虎榛子促进油松菌根形成及外生菌根真菌pt基因功能分析

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1、分类号S718学校代码10129UDC632学号2011303003虎榛子促进油松菌根形成及外生菌根真菌PT基因功能分析OstryopsisDavidianaFacilitateFormationofMycorrhizaeonPinusTabulaeformisandFunctionalAnalysisofPhosphateTransporterGenefromEctomycorrhizalFungi申请人：峥嵘学科门类：农学学科专业：森林培育研究方向：林木生物技术指导教师：白淑兰教授论文提交日期：二〇一五年十二月摘要在干旱贫瘠的内蒙古大青山阳坡，有虎榛子（Ostryopsi

2、sdavidiana）生长的地段，油松的长势要好于相同条件下无虎榛子的油松，有虎榛子共生的情况下油松的菌根侵染率也要高于一般。虎榛子是否会像菌根促生菌一样是油松的菌根促生植物？为了解决这一问题，在室内选择5种外生菌根（ECM）真菌和油松进行根室共栽实验，测定植物的菌根侵染率、生物量、全N全P含量；土壤pH、酸性和碱性磷酸酶活性等指标，以求解释这一问题，同时筛选出油松的2株优良ECM菌株。P的缺乏是限制植物生长发育的重要因子，在华北地区生长的油松更是如此，油松是一种菌根依赖性极强的植物，而形成菌根的植物可以显著增加对环境中P元素的吸收，我们想从P吸收的角度解释虎榛子的促生作用。

3、植物的P吸收菌根途径高度依赖菌根真菌磷酸盐转运蛋白，要想研究油松菌根真菌的磷酸盐蛋白，必须选择一个合适的内参基因。为此首先克隆分析了油松的2株优良ECM真菌的γ-actin基因，还对这2种真菌进行ITS序列分子鉴定。在上述基础上，继续从这2种真菌克隆出它们的高亲和力磷酸盐转运蛋白基因，对其进行功能验证以及一些特性分析。研究主要结果如下：（1）虎榛子被ECM真菌侵染后，长势要好于未侵染的虎榛子幼苗；虎榛子幼苗能促进油松幼苗形成菌根，油松形成菌根大多是二叉状菌根，菌根形成显著促进了油松的生长。不论是虎榛子还是油松，接种5种ECM真菌后，土壤pH不会发生明显变化，但土壤中酸性和碱性

4、磷酸酶活性均增加，苗木中的全N、全P含量也会明显提高，而且在有虎榛子存在的情况下，菌根化油松的各种指标增加效果更加明显。综合各种指标，在本次研究所选择的5种ECM真菌中，油松的2株优良ECM真菌是浅黄根须腹菌（Rhizopogonluteolus）和球根白丝膜菌（Leucocortinariusbulbiger）。（2）从R.luteolus和L.Bulbiger中分别分离得到肌动蛋白基因Rl-act和Lb-act，均具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Rl-act和Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致，验证了这2个基因作为分子内标的可靠性。（3

5、）分离得到的ITS序列分析显示，R.luteolus的ITS序列与形态差异较大的口蘑属中3种菌ITS序列亲缘关系较近；而L.bulbiger的ITS序列与滑锈伞属的5种真菌ITS序列亲缘关系近，该结果与传统形态分类一致。（4）从R.luteolus和L.bulbiger中分离鉴定出了2个高亲和力的磷酸盐转运蛋白基因RlPT和LbPT。蛋白序列系统发育分析的结果显示RlPT和美味牛肝菌的磷酸盐转运蛋白亲缘关系最近，而LbPT则与大毒滑锈伞的磷酸盐转运蛋白亲缘关系最近。这2个基因的MB192转化型酵母最适生长pH值均为6。亚细胞定位的结果显示这2个基因所编码的蛋白严格在细胞膜上表

6、达。缺陷型酵母功能互补试验证实，均能弥补MB192P吸收缺陷型酵母的磷酸盐吸收能力，RlPT测算的Km值为57.90μmol/L磷酸盐，而LbPT测算的Km值是35.87μmol/L。通过酸性磷酸酶的活性测定，进一步验证这2个基因是具有高亲和力磷酸盐转运蛋白功能的基因。在P饥饿状态下，这2株菌无论是在纯培养或在菌根化油松根系中，RlPT和LbPT均显著上调表达，而在P加富的情况下，对应的基因显著下调表达。这揭示了在华北缺磷地区油松为什么对外生菌根有着高度的依赖性。关键词：油松；虎榛子；外生菌根；磷酸盐转运蛋白；磷吸收OstryopsisdavidianaFacilitateF

7、ormationofMycorrhizaeonPinustabulaeformisandFunctionalAnalysisofPhosphateTransporterGenefromEctomycorrhizalFungiAbstractWefoundthatwhenoutplantedinassociationwithOstryopsisdavidianaplantsonreforestationsites,Pinustabulaeformisseedlingsbecomemycorrhizalan