叶绿体基因编码蛋白体外翻译系统构筑

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1、堂翌竺查篁塑坚!生堡笪茎旦塑塑墨皂鲍箜!!塑堡墨堕塑篁!原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：趔笾弓囝麓嘲虫守孙峰：叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑!关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本

2、人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。燃⋯：啤一搿⋯碰r侈◇鼬虫窘孙峰：叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑!中文摘要以高等植物豌豆和烟草叶绿体基因编码的蛋白Dl，细胞色素f和细胞色素b6为研究对象，采用分子生物学基因克隆，体外转录，蛋白质放射

3、自显影分析技术，构建具有翻译活性的同源叶绿体体外翻译系统，以系统深入地研究叶绿体基因编码蛋白的类囊体膜插入合成组装调控的分子机制。所得结果摘要如下：(1)以完整的叶绿体DNA为模板，采用定向克隆策略，构建了具有高保真性能的叶绿体基因编码光系统蛋白D1，Cytf和Cytb6全长基因psbA，petA,petB。采用嵌套PCR方法体外连接烟草psbA85bp翻译强启动子和petB全长基因，构建至体外转录载体pBluescriptIISK／KS(+／-)上；设计双酶切位点引物，克隆了Dl(5跨膜区)和Cytb6(4跨膜区)不同跨膜区截断片段基因(10种)，新引入5’ove

4、rhangs酶切位点消除了体外转录中的3’overhangs，避免了多转录物的产篁三。这为系统研究叶绿体基因编码蛋白何时何阶段稳定插入类囊体膜并组装成功能复合物提供了研究平台。(2)构建了稳定的，高产，特异的体外转录系统。通过延长蛋白酶K消化时间，增加震荡次数，简化纯化步骤，降低了RNase污染转录体系的几率；向目的基因末端统一引入5’overhangs(Hindlid的酶切位点，使得特异性地转录目的基因mRNA成为可能。对lO种基因片段的体外转录实验显示，mRNA转录物产量从2．5—11．6mg／ml之间(纯度oD26以80=1．75．1．85之间)。可作为外源添

5、加的mRNA转录物来源，用于之后的体外翻译体系。(3)制各出具有体外翻译活性的豌豆叶绿体30，0009基质上清(s30)提取液，通过大量种植高代谢活性，低核酸降解活性的幼龄期豌豆，Percoll梯度方法提取完整的叶绿体，缩短提取$30时间，添加蛋白酶抑制剂等保护物质，有效提高S30蛋白质浓度(16-25mg／ral),获得一批具有很强翻译活性的$30提取液，体外翻译实验显示利用该$30提取液翻译出含Cytb6第一跨膜区(包含烟草psbA的启动子)的多肽蛋白。证实该系统具有翻译外源基因的能力。关键词：叶绿体基因编码蛋白定向克隆截断片段基因体外转录体外翻译④a和巍寥孙峰

6、：叶绿体基因编码蛋白的体外翻译系统构筑!·英文摘要Constructionofahomologous／nvitrotranslationsystemofchloroplastencodedproteinsM．A．Student：SunFengSupervisor：Prof．LixinZhangSchoolofLifeSciences，LanzhouUniversity,Lanzhou730000AhomologouschloroplastinvitrotranslationsystemofchloroplastencodedproteinsDj，cytochrome

7、f(Cyt0，cytochromeb6(Cy．tb6)wasestablishedtosystematicallystudythemolecularmechanismofchloroplastencodedproteins’assemblyandregulatoryprocesses．Theresultsobtainedhereweresummarizedasfollows：UsingSite-DirectedPCRcloningstrategyandchloroplastDNAtemplate，fulllengthgenesofDl(psbA)，cytochr