索拉非尼抑制自然杀伤细胞(nk)促肝癌转移的机制与干预的实验研究

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1、万方数据指导小组成员名单孙惠川吴伟忠任正刚邱双健干鱼上目刘彬彬教授教授教授教授教授副研究员基金资助：cc艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项(2008ZXl0002-019／021)国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项El(81020108025)万方数据复旦大学博士论文IIIIIlIIIIIIIIIIIIIIIIIIIll驴Y2700472目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10正文⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第一部分Sorafenib预处理小鼠诱导其肝癌生长转移潜能增强⋯⋯．．12第二部分Sorafenib抑制NK细胞免疫介导其促转移负面作用⋯⋯．．20第三部分Sorafenib阻断AKT及ERK磷酸化是其抑制NK细胞免疫的重要机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36第四部分联合中药小复方“松友饮”干预及机制研究⋯⋯⋯⋯⋯46结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．66文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7

3、2附件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8l致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82万方数据复旦大学博士论文中文摘要原发性肝细胞癌(HCC)是临床常见恶性肿瘤，目前手术切除仍是最有效的治疗方法，然而大部分患者就诊时失去手术切除机会，而非手术姑息性治疗方法，包括经导管动脉内化疗栓塞(TACE)、射频消融、放射治疗等，疗效均不满意。分子靶向药物的应用是近年肿瘤领域的突破性进展，sorafenib是目前唯一经Ⅲ期临床试验证实疗效并被FDA批准用于晚期肝癌患者的小分子蛋白激酶抑制剂。然而两项III期临床试验包括

4、西方的SHARP研究和东方的ORIENTAL研究均发现sorafenib治疗组生存期仅延长了不足3个月。另一方面，大量研究报道了分子靶向药物治疗肿瘤的负面作用，包括直接和间接的促肿瘤侵袭转移及抑制肿瘤免疫的不利影响。我们前期研究发现，小剂量sorafenib可直接作用于肝癌细胞本身下调抑癌基因HTATIP2的表达，诱导EMT，增加肝癌细胞的侵袭及转移能力。小分子靶向药物还可能影响机体的抗肿瘤免疫功能。是否sorafenib同样可作用于机体免疫功能从而影响其疗效需要进一步探讨。本文用一种预处理模型即先用sorafenib预

5、处理小鼠，然后接种肿瘤，观察其对肿瘤生长转移能力的影响，并从机体免疫中的自然杀伤细胞(NK)方面探讨其治疗肝癌可能的不足之处，并探索提高疗效的途径。1．Sorafenib预处理小鼠诱导其肝癌生长转移潜能增强我们首先对无瘤裸小鼠经sorafenib预处理两周后停药，然后接种各种肝癌模型，观察肿瘤的生长、转移及裸小鼠生存情况，这样可以最大程度体现sorafenib对裸小鼠造成的体内效应对肿瘤生物学功能的影响。结果显示裸小鼠经sorafenib预处理(30mg瓜g，60mg／kg2周)后皮下成HCCLM3肿瘤生长速度加速，肿瘤

6、体积及重量增加；sorafenib预处理(60mg／kg2周)后裸鼠经尾静脉注射HepG2．GFP肝癌细胞后肺转移(肺转移灶体积／总肺体积)增加，荷瘤裸小鼠生存期明显缩短；sorafenib预处理(60mg／kg2周)后裸鼠肝脏原位成LM3．RFP肿瘤，原位瘤无明显改变，但肺转移数目明显增多。为进一步在免疫正常小鼠中验证此现象，sorafenib预处理(60mg／kg2周)C57BL／6小鼠后停药，尾静脉注射小鼠肝癌细胞Hepal．6．GFP，同样发现肺转移形成能力(肺转移灶体积／总肺体积)较对照组明显增强。万方数据复旦

7、大学博士论文中文摘要2．Sorafenib抑制NK细胞免疫介导其促生长及转移负面作用我们用不同剂量sorafenib(30mg／kg，60mg／kg2周)干预C57BL／6荷瘤及无瘤小鼠，从机体免疫方面探讨其可能的负面作用。流式监测结果发现sorafenib显著降低荷瘤及无瘤小鼠外周血及脾脏NK细胞的比率，其中以60mg／kg组降低最为明显，而CD4+及CD8+T细胞比率改变不明显。Sorafenib显著下调荷瘤小鼠NK细胞表面活化标记CD69的表达及杀伤靶细胞(Yac．1)的能力。体外实验中，sorafenib浓度依赖

8、性的抑制健康人NK细胞的活性及杀伤功能。应用中和NKl．1抗体某种程度去除C57BL／6小鼠NK细胞后，sorafenib预处理(60mg／kg2周)介导的促肝癌转移的潜能消失。3．Sorafenib阻断AKT及ERK磷酸化是其抑制NK细胞免疫的重要机制为探讨sorafenib对NK细胞的影响，我们培养永生型细胞系N