crispr-cas9介导的玉米基因组定点编辑研究

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1、：分类号．单位代码１００１９１２１１学号：Ｂ０２４密级；ｆ的少考乂聲博±学位论文ＣＲ－Ｃａｓ９介导的玉米基因姐定点编辑研究ＩＳＰ民＾ｚｅ－ＴａｅｔｅｄｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｉｕｓｉｎＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ｉｇｇｇ研究生：失余洁：．指导教师赖锦盛教授申请学位口类级别：农学博±作物遗传育种专业名称；研究方向＝玉米功能基因组学所在学院：农学与生物技术学院２０１５年Ｕ月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我

2、个人在导师指导下进行的研充工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名；时间；么Ｃ公年＂月ＪＩ日关于学位论文使用授权的说明、使用学位论文的规定本人完全了解中国农业大学有关保留。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部口和机构送交论文的纸质版

3、和电子版，允巧论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博±学位论文全文数据库》或《中国优秀硕±学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。［保密的学位论文在解密后应遵守此协议）：＂学位论文作者签名：时间＜＾如年月＜＾１０／导师签名：时间；Ｗ夕年月邸／摘要玉米是世界范围内种植范围最广，产量最高的粮食作物，为保证我国及世界粮食安全做出了重要贡献，同时玉米还是饲料和工业加工的重要原料。在世界人口不断増加，农业资源不断减少，而气候

4、环境条件不断加剧的多重圧力下，开发用于玉米遗传改島的新技术，对于揭示玉米重要农艺性状的作用机理及性状的遗传改良具有重要意义。基因打靴技术，在基因组原位实现对基因的玉米遗传改良和分子设计的理想途径一。作为精确，是口新兴的第三代人工、定点、可遗传修饰ＩＲ－核酸酶技术，由ＲＮＡ介导的ＣＲＳＰＣａｓ９系统Ｗ其系统构建简单、精准度髙、成本低、能同时－对多个位点进行定点编辑的备项优势，成为目前研巧的热点。本研巧探索了利用ＣＲＩＳＰＲＣａ巧对，玉米基因组实施定点突变的技术体系搭建了玉米基因组高效定点突变

5、的技术平台，主要结果如下：１（ｒｅｃｏｃｍｓｅｗｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ．况ｐｔｏｆｙｏａｓ９系统的核也组分优化了酿腺链球菌ｇ。根据玉米？基因沮密码子的使用特点，对Ｃａ巧基因的密码子进行了优化，在Ｚｗ蛛Ｚ启动子的驱动下，通过玉米原生质体瞬时转化，成功检测到优化后Ｃａｓ９蛋白的表达及核定位。同时在玉米基因组中对驱动ｓｇＲＮＡ转录的ＰｏｌｍＲＮＡ聚合酶类启动子进巧挖掘，成功筛选出有功能的玉米Ｕ６ｓｎＲＮＡＺｍＵ－基因启动子６ｌ，并在玉米的原生质体中检测到ｓＲＮＡ的转录ｇ。２ＲＮＡ

6、识．根据ｓｇ别的範向位点的序列特征，在玉米全基因组范围内筛选出高度特异的ＲＮＡＲＰＲ－ｓｇ帮标序列，建立了全基因狙范围ＣＩＳＣａｓ９介导玉米基因组定点编辑的靴点序列数据ＩＲ－９库。通过玉米原生质体瞬时转化的方法，在设计的７６个内源位点处，成功检测到ＣＲＳＰＣａｓ－－，０１８％７８３ｉＲＮＡＺｍＵ６ｌ的作用活性位点的剪切效率在．．８％。同时确定Ｐｏｉｎ聚合酶类启动子＂＂的转录起始位点可Ｗ为除ＧＷ外的其他核巧酸，扩大了玉米基因组ＲＮＡ鞭标序列的选择范Ｓｇ围。＞３－．ＷＺｗＰＳｎ基因作

7、为示例对ＣＲＩＳＩＲＣａｓ９介导产生的遗传突变的类型、突变的可遗传性－。研巧表明ＣＲＩＳＰＲＣａ生的遗传变异主要Ｗ短片段碱基的插入和及遗传特点进斤研巧ｓ９介导产一－缺失为主，同时遗传变异可Ｗ稳定的遗传给下代，并且只要细胞内存在ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９就能继续对未进行修饰的祀向位点进行编辑。ＲＩＲ－１－４，．对ＣＳＰＣａｓ９介导ＲＧＮ位点的识别特异性研究发现ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９对筛选的潜在－脱祀位点没有产生非特异性剪切，位点识别特异性较好。同时，通过转录组数据分析发现，ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９体

8、系对ＲＧＮ１突变材料的全基因组基因的表达水平没有产生影响。然而对玉米基因组其他位点定点编辑产生的突变体材料，却发现可能由Ｃａｓ９蛋白引起脱辆事例。因此，建立综合的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９Ｃａｓ９体系位点识别特异性的评估系统，尽量降低蛋白引起的位点脱祀，对于我们高效应用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａ巧进行玉米基因沮定点编辑十分必要。－：玉ＣＲＩＳＰＲＣａ９关键词米，ｓ，基因组定点编辑ＩＡｂｓ