sak基因真核载体构建及其转基因细胞表达的研究论文

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1、中文摘要葡激酶基因真核载体的构建及其转基因细胞表达的研究}两矍葡激酶(staphylokinase，SAK)是由金黄色葡萄球菌(staphyloccusaureus)分泌的一种含136个氨基酸残基的胞外蛋白质。采用PCR方法，从金黄色葡萄球菌中获得了葡激酶(staphylokinase，SAK)基因，利用T／A克隆将SAK基因转入到pUCm-TVector中。用限制性酶NotI扣BamHI双酶切绿色荧光蛋白真核载体pEGFP．NI和含有SAK基因的pUCm．TVector，分别得到线型pEGFP．NI基因和SAK基因，并且其都具有N

2、otI和BamHI限制性酶酶切末端。用T4连接酶连接着两个线型基因，重新构建了SAK基因真核载体，并转化JM109细胞，筛选阳性克隆。把重组质粒转化Hela细胞，对转化后的细胞经超声破碎，离心上清和沉淀物进行SDS—PAGE和Westernblot。发现重组质粒在细胞内表达了葡激酶蛋白，并且SAK蛋白主要是以可溶状态存在于细胞内。用热血浆琼脂糖检测重组质粒表达的SAK蛋白活性，发现接种周围有明显的溶解圈，证明了SAK蛋白具有生物活性。在没有饲养层细胞存在的情况下，通过加入细胞因子观查胚盘细胞发育变化，发现在细胞因子作用下可以延缓胚盘

3、细胞的分化，并可以形成更多的胚盘细胞群，为建立原生殖细胞系进行了初步探索。通过脂质体介导，把基因转化到PGCs内，进行体外培养。随着PGCs发育，SAK基因在PGCs内表达。这对用真核细胞生产SAK有重要意义。关键词SAK；PGCs；真核载体硕士论文；SAK基因真核载体的构建表达及其转基因细胞的研究THESTUDYONTHECONSTRUCTIONOFSAKEIJ】互ARIToNVECTORANDEXPRESSl0NINTRANSFECTEDCELLSStaphylokinase(SAK)synthesizedbyStaphyloc

4、occusaureasisa136-·amino·-acidsingle—chainultramembraneprotein．Inthispaper，staphylokinasegenewasamplifiedfromstaphyloccusaureusbypolymerasechainreaction(Pcg)，andiusertedintopUCm—TVectorwithT／Adone．LinearpEGFP-NIandSAKgenewereobtainedbycleavingthegreenfluorescenceprotei

5、neukaryotevectorpEGFP-NIandpUCm-TVectorwithSAKbyNotIandBamHI．SAKfragmentandpEGFP-NIVectorisolatedwereligatedwithT4ligase．TherecombinationplasmidwastransformedintoJM109cells．PositivecolonieswerescreenedandtheplasmidwasextractedfromJMl09cells．Helacellsweretransformedwith

6、therecombinationplasmid，andwerecrashedintopieceswithultrasonicwave．Aftercentrifugation,thesuspendantanddepositwereelectrophoresedbySDS-PAGE，andthentheproteinwasseparatedandidentifiedbyWesternblot．SAKproteinwasfoundexpressedinHelacells．SAKactivitywasexaminedbyagarosewit

7、hplasma，anddistinctivedissolutioncirclewasfoundaroundtheinoculatedlocus，whichdemonstratedthebioacfivityofSAKprotein．Byobservingthedevelopmentofblastodermcellsincultureswithcytokineswithoutfeedingceils，wefoundthatthedifferentiationofblastodermcellswereretainedbycytokine

8、s，andcanformmoreblastodermcellclusters，whichhelpstoestablishprimordialgermcelllines．Byliposomemethod,PGCswastransform