酿酒酵母表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的研究 (1)

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1、酿酒酵母表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的研究PreparationofVirus-likeParticlesforPorcineCircovirusType2bySaccharomycescerevisiae学科专业：生物学作者姓名：高田指导教师：黄金海教授天津大学生命科学学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何

2、贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2)对全球养猪业造成极大的经济损失。针对病毒

3、的防御，疫苗接种是有效的措施之一，目前的免疫策略主要基于病毒的衣壳蛋白。真核模式生物酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）因其遗传背景清晰、操作方法成熟等原因，被用于基因功能挖掘或外源蛋白表达的首选宿主。因此，基于PCV2的结构蛋白（Capsid）能在体外自组装成病毒样颗粒（Virus-likeparticles,VLPs）的特性，我们研究了利用酿酒酵母分泌性表达PCV2的Cap蛋白从而口服接种疫苗的可能性。本研究主要包括：（1）多拷贝分泌型酿酒酵母表达载体的分子设计：利用酿酒酵母基因组δ序列存在多拷贝的现象，构建两端带有δ序列同源臂的

4、目的基因整合型质粒，以期获得高表达菌株。实验室已有整合型载体YCplace33-Ptpi-xyn2s-MCS-TadhI，TM在此基础上利用ClonExpress技术将Ptpi启动子更换为Gal启动子；优化流行PCV2Cap基因密码子，分别插入两种表达载体从而探讨不同的启动子对蛋白表达的影响。（2）靶向整合型酿酒酵母表达载体的构建与重组子筛选：将PCV2-Cap蛋白基因（GenBank登录号：KT261750.1）按酿酒酵母偏好密码子优化，利用酿酒酵母转录元件高效构建方法YeastFabAssembly，通过改造的pSMARTHCKan质粒分别承载启动子（

5、PRO），开放阅读框（ORF）和终止子（TER），利用TypeIIs克隆法在单管中装配完成转录单元反应，构建整合型酵母单拷贝分泌型载体，通过RFP报告基因和不同抗性筛选，阳性率可达90%以上。通过醋酸锂转化方法分别将上述两种重组质粒整合至酿酒酵母W303a、JDY52改造菌株的基因组中，成功构建PCV2-Capo-W303a、PCV2-Capo-JDY52重组酵母菌，利用不同营养缺陷型和PCR筛选阳性重组子，筛选比率分别为85:1和10:1。（3）2种重组酵母表达动力学及PCV2VLP的制备：经诱导表达重组Cap蛋白，通过SDS-PAGE、Westernb

6、lot和透射电子显微镜进行鉴定。含有GPD、TEF2的两种不同表达载体VLP的表达产率分别为12µg/mL、25µg/mL。本研究利用不同表达元件构建了多种酿酒酵母重组表达载体，探索了其优劣性；并成功获得了分泌性表达PCV2重组Cap蛋白的酿酒酵母菌株；制备了PCV2的VLPs，并进行了2种重组酵母表达动力学分析。酿酒酵母表达VLP的相对安全性，低成本，潜在激发黏膜免疫，口服途径免疫的优越性，可作为潜在新型的PCV2亚单位口服疫苗，用于PCV2感染的防控。关键词：猪圆环病毒2型，衣壳蛋白，病毒样颗粒，酿酒酵母I万方数据ABSTRACTPorcinecirc

7、ovirustype2(PCV2)hascausedgreateconomiclossestotheglobalpigindustry.Vaccinationisoneoftheeffectivemeasurestocontrolthedisease,Andthecapsidproteinsubunitvaccine.asthecurrentmainlyimmunestrategywereusedinpractice.TheeukaryoticcellmodelSaccharomycescerevisiaeisusedasthepreferredhostf

8、orgenefunctiondiggingorexogenousp