δ-catenin和e-cadherin在结直肠癌中表达及其临床意义

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1、·中文论著摘要·6-catenin和E．cadherin在结直肠癌中的表达及其临床意义刖吾结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内结直肠癌发病率每年以2％的速度增长。尽管随着诊疗技术的不断进步结直肠癌患者预后有了很大改善，但病死率仍居高不下。导致结直肠癌患者死亡的主要原因是复发和转移，而细胞间粘附的缺失在肿瘤侵袭和转移的过程中发挥着至关重要的作用。E．钙粘蛋白(E．cadherin，E．cad)是一种钙依赖性的细胞间粘附分子，在粘附连接的形成和维持其稳

2、定上发挥着至关重要的作用。E．cadherin通过与多种连环蛋白(catenin，Cat)结合形成钙粘蛋白一连环蛋白复合体(cadherincatenincomplex，CCC)，维持细胞间粘附连接稳定。6．连环蛋白(6．catenin，6-cat)拥有10个犰狳(Armadillo，Arm)重复结构，属于连环蛋白家族的成员之一。最初认为8-catenin仅表达于大脑神经元，但最近的一些研究发现8-catenin与癌症也存在着密切的关联。Burger等报道与良性前列腺增生相比，前列腺癌中fi-cat

3、enin的转录明显上调，其蛋白表达也显著增加。Zhang等又报道了8-catenin在肺癌组织中的过表达并促进非小细胞肺癌的恶性表型。这些研究表明8-catenin与肿瘤的发生发展密切相关。然而，在结直肠癌组织中8-catenin的表达情况如何、8-catenin的表达与结直肠癌临床病理因素之间存在怎样的关系尚不清楚。目前已有研究证明，在脑组织或转染的细胞中8-catenin与[3-catenin和E．cadherin相互交互，共定位于细胞间的粘附连接。而在结直肠癌中8-catenin与E-cadh

4、erin的相互作用关系，目前尚不清楚。本研究中，我们首先通过免疫组织化学方法检测了fi-catenin和E-cadherin在95例结直肠癌患者样本中的表达情况及其与临床病理因素和预后的关系。同时，分别构建过表达或干扰8-catenin的结肠癌细胞系，并借助免疫共沉淀的方法探讨二者的结合情况及8-catenin过表达对E．cadherin表达的影响。．材料与方法一、标本与病人资料95例结直肠癌患者标本及15例正常结直肠组织(外伤等非肿瘤原因肠切除标本)标本，收集自中国医科大学附属盛京医院病理科存档蜡

5、块。其中有详实术后随访资料的结直肠癌标本70例来自2004年4月．2005年7月手术切除的标本。所有病例均为首发，且术前未接受放疗和化疗。男性58例，女性37例，年龄31．87岁(中位年龄61岁)。以InternationalUnionAgainstCancer(UICC)TNM病理分期第六版为标准：I期14例，II期39例，III期30例，Ⅳ期12例。纳入病例均为腺癌：其中高分化35例，中分化43例，低分化17例。另外还收集了30例新鲜结直肠癌及癌旁的正常肠粘膜组织(距癌灶最远端，至少距癌灶边缘5

6、cm以上)用于提取蛋白质，标本取出后立即放入．80℃冰箱保存备用。二、免疫组织化学染色采用Streptavidin．Peroxidase(SP)免疫组织化学方法进行染色，检测8-catenin和E．cadherin在95例结直肠癌标本中的表达及其与各临床病理因素之间的关系，并分析了70例随访标本中二者的表达与患者预后的关系。三、细胞培养，质粒转染和RNA干扰人结直肠腺癌细胞系CaCO．2和SW620分别培养于含10％胎牛血清的DMEM／F12或DMEM高糖培养液中。将8-catenin质粒导入8-c

7、atenin表达较低的caco．2细胞；选择干扰效果较好的8-cateninsiRNA序列导入8-catenin表达较高的SW620细胞系。四、WesternBlot将含50pg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，单克隆抗体8-eatenin或E．cadhefin4"C孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时后ECL显色。2五、免疫共沉淀收集细胞，充分裂解提取蛋白。向300“g蛋白裂解产物中加入3btg诱饵蛋白的抗体，4"C孵育过夜后；加入40¨lProteinA+

8、GAgarose继续4"C孵育3小时。充分洗涤后去除上清，加入30ttl的SDS上样缓冲液水浴变性。将获得的免疫共沉淀产物，随后进行WesternBlot检测。六、细胞侵袭能力的测定为了观察&．catenin对结肠癌细胞生物学行为的影响，我们分别过表达与敲除6-catenin后，利用基质胶侵袭试验来检测细胞侵袭能力的变化。结果一、6．catenin和E．cadherin在结直肠癌组织中的表达蚤．c．．atcnin在正常肠粘膜的胞浆中不表达或呈现较弱的信号，根据评分标准