中加2.5μL20%的NP-40，vortex震荡5秒，冰浴2分钟，转速12000rpm条件下，4℃离心16分钟,上清即为细胞质组分。取120μL细胞质组分，加入等体积的2×SDSLoadingbuffer震荡混匀,放置于金属浴中煮样12分钟,转速12000rpm条件下离心2分钟，即得到细胞质组分样品，-20℃冰箱中保存备用。E.吸去步骤D中剩余的上清，剩余的沉淀为细胞核，用预冷1XPBS充分漂洗2遍沉淀，离心去除PBS漂洗液，然后每个样品加100μLbuffer258 华东师范大学博士学位论文（蛋白酶抑制剂PI、DTT及PMSF现用现加），移液枪吹打使聚团的细胞核充分散开，冰浴裂解20分钟，期间可以拿起轻弹几次。F.转速12000rpm条件下，4℃离心16分钟,上清即为细胞核组分。取80μL细胞质组分，加入等体积的2×SDSLoadingbuffer震荡混匀,放置于金属浴中煮样12分钟,转速12000rpm条件下离心2分钟，即得到细胞核组分样品，-20℃冰箱中保存备用。G.吸去步骤H中剩余的上清，剩余的沉淀为chromatin组分，用预冷1XPBS充分漂洗2遍沉淀，离心去除PBS漂洗液，然后每个样品加80ΜL1×SDSLoadingbuffer，震荡混匀,放置于金属浴中煮样16分钟,转速12000rpm条件下离心2分钟，即得到chromatin组分样品，-20℃冰箱中保存备用。H.以上得到核质分离实验的input样品、细胞质组分样品、细胞核组分样品和chromatin组分样品，即可用来进行WB实验检测目的蛋白在各组分之间的分布。其中细胞质、细胞核和chromatin各组分可分别以Tubulin/GAPDH、LaminA/C和组蛋白H3为marker蛋白。2.2.7真核细胞组蛋白抽提以10cmdish长满的细胞样品为例1）配制组蛋白抽提lysisbuffer组蛋白抽提lysisbuffer（50mL）1MTris-HClpH8.03MNaCl20%NP-40Q水1mL2.5mL2.5mL补足50mL蛋白酶抑制剂、DTT及PMSF现用现加2）合适浓度的胰酶消化后，收集细胞至离心管中，用1XPBS溶液快速洗细胞，在预冷4℃离心机内转速1500rpm条件下离心2分钟，重复洗一次。3）每个细胞样品中加1mL预冷的lysisbuffer（已加蛋白酶抑制剂、DTT及PMSF），vortex震荡混匀后置于4℃冰箱内rotation25分钟。4）预冷的4℃离心机内13000rpm转速条件下离心10分钟，用移液枪轻吸59 华东师范大学博士学位论文去上清，获得完整的细胞核。接着，向每个样品中加400μL0.4NH2SO4溶液，vortex震荡混匀后置于4℃冰箱内rotation25分钟或者过夜。5）TCA沉淀：预冷的4℃离心机内13000rpm转速条件下，离心10分钟，此时corehistone用主要存在于上清液中，用移液枪小心转移至新的离心管内。向每个样品逐滴滴加132μLTCA溶液（TCA配制方法为：20mLQ水+20gTCA粉末），上下翻转8-10次混匀，然后冰浴30分钟或者4℃冰箱内rotation过夜。6）预冷的4℃离心机内13000rpm转速条件下离心10分钟，用移液枪轻吸去上清，离心管管底可看到白色沉淀。接着，向每个样品中加入在-20℃冰箱中预冷的丙酮，vortex震荡混匀后放入-20℃冰箱内静置18分钟。以上丙酮漂洗沉淀步骤，重复进行一次。7）弃上清，室温条件下晾干20分钟，每个沉淀样品加100μLQ水，轻弹或vortex震荡进行溶解，最终可能会有小部分组蛋白不能溶解，此时可通过转速12000rpm条件下，4℃离心10分钟重新转移上清以达到去除沉淀的目的。一般情况下，以上的抽提条件最终得到的corehistone浓度约为5μg/μL。2.2.8真核细胞基因组抽提1）细胞裂解液配方表组分Tris-HClpH7.5EDTANaClproteinaseKRNAase浓度10mM10mM10mM,1mg/mL100μg/mL2）以六孔板一个孔长满的细胞样品为例，加200μL细胞裂解液，1mL枪头吹打收集至1.5mL离心管中，vortex震荡混匀后瞬离一下，插入漂浮板置于60℃水浴锅中过夜消化。3）消化后，加入相同体积的酚氯仿（V酚:V氯仿=1:1，至少需要提前2天准备好），vortex震荡混匀后，转速12000rpm条件下，离心2分钟，将上清转移至新的离心管中，注意记录上清的体积。4）向转移后的上清中加相同体积的氯仿，vortex震荡混匀后在转速12000rpm条件下，离心1分钟，再次将上清转移至新的离心管，注意记录上清的体积。60 华东师范大学博士学位论文5）向转移后的上清中加1/10体积的浓度为3MNaAC（pH5.3）和糖原20μg，vortex震荡混匀后，再向其中加入2.5倍体积的无水乙醇，然后放入-20℃冰箱，静置30分钟。6）预冷的4℃离心机内5000rpm转速条件下，离心2分钟，离心管底部会看到核酸沉淀。吸去上清，用1mL75%的乙醇漂洗沉淀，上下颠倒或稍微震荡都可以，然后转速12000rpm条件下离心5分钟。7）上一步离心后尽可能将漂洗用酒精吸去，室温晾干5分钟，加40μLQ水将沉淀溶解，使用Nanodrop测量浓度。A260/A280的值，处于1.7-1.9之间即为较好的抽提结果。浓度测完后，保存于-20℃冰箱内备用。2.2.9细胞稳系构建1）慢病毒包装法构建细胞稳系A.利用克隆构建的方法，选用慢病毒表达载体，如PCDH-puro/GFP，构建含有目的基因的质粒。B.选择生长状态相对较好HEK293T细胞，处理后铺板10cmdish，实时观察细胞状态。细胞密度达到70%左右时，进行细胞转染：慢病毒载体的目的基因克隆（10μg）+psPAX2(10μg)+VsVg/PMD2G(5μg)。其中，质粒psPAX2和质粒VsVg/PMD2G是慢病毒包装所需的质粒。C.转染完成8小时后，更换6mL新鲜培养基后转移至病毒房继续培养，每隔12小时对细胞状态进行一次观察。因为慢病毒不适应酸性环境，所以一旦培养基过于偏黄，立即补充适量新鲜培养基，否则会影响到病毒的滴度。D.转染完成48小时后，收集上清至15ml离心管，转速4500rpm条件下离心10分钟，小心吸取上清至已安装0.45μm滤头的20mL注射器中过滤，过滤出来的上清直接进入病毒浓缩柱，然后离心对病毒进行浓缩。E.用浓缩后得到的目的基因包装病毒，加入到需要构建稳系的细胞系中感染细胞（具体加多少量需要进行预实验调整），剩余的病毒需要放入-61 华东师范大学博士学位论文80℃冰箱进行保存。F.若慢病毒载体含有GFP等荧光标签，细胞系感染48h后可使用流式细胞仪荧光分选获得稳转细胞株，然后继续培养以便后续实验。若慢病毒载体含有puro抗性，细胞系感染36h后可使用添加了puromycin的培养基进行药筛，杀死未感染细胞，留下感染成功的细胞，从而获得稳转细胞株，然后继续培养以便后续实验。2）瞬转抗性药筛法构建细胞稳系：A.利用克隆构建的方法，选用具有puro等抗性的表达载体，如pPYCAGIP，构建含有目的基因的质粒。B.选择生长状态相对较好细胞，处理后铺板6cmdish，实时观察细胞状态。细胞密度达到70%左右时，进行细胞转染。转染24h后，用添加了puro的培养基进行药物筛选。杀死未感染细胞，留下转染成功的细胞，至大多数细胞死亡，少数克隆团形成。C.超净台中用枪头打散克隆团，吸取单克隆细胞，分别放入96孔板的一个个孔中，尽可能每孔一个细胞，用添加了puro的培养基继续培养。D.选择最终形成的细胞克隆团，进行编号，然后用枪头分别打散这些细胞团，转移至25Flask或6cmdish扩大培养。一段时间以后收集部分细胞，通过WB等方法鉴定稳系是否构建成功。2.2.10qPCR1）抽提总RNA后，取3μg作为模板进行20μL反转体系获取cDNA。2）将所得cDNA用灭菌Q水稀释160倍，即可作为RT-PCR模板备用。3）qPCR体系和扩增程序qPCR体系（15μL体系）qPCR程序2×qPCRmix7.5μL94℃2min循10μMForwardprimer0.3μL94℃20s环4010μMRerverseprimer0.3μL60℃20s次62 华东师范大学博士学位论文Template6.3μL72℃*20sQ水0.6μLDissociationStage*代表荧光信号采集4）qPCR的结果处理和分析整理。2.2.11原核表达蛋白的纯化1）质粒转化：采用BL21大肠杆菌表达感受态细胞（40ul）转化携带目的基因的质粒（1ug)，冰浴30min，42℃水浴90s，冰上静置2min，涂板，37℃温箱孵育小于16小时。2）诱导条件的摸索（小摇）：取8mL2×YT培养基加入氨苄（1：1000），挑取单克隆，37℃平摇过夜；向含氨苄的LB培养基中（7mL)加入1mL摇好的菌液，37℃恒温摇床3-4h；再取1mL摇好的菌液12000rpm离心2min，往所得菌沉淀中加入10uLPBS重悬，然后加入20uL2×SDSloadingbuffer，95℃金属浴12min，离心3min，所得为蛋白诱导前参照；把IPTG（100mM,1:500/1:1000）加入剩余的7mL菌液中，16℃恒温摇床诱导3-12h/过夜。取1mL诱导后菌液离心取沉淀加入2×SDSloadingbuffer裂解后跑蛋白胶烤染检测诱导情况。3）大摇：挑取单克隆，取8mL2×YT培养基加入氨苄（1：1000），37℃恒温摇床培养过夜，然后向800mL含有氨苄的LB培养基中加入4mL摇好的菌液，37℃恒温大摇床2h，待OD值约为0.6时，取1mL菌液离心作为诱导前参照，IPTG（100mMIPTG,1:500）加到剩余的菌液中，16℃低温摇床诱导过夜。4）收菌：收菌瓶分装菌液，设定好速率、程序和匹配的转子，4℃8000rpm离心5min；弃上清，-80℃急冻收菌瓶20min，将菌从收菌瓶底部磕出。5）超声：配置BufferA，800mL量的菌加入40uLBufferA，充分混匀后，超声破碎（注意，为防止超声产生的温度过高，需将样品放置在冰水混合物中）。超声条件：大探头、冰浴、3个99循环，每个循环3s，间歇6s，功率应小于200w为宜（或200~400w之间），超声至菌液澄清透明为止。超声功率、工作时间、间歇时间可适当调整，间歇时间一般为工作时间的2倍。63 华东师范大学博士学位论文6）超声破碎完毕后，向透明的菌液中加入TritonX-100（终浓度为0.5%，母液为10%的浓度，1：20加），混匀，4℃rotation30min以充分理解细菌释放蛋白。7）准备GSTbeads:取250uLGST-Agarosebeads，4℃条件下转速2000rpm离心1min，小心吸去上层酒精，再加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，混匀，4℃条件下转速2000rpm离心2min。PBS洗三次。8）细菌裂解液rotation完毕后,4℃8000rpm离心15min，取上清100uL留样，其余上清移到新的50mL离心管中，加入平衡好的GSTbeads，4℃rotation孵育6h或过夜。9）配制漂洗液（washbuffer），冰上预冷。10）洗柱子（BIO-RAD）：先用超纯水清洗柱子，再用1×PBS冲洗柱子3次，备用。11）孵育结束后，4℃3000rpm离心5min，取上清100uL留对照，其余上清暂存4℃冰箱备用。将底部的beads转至预洗的柱子中，用10mLwashbuffer洗涤3次，每次4℃rotation10min,4000rpm离心5min。12）配制洗脱液（Elutionbuffer)，冰上预冷。600uLElutionbuffer洗脱样品，4℃rotation30min,4000rpm离心5min，获得E1，再用300LElutionbuffer洗脱后得到E2。13）之前收集的裂解后上清、孵育后上清以及洗脱液（E1、E2)各取5uL，等体积2×SDSlodading裂解，95℃金属浴5min,离心后，蛋白凝胶电泳。其余纯化的蛋白-80℃冰箱保存备用。2.2.12考马斯亮蓝染色1）SDS-PAGE凝胶电泳结束后，将胶浸泡于考染液中，微波加热30s，室温平摇1-2h。2）考染液回收后，浸泡于脱色液中，30s微波加热，2h室温平摇,换新的脱色液，微波加热30s，室温平摇脱色过夜。64 华东师范大学博士学位论文3）拍照获得实验结果。2.2.13体外SUMO修饰反应1）原核纯化GST-WDR5、SUMO酶系蛋白SAE1/2、UBC9和SUMO-1。2）20uLSUMO反应体系中底物及各SUMO酶系所需蛋白量：GST-WDR5SAE1/2UBC9SUMO-13g200ng400ng2.5gSUMO反应体系1×buffer配方表成分Tris-HClpH7.5MgCl2ATPDTT浓度50mM5mM2mM1mM3）各组分添加以后，震荡混匀，瞬离后37℃水浴锅内孵育2.5h进行反应。4）水浴结束后，加入等体积的2×SDSloadingbuffer，震荡混匀煮样10分钟5）Westernblot实验外源检测WDR5蛋白的SUMO修饰情况。2.2.14染色质免疫共沉淀（ChIP）A.取出10cmdish中培养的细胞。保留10mL培养基，直接向培养基中加入270μL（37%）甲醛混匀（通风橱内）。室温摇床上孵育10分钟交联。B.加入1mL10×甘氨酸（1.25M）中和未完全反应的甲醛，室温摇床上孵育5分钟。C.弃掉培养基，使用预冷的PBS润洗细胞两次。加入1.5mLPBS将细胞刮下转移到新的EP管中。4℃，4000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。D.加入1mLSolutionA（10mMTris-HClpH7.9；0.25%TritonX-100;10mMEDTA;200×PI）剧烈震动重悬用枪吹散沉淀。冰上静置10分钟。6400rpm离心5分钟，弃上清。E.加入600μLSolutionC（1mMEDTA；150mMNaCl；50mMTris-HClpH7.5；0.1%SDS；1%TritonX-100；0.1%SodiumDeoxycholate；2mMPMSF；200×PI）剧烈震荡混匀。F.超声破碎样品需要根据具体细胞来摸索超声条件。通常超声仪功率设定65 华东师范大学博士学位论文振幅杆2档，功率80W，工作2秒，停4秒，10-15次，重复循环直至溶液变的澄清透亮。注意超声过程产生大量的热量，一定在冰水混合物中进行，此外还要采用较小较碎的冰块。4℃，12000rpm离心15分钟，转移上清到新的EP管中冰上静置准备。G.封闭预处理Beads。G25beads使用ChIPbufferⅠ润洗后2000rpm离心5分钟，收集Beads，4℃保存。ProteinA/Gbeads使用鲑鱼精DNA和BSA封闭。首先用超纯水配置2mg/mL的鲑鱼精DNA和10mg/mL的BSA母液（两者终度分别为200μg/mL和1mg/mL）。取160μLProteinA/Gbeads悬液（混有50%超纯水）加入20μL鲑鱼精DNA溶液和20μLBSA溶液。4℃旋转孵育2小时进行封闭预处理，4℃条件下转速2000rpm离心5分钟，收集处理过Beads，弃上清，使用ChIPbufferⅠ洗涤，后4℃保存。H.向步骤G中的全部上清中加入20μL润洗过的G25beads4℃旋转孵育2小时，降低背景。I.建立ChIP体系（300μL）。将步骤11中孵育的上清取出转到新的EP管中。取出10μL作为Input，-20℃保存。取出100μL上清加入10μL处理过的ProteinA/Gbeads，加入1-2μg内源抗体（或者5μLM2beads），最后用ChIPbufferⅠ补平至300μL。4℃旋转混匀孵育过夜。J.4℃条件下转速2000rpm离心5分钟，弃上清。后面依次使用400μLChIPbufferⅠ、Ⅱ、Ⅲ和BufferTE洗涤beads。保证每次4℃旋转混匀5min，4℃条件下转速2000rpm离心5min。K.加入200μL新配的Elutionbuffer(0.5%SDS；0.1MNaHCO3)和1μL的蛋白酶K（10mg/mL）。注意：Input样品同时加入Elutionbuffer和蛋白酶K。颠倒混匀后于65℃慢摇孵育过夜解交联。注意：为防止管内液体挥发，用保鲜膜包绕EP管口。L.加入等体积（200μL）的酚氯仿（1:1）颠倒混匀充分后8000rpm离心3分钟。吸取上清到新的EP管中（注意不要吸到蛋白沉淀）。66 华东师范大学博士学位论文M.加入100μL的纯氯仿颠倒混匀后8000rpm离心3分钟。转移上清到新的EP管中。N.加入300μL乙醇，10μLNaAc（3M）以及0.3μL糖原(20mg/mL)，-20℃沉淀DNA。时间至少大于2小时或者过夜。O.4℃12000rpm离心15分钟，沉淀DNA，后加入1mL75%乙醇洗涤沉淀两次。室温晾置DNA约5分钟，加入50μLddH2O溶解DNA。P.测量DNA浓度，取5μgDNA做模板进行qPCR检测，剩余DNA可以-20℃长期保存。67 华东师范大学博士学位论文第三章SUMO修饰调控HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性的分子机制研究3.1前言组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一种大家所熟知的修饰酶家族，其可催化底物蛋白特定的乙酰化赖氨酸残基的ε-氨基上去除乙酰基团。它们首先在染色质重塑的过程中被鉴定为组蛋白去乙酰化酶，但实际上还发现许多其他非组蛋白是其催化底物，如：转录因子（p53和Rb蛋白），代谢酶（丙酮酸激酶和乙酰-CoA合成酶），结构蛋白（α-微管蛋白），参与DNA动力学的酶（PCNA）以及外源病毒蛋白（SV40T抗原或HIV整合酶）等[169]。HDACs在酵母、植物和动物进化中非常保守。在真细菌和古细菌中也发现了HDACs同源蛋白。在人类细胞中，目前已经发现了18种HDACs，根据其催化机理分为两个家族：锌和NAD+依赖性家族。锌依赖性HDACs属于经典Rpd3/Hda1家族，而NAD+依赖性HDACs属于Sirtuin家族。图3.1-1组蛋白去乙酰化酶家族[170]68 华东师范大学博士学位论文分类的另一个补充标准是基于与之相应的酿酒酵母蛋白质HDACs序列同源性将HDACs分为四类（图3.1-1）。I类HDACs包括HDAC1，HDAC2，HDAC3和HDAC8，与酵母RPD3蛋白同源。II类包括与酵母HDA1蛋白同源的HDAC，并进一步分为两类：IIa类（HDAC4，HDAC5，HDAC7和HDAC9）和IIb类（HDAC6和HDAC10）。III类对应于NAD+依赖的Sirtuin家族，由Sirt1-7七名成员组成。HDAC11是目前唯一属于第IV类的成员;它是与I类和II类HDACs具有共同特征的锌依赖性脱乙酰酶。I类HDACs在所有组织类型中普遍表达。HDAC1和HDAC2是严格相关的蛋白质，在发育和生理学中也有重要作用，特别是在心脏和神经系统[171]。HDAC1和HDAC2与组蛋白结合蛋白RbAP46和RbAP48一起是许多蛋白转录复合物的催化核心的一部分，并且这种结合刺激它们的酶活性，使它们在细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡中发挥重要作用[172]。例如，HDAC1/2参与的Sin3A和NuRD复合物是基因转录的广谱调节剂，并结合一系列不同的辅因子，如Sds3[172]和SAP蛋白[173]以及Mi2，MTA2和MBD3[174]。另一方面，REST/CoREST复合物具有更多特异性功能：它能招募HDAC1/2抑制神经基因在非神经组织中的转录[175,176]。最近还鉴定出另外两种含HDAC1/HDAC2的复合物：SHIP和NODE复合体。SHIP1是一种DNA重塑蛋白，涉及精子发生过程中的色素动力学，质谱鉴定HDAC1（但不是HDAC2）是SHIP1复合物的组分之一[177]。NODE复合物是胚胎干细胞（ES）特有的：含HDAC1/2的复合物与ES特异性转录因子Nanog和Oct4相关，关闭特定的靶基因，从而决定干细胞命运[178]。HDAC1/2复合物在功能上不同于含有HDAC3的复合物，如SMRT/N-CoR复合物，因此表明HDAC1/2和HDAC3之间的生物学作用存在差异（图3.1-2）[179]。HDAC3在细胞周期进程、DNA损伤反应以及在纺锤体装配检查点和姊妹染色单体凝聚力中起重要作用[180,181]，敲除后，胚胎在9.5天前死亡。MEF细胞中HDAC3的条件性敲除影响参与代谢、细胞周期、细胞凋亡、发育和信号转导的各种基因的转录[180]。肝脏特异性敲除HDAC3会导致肝69 华东师范大学博士学位论文细胞肥大和脂质代谢失调[182]。迄今为止，尚未有报道HDAC8与大分子复合物结合。HDAC8在平滑肌细胞中发挥重要作用，它与α-肌动蛋白结合，对细胞收缩至关重要[183]。研究阐明了HDAC8转录过表达与儿童神经母细胞瘤进展和转移的相关性[184]。图3.1-2HDAC1/2、HDAC3复合体[185]II类HDACs在肌肉、心脏和骨骼发育及生理学中具有多种不同的功能，并且它们具有组织特异性。IIb类HDAC6是主要的胞质去乙酰化酶，分别通过α-微管蛋白和HSP90的乙酰化来控制细胞骨架动力学和分子伴侣功能[186,187]。III类主要参与新陈代谢和老化[188]。HDAC11调节CD4+T细胞中免疫激活和免疫耐受之间的平衡[95]，并在少突胶质细胞分化中发挥作用[189]。核小体中组蛋白的去乙酰化诱导染色质浓缩，通过阻止转录因子和参与转录的其他组分与基因启动子和增强子区域的结合来抑制转录。相反，通过组蛋白乙酰转移酶（HATs）乙酰化组蛋白诱导染色质松弛，促进基因转录。因此，HDACs和HATs作为基因表达的重要和相反的表观遗传调控因子。70 华东师范大学博士学位论文既往的研究已证实SUMO修饰抑制转录，SUMO修饰HDAC是其介导转录抑制的主要机制之一。早期的研究证实HDAC1[96]、HDAC2[104]和HDAC4[98]等能发生SUMO修饰。我们前期的关于SUMO修饰抑制组蛋白乙酰化的研究中，已得到以下研究结果：1）PIASxβ特异性抑制组蛋白乙酰化水平，且依赖其SUMOE3连接酶活性；2）PIASxβ抑制组蛋白乙酰化水平是通过特异性介导HDAC1、HDAC2发生SUMO修饰，其不能介导组蛋白H3、H4的SUMO修饰，也不能抑制p300乙酰化酶活；3）体内外实验发现PIASxβ介导的HDAC1/2SUMO修饰，以及SUMO修饰mimic的HDAC1/2显著增强了其去乙酰化酶活性；4）PIASxβ不影响HDAC1/2/3的转录水平，但敲低PIASxβ降低了HDAC1/2的蛋白稳定性；5）PIASxβ介导的HDAC1/2SUMO修饰促进其在染色质上的富集，但并不影响含有HDAC1/2复合体如Sin3A、NuRD等的形成；5）PIASxβ介导的HDAC1/2SUMO修饰可能与肾癌的发生、发展密切相关。基于前期的研究结果，我们基本阐明了PIASxβ通过介导的HDAC1/2SUMO修饰增加其蛋白稳定性及在染色质上的定位，从而增强其组蛋白去乙酰化酶活。但该课题仍然存在许多尚待解决的问题：1）我们需要CHIP-Seq进一步验证SUMO修饰是否促进HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性；2）RNA-seq验证HDAC1/2SUMO化后抑制细胞整体转录水平；3）对既往已鉴定出的HDAC1/2SUMO修饰位点进行验证，并探究该突变是否改变其蛋白稳定性；4）HDAC1/2SUMO修饰位点突变是否影响含有HDAC1/2复合体的形成；5）HDAC1/2SUMO修饰突变体是否影响其染色质定位。此外，已有研究表明，SENP1能去除HDAC1的SUMO修饰，从而影响AR调控的靶基因的转录。但仍有以下问题不清楚：1）HDAC1SUMO修饰的去除是否影响其组蛋白去乙酰化酶活性？2）在SENPs家族中，是否还有其他SENPs蛋白能特异性去除HDAC1的SUMO修饰？3）HDAC2的特异性去SUMO化酶有哪些？4）SENPs蛋白去除HDAC1/2SUMO修饰后是否影响其蛋白稳定性及其染色质定位？这些问题都值得我们继续探讨。这些科学问题的解决有助于我们更71 华东师范大学博士学位论文好的理解HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性与肿瘤发生、发展的相关性，为以后进一步的研究打下坚实基础。3.2实验结果第一部分：HDAC1/2的SUMO修饰功能研究3.2.1ChIP-Seq证明SUMOmimic修饰促进HDAC1组蛋白H3去乙酰化酶活性通过体内、体外实验，课题合作者于方博士证明HDAC1/2发生SUMO修饰可以显著促进其组蛋白去乙酰化酶活性。为进一步说明HDAC1/2发生SUMO修饰可以显著增加其组蛋白去乙酰化酶活性，以及为了探究HDAC1/2发生SUMO修饰会不会影响HDAC1/2在染色质上的定位，我们在293T细胞中构建了Flag-HDAC1/2和HDAC1/2SUMO修饰mimic的HDAC1/2(Flag-SUMO-1∆GG-HDAC1/2)稳系。鉴于HDAC1和HDAC2结构和功能的相似性，我们选取了Flag-HDAC1和Flag-SUMO-1∆GG-HDAC1两个细胞稳系作为代表，用Flag抗体和AcH3抗体进行CHIP-Seq，分析HDAC1和SUMO-1∆GG-HDAC1在全基因组范围内的分布差异和相应位置上组蛋白H3乙酰化修饰水平差异。结果表明，HDAC1在全基因组上的定位没有发生明显改变，即SUMOmimic的HDAC1不影响HDAC1在全基因组上的定位(图3.2.1-1)。SUMOmimic修饰的HDAC1细胞稳系中H3的乙酰化水平明显低于Flag-HDAC1细胞稳系中的H3乙酰化水平（图3.2.1-1）。图3.2.1-1ChIP-Seq证明SUMO修饰促进HDAC1/2组蛋白H3去乙酰化酶72 华东师范大学博士学位论文活性。A.Flag抗体的ChIP-Seq结果；B.AcH3抗体的ChIP-Seq结果。此外，我们还通过等量稳系细胞抽提RNA的方法检测细胞内整体转录水平，结果如图3.2.1-2，。通过抽提总RNA，以细胞数来做标准化，结果发现：相比于Vector稳系，HDAC1/2稳系中RNA总量较低，而SUMO-1∆GG-HDAC1/2稳系中呈现出更低的总RNA水平。由此说明，HDAC1/2的过表达会抑制整体转录水平，这与以往研究是一致的；SUMOmimic的HDAC1/2更明显地抑制整体转录水平。综上表明：HDAC1发生SUMO修饰，可以显著促进其组蛋白去乙酰化酶活性，进而介导细胞整体转录水平抑制。图3.2.1-2不同细胞稳系通过细胞数标准化后的totalRNA比较3.2.2代表性基因转录水平分析表明HDAC1SUMO修饰抑制靶基因转录同时，我们也选取了Flag-HDAC1和Flag-SUMO-1∆GG-HDAC1两个细胞稳系为代表，进行了RNA-seq。根据上述ChIP-Seq结果中HDAC1与SUMO-1∆GG-HDAC1共同富集的区域，随机选择一些代表性基因，如CCDC166,FOXC1,IER5L,PRRT4,GATA2及EME2的RNA-Seq结果，比较其在两种细胞系中的转录水平。结果表明，与游离HDAC1相比，SUMO修饰mimic的HDAC1不同程度地抑制这些代表性基因周围的组蛋白乙酰化水平和这些靶基因的转录水平（图3.2.2）综上所述，SUMO修饰mimic的HDAC1增加其组蛋白去乙酰化酶活性，进而介导细胞整体转录水平抑制。73 华东师范大学博士学位论文GeneCCDC106GeneEME2GeneFOXC174 华东师范大学博士学位论文GeneGATA2GeneIER5LGenePRRT4图3.2.2代表性基因分析75 华东师范大学博士学位论文3.2.3HDAC1/2mimicSUMO修饰不影响其亚细胞定位接下来探究mimic的SUMO修饰是否会影响HDAC1/HDAC2的亚细胞定位。在HeLa细胞中过表达Flag-HDAC1、Flag-SUMO-1∆GG-HDAC1及Flag-SUMO-2∆GG-HDAC1和Flag-HDAC2、Flag-SUMO-1∆GG-HDAC2及Flag-SUMO-2∆GG-HDAC2，转染48小时后，收细胞进行免疫染色实验，用Flag抗体检测外源过表达的HDAC1/2、SUMO-1∆GG-HDAC1/2及SUMO-2∆GG-HDAC1/2的亚细胞定位。图3.2-3HDAC1/2SUMO修饰不影响HDAC1/2亚细胞定位76 华东师范大学博士学位论文结果表明，mimic的SUMO-1、SUMO-2修饰不影响HDAC1/2的亚细胞定位。该结果提示我们，SUMO修饰的HDAC1/2组蛋白去乙酰酶活性的增强，不依赖于亚细胞定位的改变。3.2.4HDAC1/2SUMO修饰位点的鉴定既往的研究发现，HDAC的SUMO修饰位点为K444和K476，HDAC2的SUMO修饰位点为K462，但尚无确切的研究表明它们的SUMO化突变体改变其组蛋白去乙酰化酶活性，从而影响整体转录[96,104]。因此，首先我们想进一步确定这几个位点为HDAC1/2的SUMO修饰位点，以进行进一步的研究，我们构建了P3×Flag为载体的HDAC1K444R/K476R双突变体（HDAC1m）和HDAC2K462R突变体（HDAC2m)。在293T细胞系中，分别过表达Flag-HDAC1/2、Flag-HDAC1/2+GFP-SUMO1、Flag-HDAC1/2+GFP-SUMO1+HA-PIASxβ和Flag-HDAC1/2m+GFP-SUMO1+HA-PIASxβ，Vector补齐，同时设立空白对照，转染48小时后，收细胞用M2beads富集Flag-HDAC1/2或Flag-HDAC1/2m，在40mM浓度的药物NEM（去除SUMO修饰的SENP家族蛋白的活性抑制剂）处理下，进行变性IP实验。变性IP结果表明，HDAC1/2野生型能很好的发生SUMO修饰，但HDAC1/2m的SUMO修饰水平显著降低（图3.2-4），这表明，K444和K476是HDAC1的主要SUMO修饰位点，K462是HDAC2的主要SUMO修饰位点。77 华东师范大学博士学位论文图3.2-4在293T细胞中，HDAC1/2SUMO修饰位点的实验验证。A.HDAC1的SUMO修饰位点K444和K476的实验验证；B.HDAC2的SUMO修饰位点K462的实验验证（40mMNEM处理条件）。78 华东师范大学博士学位论文3.2.5HDAC1/2SUMO修饰位点突变抑制其组蛋白去乙酰化酶活性为探究已鉴定的HDAC1/2SUMO修饰位点对于HDAC1/2的组蛋白去乙酰化酶活性的影响，在293T细胞中，分别过表达Flag-HDAC1、Flag-HDAC1m、Flag-HDAC2、Flag-HDAC2m及Flag-HDAC1和Flag-HDAC2，转染细胞48h后，进行Westernblot实验检测。结果显示，分别过表达HDAC1/2后，组蛋白H3和H4乙酰化水平都有所下降，验证了HDAC1/2的去乙酰化酶活性，同时过表达HDAC1/2后，组蛋白H3和H4乙酰化水平下降更明显；分别过表达HDAC1/2SUMO修饰位点突变体HDAC1m和HDAC2m，可以看到组蛋白H3和H4乙酰化水平与对照HDAC1/2相比下降不明显，表明HDAC1/2的SUMO修饰位点突变抑制其组蛋白去乙酰化酶活性（图3.2-5）。在多次实验中，我们都发现与对照HDAC1/2相比，SUMO修饰位点突变体表达量稍低，表明SUMO修饰可能调控HDAC1/2的稳定性。图3.2.5HDAC1/2SUMO修饰位点突变抑制其组蛋白去乙酰化酶活性79 华东师范大学博士学位论文3.2.6HDAC1/2SUMO修饰突变体蛋白稳定性降低为进一步探索上述HDAC1/2赖氨酸残基位点的SUMO修饰，对其蛋白稳定性是否有影响，在293T细胞中过表达外源的HDAC1/2的wildtype和位点mutant蛋白并检测蛋白半衰期。在24孔板中，做好同等条件的细胞铺板等前期实验准备。在293T中转染为Flag-HDAC1和Flag-HDAC1-K444R/K476R双突变体（HDAC1m）、Flag-HDAC2和Flag-HDAC2-K462R突变体（HDAC2m)，用终浓度为50μg/mL的放线菌酮（CHX，Cycloheximide）处理细胞，检测HDAC1/2的wildtype和mutant蛋白半衰期差异。图3.2-6HDAC1/2SUMO修饰突变体蛋白稳定性降低。A.Flag-HDAC1和Flag-HDAC1m蛋白半衰期检测实验和结果比较，表明突变后的HDAC1半衰期80 华东师范大学博士学位论文明显缩短，蛋白稳定性降低；B.Flag-HDAC2和Flag-HDAC2m蛋白半衰期检测实验和结果比较，表明突变后的HDAC2半衰期也明显缩短，蛋白稳定性降低。结果表明，SUMO修饰位点突变后的HDAC1/2的蛋白半衰期缩短，加速了蛋白的降解。也就说明，HDAC1上K444和K476位点的SUMO修饰都能促进HDAC1蛋白稳定性，HDAC2上K462位点的SUMO修饰也能促进HDAC2蛋白稳定性。3.2.7HDAC1/2SUMO修饰突变体不影响HDAC1/2复合体形成为了进一步研究HDAC1/2SUMO修饰位点突变体，是否会影响富含HDAC1/2复合体（如mSin3A复合体、NuRD复合体复合体）的形成，从而影响HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性。在293T细胞中，转入Flag-HDAC1/Flag-HDAC1m，Flag-HDAC2/Flag-HDAC2m，转染48小时后，在40mMNEM处理条件下，用M2beads做免疫共沉淀，富集HDAC1/2复合体，用抗体Flag、Sin3A（Sin3A复合体特异性亚基）以及RbAp46（Sin3A复合体、NuRD复合体均含有的亚基）做westernblot实验对复合体状态进行分析。结果表明，Flag-HDAC1m免疫共沉淀下来的Sin3A和RbAp46，与Flag-HDAC1免疫共沉淀下来的Sin3A和RbAp46相比，在蛋白量上没有明显差别（图3.2-7A）；而Flag-HDAC2m免疫共沉淀下来的Sin3A和RbAp46，与Flag-HDAC2免疫共沉淀下来的Sin3A和RbAp46相比，同样在蛋白量上也没有明显差别（图3.2-7B）。由此表明，HDAC1/2SUMO修饰位点突变体，对富含HDAC1/2的复合体（如Sin3Acomplex、NuRDcomplex）的形成没有影响。81 华东师范大学博士学位论文图3.2-7HDAC1/2SUMO修饰突变体不影响HDAC1/2复合体形成。A.通过Co-IP实验，检测HDAC1SUMO修饰位点突变体HDAC1m，是否会影响富含HDAC1/2复合体（如mSin3A复合体、NuRD复合体复合体）的形成；B.通过Co-IP实验，检测HDAC2SUMO修饰位点突变体HDAC2m，是否会影响富82 华东师范大学博士学位论文含HDAC1/2复合体（如mSin3A复合体、NuRD复合体复合体）的形成。（40mMNEM处理条件）3.2.8HDAC1/2SUMO修饰突变体抑制其染色质定位前面的结果表明，HDAC1/2SUMO修饰位点突变体，不会通过影响富含HDAC1/2复合体的形成从而影响其组蛋白去乙酰化酶活性。那么我们就想，HDAC1/2SUMO修饰位点突变体，会不会影响HDAC1/2或者其复合体与染色质的结合呢？为解决这个问题，我们在293T细胞中转染Flag-HDAC1/Flag-HDAC1m，Flag-HDAC2/Flag-HDAC2m，转染48小时后胰酶消化收细胞，取1/10细胞作为input样品，其余细胞在40mMNEM处理条件下进行核质分离实验，westernblot实验检测Flag-HDAC1/Flag-HDAC1m、Flag-HDAC2/Flag-HDAC2m在染色质上的定位情况。GAPDH、LaminA/C和H3分别作为细胞质、细胞核和染色质的marker蛋白，通过不同组分的marker蛋白检测，证明核质分离的体系是正常的。由图3.2.8可以看出SUMO修饰的HDAC1/2主要富集在染色质上，修饰位点突变后，HDAC1/2的SUMO修饰条带明显减少，经分析比较，相比于HDAC1/2在染色质上的结合，SUMO位点突变体在染色质上的结合明显减少。83 华东师范大学博士学位论文图3.2-8HDAC1/2SUMO修饰突变体抑制其染色质定位。通过核质分离实验（40mMNEM处理条件下），WB分析HDAC1/2及其SUMO修饰位点突变体HDAC1m/2m与染色质结合差异。（A、B）对input和染色质中的HDAC1/HDAC1m条带进行分析，以input中的量为基数校准染色质中的量（即灰度值chromatin/input），得出Flag-HDAC1的Ratio值为1.61，Flag-HDAC1m的Ratio值为0.86。（C、D）对input和染色质中的HDAC2/HDAC2m条带进行分析，以input中的量为基数校准染色质中的量（即灰度值chromatin/input），得出Flag-HDAC2的Ratio值为1.51，Flag-HDAC2m的Ratio值为0.94。第二部分：SENPs去除HDAC1/2的SUMO修饰研究通过前面探讨，我们证实了HDAC1/2的SUMO修饰能够增强其组蛋白去乙酰化酶活性，SUMO修饰位点突变导致其蛋白稳定性降低、与染色质结合减弱以及组蛋白去乙酰化酶活性降低，那么SENP家族中哪些（个）成员负责HDAC1/2的SUMO修饰去除，进而对HDAC1/2的功能进行调控呢？下面我们继续探究。3.2.9SENP家族蛋白中，SENP1/6/7可以去除内源HDAC1/2SUMO修饰。在293T细胞中外源过表达SENPs家族蛋白，包括SENP1/SENP2/SENP3/84 华东师范大学博士学位论文SENP5/SENP6/SENP7，转染细胞48h后，直接裂解细胞收样，进行westernbolt检测HDAC1/2上shift条带的变化情况。结果显示，单独过表达SENP1/SENP6/SENP7时，能够看到HDAC1和HDAC2上shift条带的减弱，说明SENP1/SENP6/SENP7能够去除HDAC1/2上的SUMO修饰（图3.2.9）。图3.2.9SENP1/6/7可以去除HDAC1/2SUMO修饰3.2.10过表达SENP6能够明显增加组蛋白乙酰化水平既然SENPs蛋白家族中的SENP1/SENP6/SENP7能够实现HDAC1/2的SUMO修饰的去除，那么这种去除是否会影响HDAC1/2的组蛋白去乙酰化酶活性，从而影响组蛋白乙酰化水平呢？首先，在293T细胞中外源过表达SENPs家族，包括SENP1/SENP285 华东师范大学博士学位论文/SENP3/SENP5/SENP6/SENP7，转染细胞48h后，直接裂解细胞收样，进行westernbolt检测，结果显示过表达SENP6/SENP7能够同时明显增加组蛋白H3和H4的泛乙酰化水平，过表达SENP1能够增加组蛋白H3的泛乙酰化水平而没有增加H4的泛乙酰化水平，而其他SENP家族蛋白（SENP2/SENP3/SENP5）未检测到H3和H4乙酰化水平的明显变化（图3.2.10-A）。同时，在HeLa中外源过表达SENPs家族进行细胞免疫染色实验，检测AcH3和AcH4水平。结果显示，过表达SENP6能够明显看到AcH3和AcH4水平的增加，而过表达SENP7也能看到，但没那么明显。而其他SENPs家族蛋白（SENP1/SENP2/SENP3/SENP5）未检测到AcH3和AcH4修饰水平的明显变化（图3.2.10-B,C）。过表达SENP1/SENP7在WB和IF中显示并非完全一致的结果的原因尚不清楚，后续可以作为一个科学问题进行探究。但很明确的是，SENP6可以通过去除HDAC1/2的SUMO修饰抑制其组蛋白去乙酰化酶活性，进而使组蛋白H3和H4的乙酰化水平上升。86 华东师范大学博士学位论文图3.2.10过表达SENP6能够明显增加组蛋白乙酰化水平。A，在293T细胞中分别过表达SENPs家族成员，WB检测组蛋白AcH3和AcH4水平；B和C，在HeLa细胞中分别过表达SENPs家族成员，细胞免疫染色检测组蛋白AcH3和AcH4水平。3.2.11SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖于其去SUMO化酶活性既然SENP6/SENP7通过去除HDAC1/2的SUMO修饰从而影响组蛋白H3和H4的乙酰化水平，那么这种调控是否依赖于SENP6/SENP7的去SUMO化酶活性呢？接下来，我们构建了SENP6的酶活突变体SENP6C1030S和SENP7V713E，然后在293T细胞中，分别过变达SENP6/7的wildtype和mutant，制备蛋白样品，通过Westernblot检测组蛋白组蛋白H3和H4的乙酰化水平。结果显示，在293T细胞中外源过表达wildtypeSENP6后，组蛋白乙酰化水平上升，而过表达了酶活突变体SENP6C1030S（SENP6m）后，组蛋白乙酰化水平未见明显上升；过表达wildtypeSENP7和其酶活突变体SENP7V713E（SENP7m），检测组蛋白乙酰化水平变化与SENP6的结果基本一致，但相对于87 华东师范大学博士学位论文SENP6，影响程度相对较弱。以上表明，SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖于其去SUMO化酶活性。图3.2.11SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖于其去SUMO化酶活性。A，过表达SENP6和SENP6m，WB检测组蛋白AcH3和AcH4水平变化；B，过表达SENP7和SENP7m，WB检测组蛋白AcH3和AcH4水平变化。3.2.12SENP6抑制HDAC1/2蛋白稳定性先前的核质分离的结果表明，SENP6能去除HDAC1和HDAC2的SUMO修饰，进一步我们想探索SENP6去除HDAC1/2的SUMO修饰后是否影响其蛋白稳定性。在293T细胞中，分别过表达Flag-SENP6、Flag-SENP7，设立Vector补齐的对照组，CHX处理细胞，检测对照组和过表达Flag-SENP6、Flag-SENP7组内源的HDAC1/2的半衰期差异。88 华东师范大学博士学位论文图3.2.12SENP6抑制HDAC1/2蛋白稳定性结果显示，相比于对照组，过表达SENP6后，HDAC1/2的半衰期显著缩短，而过表达SENP7也导致HDAC1/2的半衰期缩短，但不及SENP6组明显。这说明，SENP6去除HDAC1/2的SUMO修饰后降低其蛋白稳定性。89 华东师范大学博士学位论文3.2.13SENP6抑制HDAC1/2与染色质结合前面实验表明，SENP6和SENP7促使组蛋白乙酰化水平升高，除了通过降低HDAC1/2的蛋白稳定性之外，还有没有别的途径呢？我们知道SUMO修饰会促进结合染色质，那么，过表达SENPs是否会影响内源的HDAC1/2的染色质定位状态，从而影响其组蛋白去乙酰化酶活性的发挥呢？我们在293T细胞中分别过表达Flag-SENP6和Flag-SENP7，转染48小时后，收细胞进行核质分离实验。Western-Blot检测内源HDAC1/2的SUMO修饰水平及在染色质上的定位情况（图3.2-13）。GAPDH作为细胞质标记物，H3作为染色质标记物。结果显示，SUMO修饰的HDAC1/2主要定位在染色质上，与前期实验结果一致（图3.2-8）。同时也能看到，SENP6能明显去除HDAC1/2上的SUMO修饰，且抑制其在染色质上的定位，但未观察明显的SENP7去除HDAC1/2SUMO修饰的效应。90 华东师范大学博士学位论文图3.2.13SENP6去除HDAC1/2SUMO修饰，抑制其与染色质结合。A．.在293T细胞系中转染Flag-SENP6，核质分离检测内源HDAC1/2SUMO修饰水平及在染色质上的定位情况；B．在293T细胞系中转染Flag-SENP7，核质分离检测内源HDAC1/2SUMO修饰水平及在染色质上的定位情况。91 华东师范大学博士学位论文3.2.14SENP6抑制细胞增殖为了研究SENPs在肿瘤发生发展过程中的作用，我们在293T细胞中，设立空载对照组，分别过表达Flag-SENP6和Flag-SENP7，转染48小时后，细胞计数，铺96孔板，每孔1000个细胞细胞培养液。24h后，加入CCK8（1:10）培养2小时，450nm测吸光度，每24小时观测一次，直至96小时。结果显示，SENP6显著抑制细胞增殖，SENP7也能抑制细胞增殖，但不及SENP6效果显著。图3.2.14SENP6抑制细胞增殖课题组的前期研究发现，肾癌组织中的组蛋白乙酰化水平明显低于癌旁组织，可能的原因是PIASxβ在肿瘤组织中高表达，促进HDAC1/2SUMO化，增强其组蛋白去乙酰化酶活性，从而导致组蛋白乙酰化水平降低。而我们的结果提示，SENP6去除HDAC1/2的SUMO修饰，降低其组蛋白去乙酰化酶活性，导致组蛋白乙酰化水平上升，而SENP6的过表达抑制细胞增殖，这与之前的结果相符。这表明，SENP6或许与肿瘤的发生发展密切相关，其可能扮演一个肿瘤抑制作用。因此，在接下来的研究中，我们将检测肿瘤组织中SENP6蛋白水平与组蛋白乙酰化水平的相关性。92 华东师范大学博士学位论文3.3总结与讨论SUMO修饰与转录抑制密切相关。以往的文献报道认为，HDACs的SUMO化是SUMO介导转录抑制的一大机制。但HDACs的SUMO化抑制转录的具体分子机制尚存争议。有研究认为，是直接通过组蛋白SUMO化发挥转录抑制作用[77]。组蛋白的SUMO化将HDAC1和HP1招募至染色质，导致组蛋白乙酰化降低，从而抑制转录[138,190]。其次，有报道发现p300的SUMO修饰可将HDAC6招募至靶基因启动子区域，从而抑制靶基因转录[85]。此外，SUMO化促进HDAC1[97]和HDAC4[98]的组蛋白去乙酰化酶活性，从而抑制转录。但这两个研究都没有进一步探讨SUMO修饰促进HDACs组蛋白去乙酰化酶活性的具体机制。迄今为止，研究发现HDAC2，HDAC3，HDAC9和Sirt1均能被SUMO化，但尚不明确它们的SUMO化是否改变其去乙酰化酶活性[104,191]。因此，我们的研究是想阐明SUMO修饰通过HDACs介导抑制转录的具体分子机制。我们课题组前期的研究发现，过表达SUMO修饰的E3连接酶PIAS家族蛋白（PIAS1、PIASxα、PIASxβ、PIAS3和PIASy)和SUMO-1，仅PIASxβ能特异性介导组蛋白乙酰化水平的下降，且该现象依赖于PIASxβ的E3连接酶活性。然而PIASxβ并不能介导组蛋白H3、H4的SUMO化，这就否定了PIASxβ介导组蛋白的SUMO修饰占据赖氨酸位点，从而导致组蛋白乙酰化水平的下降。同时，PIASxβ所介导的SUMO修饰也不抑制p300的乙酰转移酶活性，这也否定了PIASxβ介导P300的SUMO修饰后将HDACs招募至靶基因转录启动子区域，从而抑制转录的机制。那PIASxβ是否直接介导HDACs的SUMO修饰呢？随后研究发现，PIASxβ能特异性介导HADC1和HDAC2的SUMO修饰，从而导致组蛋白乙酰化水平降低，而TSA可拮抗该效应。进一步的研究发现，PIASxβ介导的SUMO修饰促进了HDAC1/2的组蛋白去乙酰化酶活性，并不影响HDAC1/2的转录，也不影响含HDAC1/2的复合体的形成，但增加了HDAC1/2的蛋白稳定性，以及其在染色质上的富集。值得注意的是，在我们的后续研究中，通过ChIP-Seq比较游离的HDAC1/2与SUMO修饰mimic的HDAC1/2进一步93 华东师范大学博士学位论文证实了SUMO修饰促进HDAC1/2的组蛋白去乙酰化酶活性。RNA-Seq表明HDAC1/2的SUMO化抑制细胞整体转录水平。该研究到此尚有不完整之处。既往的研究报道，HDAC1的SUMO修饰位点为K444和K476，HDAC2的SUMO修饰位点位于K462。因此，我们构建了HDAC1、HDAC2的SUMO修饰突变体，证实该突变体的SUMO修饰水平显著降低，且其组蛋白去乙酰化酶活性相比于野生型要弱。与之前的研究相一致，HDAC1/2m不改变其亚细胞定位，也不影响含HDAC1/2复合体的形成，但该突变体的蛋白稳定性降低，且在染色质上的富集减少。综上所述，这些结果明确证实了PIASxβ介导的HDAC1/2SUMO修饰一方面通过增加自身蛋白稳定性，一方面促进其在染色质上的定位，从而增强其组蛋白去乙酰化酶活性，导致组蛋白乙酰化水平降低，从而抑制转录。但这也提出了一个新的问题，HDAC1/2SUMO化促进其在染色质上的富集的具体分子机制是什么？由于组蛋白的SUMO化可促进HDAC1招募至染色质，那SUMO在这其中是否扮演着一个linker的作用？因SUMO修饰而被招募到染色质上的蛋白还有哪些？这些问题的回答，能让我们进一步理解SUMO在生命活动过程中所扮演的角色。此外，目前有许多针对HDACs的抑制剂用于肿瘤治疗临床试验，但目前尚无运用于临床治疗的HDACs小分子活性抑制剂（iHDACs）。而我们前期的研究发现，在肾癌组织中PIASxβ高表达与组蛋白乙酰化水平负相关，那是否我们能通过换一种思路，研发出特异性针对HDAC1/2SUMO修饰的小分子化合物从而达到抑制肿瘤的目的。SUMO修饰是一种可逆的、平衡性的蛋白质翻译后修饰。为了进一步研究找出其他调控HDAC1/2SUMO修饰水平的信号，我们将目光投向了SUMO蛋白酶家族（SENPs）。2004年的研究已报道SENP1可特异性去除HDAC1的SUMO修饰，从而抑制AR介导的转录激活[102]。但是没有证实以下几个问题：SENP1是否去除HDAC2的SUMO修饰？SENP1去除HDAC1的SUMO修饰是否影响其组蛋白去乙酰化酶活性？以及是否有其他SENPs家族蛋白参与去除HDAC1/2的SUMO化从而调控转录?94 华东师范大学博士学位论文通过过表达SENPs家族蛋白（SENP1/SENP2/SENP3/SENP5/SENP6/SENP7），我们发现SENP6能特异性去除HDAC1/2的SUMO修饰。过表达SENP6能显著增加细胞整体组蛋白乙酰化水平，且SENP6调控组蛋白乙酰化水平依赖于其去SUMO化酶活性。进一步的研究发现，SENP6抑制HDAC1/2的蛋白稳定性，且抑制其在染色质上的富集。过表达SENP6后，细胞增殖水平显著降低。同时我们的研究发现，SENP7也有调控组蛋白乙酰化水平的能力，但不及SENP6活性显著。既往也有研究报道，SENP7促进染色质的松弛[192]。那是否SENP6也能影响染色质重塑？关于SENP6的研究报道不是很多，SENP6和SENP7主要是去除SUMO-2/3的修饰，对SUMO-1的去除作用相对较弱。本课题的这一部分尚存在许多不完整之处。在接下来的研究中，我们将通过rescue实验，进一步阐明SENP6调控组蛋白乙酰化依赖其去SUMO化酶活性，同时RNA-seq探讨SENP6对整体转录的影响。以往的研究证明SENP1的敲除是胚胎致死的，而目前尚无SENP6敲除的相关结论，因此我们拟将在未来的研究中，利用case9系统构建SENP6敲除的细胞系或小鼠模型，用于进一步的实验研究。由于我们的细胞增殖实验发现SENP6抑制细胞增殖，我们将通过oncomine系统找到与SENP6相关的肿瘤，在病人样本中检测SENP6的表达情况与组蛋白乙酰化的相关性，并进一步探讨这一调控的生理和病理学意义。95 华东师范大学博士学位论文第四章SUMO修饰调控组蛋白甲基化的分子机制研究4.1前言图4-1.基于序列同源性绘制的组蛋白甲基转移酶（HMTs）和组蛋白脱甲基酶（HDMs）系统发育树。HMTs和HDMs催化的组蛋白甲基化位点[193]。96 华东师范大学博士学位论文根据既往的研究报道和我们的前期研究工作，我们发现SUMO修饰增强HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活调控整体转录，这提示我们SUMO修饰与组蛋白乙酰化之间的crosstalk。在众多组蛋白修饰中，除组蛋白乙酰化外，组蛋白甲基化也与转录调控相关。且高通量质谱分析显示，许多组蛋白甲基转移酶（HMTs）和组蛋白去甲基化酶（HDMs）是SUMO修饰的底物[72]。图4-1总结了迄今为止已发现的HMTs和HDMs，及其针对的特定的组蛋白甲基化位点。现有的分子生物学文献报道尚不能完全确定这些HMTs和HDMs是否存在SUMO修饰，以及该SUMO修饰是否影响其组蛋白甲基转移酶活性或组蛋白去甲基化酶活性。因此，我们希望通过利用SUMO修饰系统鉴定SUMO是否调控HMTs和HDMs对组蛋白甲基化状态的影响，并探究其具体分子机制。4.2实验结果4.2.1外源过表达SUMO-1和UBC9能增加H3K4/9/27me3水平97 华东师范大学博士学位论文图4.2.1外源过表达SUMO-1和UBC9检测H3K4me1/2/3，H3K9me1/2/3，H3K27me1/2/3和H3K36me2/3水平。A.293T细胞中WB实验；B.HeLa细胞中WB实验；C.HeLa细胞进行免疫染色实验。98 华东师范大学博士学位论文在293T和HeLa细胞系中，分别过表达GFP-SUMO1，Flag-UBC9，GFP-SUMO1+Flag-UBC9，检测组蛋白甲基化修饰水平，包括H3K4me1/2/3，H3K9me1/2/3，H3K27me1/2/3和H3K36me2/3水平。结果显示，293T细胞WB实验发现，增加细胞内SUMO修饰水平时，H3K4me3，H3K9me3及H3K27me3修饰水平均有增加，其他甲基化水平变化相对不明显（图4.2.1-A)。HeLa细胞中WB实验发现，增加细胞内SUMO修饰水平时，H3K4me3和H3K9me3修饰水平均有增加，包括H3K27me3在内的其他甲基化水平变化相对不明显(图4.2.1-B)。HeLa细胞中免疫染色实验发现，增加细胞内SUMO修饰水平时，H3K4me3和H3K9me3修饰水平明显增加，H3K27me3修饰水平也会有所增加，但程度相对较低(图4.2.1-C)。4.2.2敲低SUMO修饰的E2结合酶UBC9能降低H3K4/9/27me3水平在293T和HeLa细胞中，通过敲低SUMO修饰的E2结合酶UBC9降低细胞内整体SUMO修饰水平，WB检测包括H3K4me1/2/3，H3K9me1/2/3，H3K27me1/2/3和H3K36me2/3的组蛋白甲基化水平，免疫染色检测H3K4me3，H3K9me3及H3K27me3水平。99 华东师范大学博士学位论文图4.2.2敲低UBC9检测H3K4me1/2/3，H3K9me1/2/3，H3K27me1/2/3和H3K36me2/3水平。A.293T细胞系；B.HeLa细胞系；C.敲低UBC9，免疫染色检测H3K4me3，H3K9me3，H3K27me3修饰水平。结果表明，在293T细胞中用siRNA敲低UBC9，WB检测到H3K4me3，H3K9me3，H3K27me3水平明显降低，其他甲基化水平变化不明显（图4.2.2-A）。同样在HeLa细胞中用siRNA敲低UBC9，WB检测到H3K4me3，H3K9me3，H3K27me3水平明显降低，其他甲基化水平变化不明显（图4.2.2-B）；在HeLa细胞中，转染UBC9的shRNA进行免疫染色实验，检测到H3K4me3，H3K9me3和H3K27me3水平明显降低（图4.2.2-C）。4.2.3MLL复合体中的WDR5能发生SUMO修饰通过前面人为改变细胞内整体的SUMO修饰水平，检测组蛋白H3几个位点的甲基化状态，变化比较明显的是H3K4me3，H3K9me3和H3K27me3。经过对相关研究的进一步了解，与HP1α结合的Suv39H1能招募UBC9增强HP1α的SUMO修饰水平，进而促使HP1α更多地被招募至H3K9me3位点。在HP1α富集期间，Suv39H1将起到KMT的作用，催化H3K9三甲基化，进而100 华东师范大学博士学位论文再为HP1a提供结合位点，从而积累H3K9me3，导致其修饰水平升高[118]。SUZ12是催化H3K27的一、二、三甲基化主要由多梳抑制复合物PRC2其中的核心亚基之一，能够发生SUMO修饰，虽然已鉴定出的SUMO位点突变体不影响H3K27me3水平，但SUMO修饰通过PRC2复合体可能是一个影响H3K27me3水平机制[121]。而SUMO修饰影响细胞整体的H3K4me3并没有相关研究，最终我们选择了H3K4me3的变化作为一个研究重点。催化H3K4me1/2/3的SET1A/B和MLL1/2复合物的活性和功能由一个由WDR5，RbBP5，Ash2L和DPY-30（WRAD）组成的常见多基因核心复合物所调控（图1.6-1）。其中组蛋白甲基转移酶与WDR5以1:1的比例发挥催化H3K4me3作用，单独敲除SET1或MLL只影响基因组局部的H3K4甲基化修饰水平，而WDR5的缺失则会引起整体H3K4me2/3修饰水平的变化[194,195]，鉴于此，我们集中研究WDR5这个重要蛋白。首先，我们在细胞内检测WDR5的SUMO修饰状态，在293T细胞中，过表达GFP-SUMO-1和HA-UBC9，检测内外源WDR5的SUMO修饰，IP实验发现WDR5能发生SUMO修饰（图4.2.3-A、B）。101 华东师范大学博士学位论文图4.2.3MLL复合体中的WDR5能发生SUMO修饰。A.检测外源过表达的Flag-WDR5的SUMO修饰；B.在过表达GFP-SUMO-1和HA-UBC9条件下，IP内源WDR5，检测其SUMO修饰。4.2.4SUMO修饰不影响WDR5的转录水平图4.2.4SUMO修饰不影响WDR5的转录水平102 华东师范大学博士学位论文293T细胞中，外源过表达GFP-SUMO-1和HA-UBC9，Western-blot检测发现WDR5蛋白水平上升（图4.2.4-A）；qRT-PCR结果显示WDR5转录水平无变化（图4.2.4-B)。HeLa细胞中，采用两条shRNA敲低UBC9，Western-blot检测发现WDR5蛋白水平下降（图4.2.4-C）；qRT-PCR结果显示WDR5转录水平无明显变化（图4.2.4-D)。4.2.5WDR5发生SUMO修饰增强WDR5蛋白稳定性我们的研究结果显示，过表达SUMO-1和UBC9，WDR5蛋白水平上升，但并不影响其转录水平。因此，我们猜测SUMO修饰可能影响了WDR5的蛋白稳定性。在24孔板中，同等条件铺293T细胞，过表达GFP-SUMO-1和Flag-UBC9，设立对照组，用终浓度为50μg/mL的放线菌酮（CHX，Cycloheximide）处理细胞，检测对照组和过表达组WDR5的半衰期差异。结果表明，对照组中，WDR5的半衰期为8小时左右，过表达SUMO-1和UBC9后，WDR5的蛋白稳定性增加，半衰期延长至16小时左右。这说明，SUMO修饰增加了WDR5的蛋白稳定性。图4.2.5SUMO修饰增加WDR5的蛋白稳定性103 华东师范大学博士学位论文4.3总结与讨论既往的质谱结果显示，许多组蛋白PTMs要么同时存在，要么相互拮抗，这表明它们之间存在密切的交互调控（cross-talk）。组蛋白乙酰化和H3K4me3是研究较多的交叉调控之一。研究表明H3K4me3可通过招募HATs、CBP/p300和HDACs，进行组蛋白乙酰化水平的动态调控。组蛋白乙酰化和H3K4me3，也有被发现在激活基因的启动子和转录起始位点共同存在[196]。SUMO修饰调控组蛋白甲基化的相关研究目前尚不完善，鉴于本课题组在SUMO修饰方面的研究积累，所以希望进一步探索这一科学问题。图4.3MLL复合体的三聚体、四聚体和五聚体[196]组蛋白甲基化是一个动态平衡，由组蛋白甲基转移酶（HMTs)和组蛋白去甲基化酶(HDMs)共同调控。组蛋白不同位点的甲基化修饰需要不同的HMT和HDM催化。H3K4甲基转移酶复合体都具有四个核心亚基：WDR5、RbBP5、ASH2L和DPY-30，它们在进化上具有保守性。这四个核心亚基被称为WRAD复合体，与MLL一起分别组合成三聚体、四聚体和五聚体（图4.3）[196]。我们通过过表达和敲低SUMO酶系，发现SUMO修饰能调控组蛋白甲基化，特别是对H3K4me3有显著的调控作用。同时还发现，WDR5能发生SUMO修饰，这与既往的报道也相吻合[196]。过表达SUMO-1与UBC9，并不影响WDR5的转录水平，但SUMO修饰增强了WDR5的蛋白稳定性。这提示我们，SUMO修饰可能通过调控WDR5的蛋白稳定性从而调控H3K4me3甲基化水平。WDR5和RbBP5对催化H3K4me1/2/3是必需的，而ASH2L和DPY-30侧重于维持H3K4me3水平，WDR5的缺失会影响整体H3K4me2/3水平。当敲低104 华东师范大学博士学位论文SUMO唯一的E2结合酶UBC9时，我们发现H3K4me1/2变化并不显著。因此，我们猜想，SUMO修饰是否影响了MLL四聚体、五聚体的形成？ASH2L和DPY-30上是否存在SUMO修饰？此外，既往研究已证实的能发生SUMO修饰的RbBP5，在SUMO修饰后是否影响其与ASH2L的结合？SUMO修饰与转录抑制相关，而H3K4me3常常作为转录激活的标志物，SUMO修饰增加H3K4me3水平，这之间似乎存在矛盾之处。事实上，在某些情况下，H3K4me3也能招募转录抑制因子。例如，MLL1的PHD3结构域与H3K4me3结合，促进含HDAC1/2的复合体（如Sin3A）招募到特定基因区域，去除乙酰化，从而抑制转录[197,198]。此外，组蛋白H3乙酰化水平调控，通过乙酰转移酶CBP/p300和去乙酰化酶HDAC的组合作用进行，且该机制只在具有H3K4me3修饰的H3尾巴上发生。在SUMO修饰调控HDAC1/2组蛋白去乙酰化酶活性分子机制的研究中，我们已阐明SUMO修饰促进HDAC1/2在染色质上的富集，从而去除组蛋白乙酰化，导致转录抑制。CHIP-Seq结果显示，KDM5B的SUMO修饰能增加其下游靶基因启动子区域上H3K4me3水平，但并不影响其组蛋白去甲基化酶活性[122]。因此，我们应将研究重点放到H3K4me3的甲基转移酶上。WDR5或RbBP5的SUMO修饰导致H3K4me3水平上升，是否是HDAC1/2与染色质结合的原因之一？关于WDR5的SUMO修饰研究，我们可以更深入的探讨：能否鉴定WDR5的SUMO修饰位点？SUMO修饰是否影响其亚细胞定位及其复合体形成？SUMO修饰是否影响其组蛋白甲基化转移酶活性？我们的研究还发现，在过表达SUMO-1和UBC9情况下，H3K9me3和H3K27me3水平上升，相一致的结果是，敲低UBC9时，H3K9me3和H3K27me3水平下降。H3K9me3和H3K27me3是转录抑制的标志物。Suv39H1能将H3K9me1催化为H3K9me3。目前尚无研究表明Suv39H1能发生SUMO修饰，但Suv39H1能在体内、体外实验中通过招募UBC9增强HP1α的SUMO修饰水平，从而将HP1α招募至H3K9me3[118]。在HP1α富集期间，Suv39H1将起到KMT的作用，导致H3K9三甲基化，从而为HP1α提供结合位点，从而导致其积累/保留[118]。105 华东师范大学博士学位论文因此，我们的结果与该研究报道一致。H3K27的一、二、三甲基化主要由多梳抑制复合物（PRC2）催化。该复合体包含四个核心亚基：EZH2/1、SUZ12、EED和RBAP46/48。催化亚基是含有SET结构域的EZH1/2，必须以复合体的形式才能发挥功能[199,200]。SUZ12和EZH2在体外和体内能被SUMO化，但其SUMO化不影响其对H3k27me3的催化活性[121]。因此，SUMO修饰调控H3K27甲基化的机制也是不够清楚，需要进一步的探索。综述所述，SUMO修饰与组蛋白甲基化之间明确存在Cross-talk。他们之间的相互调控的具体分子机制及生物学功能，是我们未来研究的重点。106 华东师范大学博士学位论文参考文献1.Waddington,C.H.,Theepigenotype.1942.IntJEpidemiol,2012.41(1):p.10-3.2.Jablonka,E.andM.J.Lamb,Thechangingconceptofepigenetics.AnnNYAcadSci,2002.981:p.82-96.3.Holliday,R.,Epigenetics:ahistoricaloverview.Epigenetics,2006.1(2):p.76-80.4.Berger,S.L.,etal.,Anoperationaldefinitionofepigenetics.GenesDev,2009.23(7):p.781-3.5.Wolffe,A.P.andJ.J.Hayes,Chromatindisruptionandmodification.NucleicAcidsRes,1999.27(3):p.711-20.6.Bannister,A.J.andT.Kouzarides,Regulationofchromatinbyhistonemodifications.CellRes,2011.21(3):p.381-95.7.Nadal,S.,etal.,Syntheticpost-translationalmodificationofhistones.CurrOpinChemBiol,2018.45:p.35-47.8.Flotho,A.andF.Melchior,Sumoylation:aregulatoryproteinmodificationinhealthanddisease.AnnuRevBiochem,2013.82:p.357-85.9.Martin,S.,etal.,EmergingextranuclearrolesofproteinSUMOylationinneuronalfunctionanddysfunction.NatRevNeurosci,2007.8(12):p.948-59.10.Owerbach,D.,etal.,Aproline-90residueuniquetoSUMO-4preventsmaturationandsumoylation.BiochemBiophysResCommun,2005.337(2):p.517-20.11.Nacerddine,K.,etal.,TheSUMOpathwayisessentialfornuclearintegrityandchromosomesegregationinmice.DevCell,2005.9(6):p.769-79.12.Wang,L.,etal.,SUMO2isessentialwhileSUMO3isdispensableformouseembryonicdevelopment.EMBORep,2014.15(8):p.878-85.13.Zhang,F.P.,etal.,Sumo-1functionisdispensableinnormalmousedevelopment.MolCellBiol,2008.28(17):p.5381-90.14.Zheng,J.,etal.,SUMO-1PromotesIshikawaCellProliferationandApoptosisinEndometrialCancerbyIncreasingSumoylationofHistoneH4.IntJGynecolCancer,2015.25(8):p.1364-8.15.Pichler,A.,etal.,ThenucleoporinRanBP2hasSUMO1E3ligaseactivity.Cell,2002.108(1):p.109-20.16.Tatham,M.H.,etal.,RNF4isapoly-SUMO-specificE3ubiquitinligaserequiredforarsenic-inducedPMLdegradation.NatCellBiol,2008.10(5):p.538-46.17.Gonzalez-Prieto,R.,etal.,c-MycistargetedtotheproteasomefordegradationinaSUMOylation-dependentmanner,regulatedbyPIAS1,SENP7andRNF4.CellCycle,2015.14(12):p.1859-72.107 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华东师范大学博士学位论文附录（缩略语）ASH2LAbsent-Small-Homeotic-2-LikeproteinCBPCREB-bindingproteinDPY30Dumpy-30proteinH3k4me3Trimethylationoflysine4onproteinhistoneH3H3k9me3Trimethylationoflysine9onproteinhistoneH3H3k27me3Trimethylationoflysine27onproteinhistoneH3H3K36me3Trimethylationoflysine36onproteinhistoneH3HATsHistoneacetyltransferasesHDACsHistoneDeacetylasesHP1HeterochromatinProtein1KATsLysineAcetyltransferasesKDACsLysinedeAcetyltransferasesKDMsLysinedemethylasesKMTsLysinemethylasesMLLTheMixedLineageLeukemiaproteinNuRDNucleosomeremodelingandhistonedeacetylasep300Histoneacetyltransferasep300PARP-1Poly(ADP-ribose)polymerase1PIASProteininhibitorofactivatedSTATPRC2Polycombrepressivecomplex2PTMsPost-transcriptionmodificationRanBP2RetinoblastomaBindingProtein5SAE1SUMO-activatingenzymesubunit1SENPsSentrinspecificproteasesSIMSUMOinteractingmotifSin3ASIN3transcriptionregulatorfamilymemberASIRTsNAD-dependentproteindeacetylasesirtuinsSTATSignalTransducerandActivatorofTranscriptionSUMOSmallUbiquitinrelatedModifierSUZ12Suppressorofzeste12homolog(Drosophila)UBC9Ubiquitin-conjugatingenzyme9WDR5WDrepeatcontainingprotein5120 华东师范大学博士学位论文在学期间所取得的科研成果1.GaoS,WangZ,WongJ,etc.ThelysinemethyltransferaseSMYD2methylatesthekinasedomainoftypeIIreceptorBMPR2andstimulatesbonemorphogeneticproteinsignaling.JBiolChem.2017Jul28;292(30):12702-12712.（Co-firstAuthor）2.QiS,WangZ,WongJ,etc.Non-germLineRestorationofGenomicImprintingforaSmallSubsetofImprintedGenesinUbiquitin-likePHDandRINGFingerDomain-Containing1NullMouseEmbryonicStemCells.JBiolChem.2015May29;290(22):14181-91.3.WeiW,LiuX,ChenJ,GaoS,LuL,ZhangH,DingG,WangZ,WongJ,etc.ClassIhistonedeacetylasesaremajorhistonedecrotonylases:evidenceforcriticalandbroadfunctionofhistonecrotonylationintranscription.CellRes.2017Jul;27(7):898-915.4.FangYu,GuangShi,JiweiChen,ShimengCheng,Shwu-YuanWu,WangZ,WongJ,etc.SUMOsuppressesandMYCamplifiestranscriptiongloballybyregulatingCDK9sumoylation.CellRes.2018Mar0:1–16121 华东师范大学博士学位论文致谢时光如梭，岁月如歌。博士毕业之际，六年研究生学习生活点滴历历在目。2011年，我有幸参加生命医学研究所组织的夏令营活动，被学院良好的求学氛围、优良的作风、如画的校园环境所吸引；更有幸与导师翁杰敏教授进行了交流，被他和蔼可亲的态度、严谨治学科研精神所折服。更幸运的是，翁杰敏教授给了我一个宝贵的推荐免试的研究生学习机会。在学习的六年期间，翁老师是我们科研工作的领路人，他广博的专业知识和勤劳严谨的科研精神感染着课题组包括我在内的每一位学生。在此，我要向他致以崇高的敬意和感谢！感谢师母李纪文教授，她不但在学习和科研上给我们悉心指导，在生活上也对我们关爱有加。同时，也要感谢李老师为整个课题组良好运转所付出的心血。此外，也要感谢课题组杜宪兴老师在课题上给予的指导。感谢实验室的每一位兄弟姐妹，我们是相亲相爱的Wonglab大家庭。感谢实验室已毕业的师兄师姐们，李丕顺、齐善康、陈佩林、王荔娜、方兰、高舒曼、魏伟、丁广进，特别感谢高舒曼在SMYD2课题上给予的帮助！感谢同级同学于方、李佳伦、刘晓光、王瑞萍、王振，感谢六年的同窗情谊，六年科研生活见证了我们的共同成长！特别感谢好哥们于方，感谢他在科研和生活上给予的鼓励和帮助，祝愿他在异国他乡一切安好、鹏程万里！感谢实验室的师弟师妹们，彭宇、张会芳、韩蒙蒙、陈兆苏、康莉、徐翔、段小亚、胡畔、王振兴、王文偲、李雯、肖艳辉等等，特别感谢我的师妹彭宇，感谢她在课题研究和论文写作中给予的帮助！感谢410房间内共同奋斗的所有成员，李纪文老师、屠珏翔师兄、于方、刘晓光、徐亮亮、彭宇、蒋小琴、杨雪梨、黄菲、关晴晴、尹敬玉、金建钰师兄，感谢你们给予的帮助！感谢很多，篇幅有限，在此不能一一列出，总之感谢感恩！最后，感谢我的父母和兄弟姐妹，感谢你们一路支持和关心！感谢妻子秦楠和岳父岳母，感谢你们的信任、支持和理解！还要感谢生活赐予我们的如今已经一岁半的儿子，带给我们那么多欢乐和希望！你们是我一生奋斗的不懈动力！六年的研究生生涯，有汗水有笑容，如今即将从学校走向工作岗位，我将继续努力，砥砺前行，愿一切更美好！122
