b型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体的筛选及其活性测定

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1、分类号：Q819单位代码：10193密级：公开学号：Z20130737专业硕士学位论文B型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体的筛选及其活性测定ScreeningspecificantibodyoflightchainproteinofbotulinumtoxinBanddetectingitsactivity作者姓名：李玉洁学位类别：工程硕士专业名称：生物工程研究方向：感染与免疫的分子基础指导教师：赵福广副教授所在学院：生命科学学院独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体

2、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位

3、论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日吉林农业大学硕士学位论文摘要摘要肉毒毒素是肉毒杆菌产生的一种高分子蛋白神经毒素，是目前已知在天然与合成毒素中毒性最强的一种生物毒素。它主要是抑制乙酰胆碱神经递质的释放，从而引起肌肉麻痹，严重的会导致死亡。B型肉毒毒素在欧洲被称为Neuroblo

4、c,也是导致人类肉毒中毒的一种类型。目前有关B型肉毒毒素的研究较少，还没有B型肉毒中毒的救治药物和治疗方法。噬菌体抗体库TomlinsonI+J是由英国剑桥MRCHGMP(HumanGenomeMapping)资源中心建立的，文库拥有1×108单链抗体scFv基因片段，库容量大，多样性高，在未知所筛选物克隆序列的情况下，利用这两个文库，可筛选得到高度亲和力的特异性抗体。因此，这将会为B型肉毒毒素中毒研制特效药及开发B型肉毒毒素抗体制剂奠定坚实的基础。鉴于肉毒毒素轻链在肉毒毒素中毒中的核心作用，本研究通过诱导表达B型肉毒毒素轻链蛋白，得到纯度达90%的蛋白。以此为抗原通过噬菌体抗体

5、库TomlinsonI+J四轮富集筛选，得到数几十株阳性菌株，加诱导剂IPTG诱导表达抗B型肉毒毒素轻链的人源单链抗体。抗体活性的有无或大小至关重要，本实验采用的是绿色荧光蛋白标记法。GFP即绿色荧光蛋白，在蓝色波长范围的光线下激发，能产生绿色荧光，是一种活体报告蛋白。人工合成了SV蛋白的基因，其表达的蛋白质序列包含了SNAP25和VAMP中各型肉毒毒素的切割位点，将绿色荧光蛋白基因（GFP）与SV基因相连成重组基因GFP-SV，并克隆入pET-28a表达载体中，表达并纯化融合蛋白GFP-SV。利用GFP-SV作为底物，根据绿色荧光蛋白的荧光数值变化测定Bont-B抗体的活性。通

6、过人源化噬菌体库筛选及活性检测，获得了三株具有Bont-B中和活性的抗体细胞株，其亲和常数分别为4H（4.38±0.445）×105L/mol，7A（5.35±0.903）×105L/mol，7B（1.146±0.525）×106L/mol。关键词：B型肉毒毒素轻链，噬菌体抗体库I+J，抗体，GFP，活性Ⅰ吉林农业大学硕士学位论文AbstractAbstractBotulinumtoxinisapolymerproteinneurotoxinproducedbyClostridiumbotulinum,isnowknownthemosttoxicofabiologicaltoxi

7、ninnaturalandsynthetictoxins.Aslongasitistheinhibitionofacetylcholineneurotransmitterrelease,causingmuscleparalysis,aseriouscauseofdeath.BotulinumtoxinBisnamedNeuroblocinEurope;itisonetypealsocanleadtofoodpoisoning.Atpresentstudiesonbotulinum