表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

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1、·９４·生物技术中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期表达猪圆环病毒２型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定宋庆庆，李群，李甜甜，黄海琼，范娟，李玉和（金宇集团扬州优邦生物制药有限公司，江苏扬州２２５００８）摘要：本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的猪圆环病毒２型全基因组序列设计并合成了１对能扩增完整Ｃａｐ序列的引物，采用ＰＣＲ扩增猪圆环病毒２型ＹＺ株的Ｃａｐ基因，并将其克隆到杆状病毒转移载体ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ中，获得阳性质粒ｐＦａｓｔ－ＢａｃＨＴＡ－Ｃａｐ；测序后将该质粒转化到大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ感受态

2、细胞中，获得含有Ｃａｐ基因的重组杆状病毒质粒Ｂａｃｍｉｄ－Ｃａｐ；最后将获得的重组杆状病毒质粒Ｂａｃｍｉｄ－Ｃａｐ转染ｓｆ９昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒２型Ｃａｐ蛋白的重组杆状病毒ｒＢａｃｍｉｄ－Ｃａｐ，该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒２型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础。关键词：猪圆环病毒２型；Ｃａｐ基因；克隆；转染；重组杆状病毒中图分类号：Ｓ８５５．３文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００９４－０４猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２，者首

3、先构建了含有ＰＣＶ２的Ｃａｐ基因重组杆状病ＰＣＶ２）是一种无囊膜的单链环状ＤＮＡ病毒，基因毒，并成功表达了大小为３０ｋｕ的Ｃａｐ蛋白，在电镜组长度约为１．７６ｋｂ，是迄今为止发现最小的脊椎下可以观察到Ｃａｐ蛋白具有自我装配成为假病毒动物病毒（Ｍａｄｓｏｎ等，２００９）。该病毒与猪圆环病颗粒的能力。杆状病毒—昆虫细胞表达系统是最常毒１型（ｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＰＣＶ１）同属于猪用的重组蛋白表达系统之一，因其具有安全性高、外圆环病毒，是２种不同的基因型（Ｈａｍｅｌ等，１９９８）。源基因容

4、量大、表达产物可进行翻译后加工等特点，ＰＣＶ１对猪无致病性，而ＰＣＶ２则能引起猪的断奶在多种疫病的研究中得到了应用（Ｌｉｎ等，２０１１）。后多系统衰竭综合征（ＰＭＷＳ）、皮炎与肾病综合本研究利用重组昆虫杆状病毒表达ＰＣＶ２的Ｃａｐ征、呼吸道疾病、繁殖障碍等多种猪圆环病毒相关疾蛋白，旨在为ＰＣＶ２亚单位疫苗、诊断抗原及分子生病，是威胁当前生猪养殖业的重要病原之一，给世界物学研究奠定基础。养猪业造成重大的损失（Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ等，２００７；Ｘｕ１材料与方法等，２０１２）。目前，猪圆环病毒相关疾病仍无特效的１

5、．１材料治疗手段，疫苗免疫是防控该疾病的重要方式，但由１．１．１毒株、菌种和细胞ＰＣＶ２ＹＺ株由扬州优于ＰＣＶ２在细胞上传代时并不能形成细胞病变（ｃｙ－邦生物制药有限公司保存；ｓｆ９昆虫细胞、大肠杆菌ｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ），体外增殖能力差，从而导致了ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ均购自Ｉｎ－病毒滴度较低，限制了高质量ＰＣＶ２疫苗的发展；另ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。外，现有的全病毒灭活疫苗具有刺激性强、易引发注１．１．２主要试剂ＥａｓｙＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、射部位的局部不

6、良反应等缺点。因此，研发成本低ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、Ｔ４连接酶、ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒、廉、产生保护力快、刺激性小的新型ＰＣＶ２疫苗具有ＰｒｏｔｅｉｎＦｉｎｄＡｎｔｉ－Ｈｉｓ单克隆抗体、ＴｒａｎｓＬｉｐｉｄＨＬ重要经济意义。ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ和ＦＩＴＣ标记的羊抗鼠ＩｇＧ均购自北京全式金公司；质粒抽提试剂盒购自ＰＣＶ２的第２个开放阅读框含有７０２个核苷酸残基，共编码２３３个氨基酸，是核衣壳蛋白（Ｃａｐ）的Ｑｉａｇｅｎ公司；昆虫细胞培养基（Ｇｒａｃｅ）购自Ｇｉｂｃｏ公司；抗ＰＣＶ２阳性血清购自Ｖ

7、ＭＲＤ公司；ＦＩＴＣ标主要编码区域（Ｃｈｅｕｎｇ，２００３）。该蛋白含有主要中记的山羊抗猪ＩｇＧ购自ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公和抗原表位，能诱导免疫保护（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ等，２００３；司；其他常规试剂均为国产。Ｋａｍｓｔｒｕｐ等，２００４；Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌ等，２０００）。国外学１．２方法１．２．１引物设计与合成设计并合成１对扩增收稿日期：２０１４－０７－０９作者简介：宋庆庆（１９８５－），男，山东人，博士，研究方向：畜禽病ＰＣＶ２Ｃａｐ基因的引物，引物序列：Ｐ１：５′－ＣＧＧ－原分子

8、生物学。ＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＴＴＴＣ－３′；Ｐ２：中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期生物技术·９５·５′－ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧ－３′，其稀释的ＰｒｏｔｅｉｎＦｉｎｄＡｎｔｉ－Ｈｉｓ单克隆抗体；３７℃孵中加粗碱基为保护性碱基，上、下游引物的斜体碱基育１ｈ；ＰＢＳ清洗３次，甩干后加入１∶２００稀释的分别为ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点。合成Ｍ１３±