基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术

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1、基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术[摘要]Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats（CRISPR）系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑。该系统在crRNA的指导下，使核酸酶Cas识别并降解外源DNA，其中，Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单，仅包括一个核酸酶Cas9与

2、tracrRNA：crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术的核心为将tracrRNA：crRNA设计为引导RNA，在引导RNA的指导下Cas9定位于特定的DNA序列上，进行DNA双链的切割，实现基因组的定向编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。[关键词]:CRISPR-Cas9系统；基因组编辑技术；核酸内切酶简介近年来，基因组编辑

3、技术(genomeengineeringtechnologies)的快速发展为生物学研究带来了新纪元。与传统的基因克隆技术不同，基因组编辑技术可直接在基因组上进行ＤＮＡ序列的敲除、插入、定点突变以及组合编辑等，实现基因功能与调控元件的系统研究，在工业生物工程等方面具有广阔的应用前景。早期，基因组编辑技术主要利用同源重组介导的打靶技术，但由于效率较低(10－６~10－９)，极大地限制了其应用。为解决这一难题，一系列人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术被开发，可通过在基因组特定位置上形成DNA双链断裂（DNAdoublestrandbreak，DSB)，借助于细胞自身的修复系统如

4、非同源末端连接（non-homologousendjoining,NHRJ）或同源重组（homologydirectedrepair，HDR），从而实现在不同生物与细胞类型中有效的定点基因组编辑。目前，已有４种不同的人工核酸内切酶应用于基因组编辑:巨核酶技术(Meganucleases)、锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，ZFN）与RNA靶向DNA内切酶Cas9。[1]CRISPR研究历史1987年，日本课题组在K12大肠

5、杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[2]，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，科学家将其正式命名为clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)[3-5]．因为缺乏病毒和质粒的序列信息，初期对CRISPR的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明．2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。2006年，美国研究小组通过生物信息分析预测

6、，CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能[6]．但这些都只是假设．2007年，Barrangou等[7]首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵．2008年，Marraffini等[8]又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能，由此科学家们揭开了研究CRISPR系统作用机制的序幕。之后研究人员很快发现CRISPR系统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为研究的热点。[9]CRISPR-Cas9系统的作用机制Crispr/cas系统是很多细菌和古生菌的一种获得性免疫系统，在已经完成测

7、序的细菌中占40%古生菌中占90%，它通过CRISPR对入侵的外源核酸分子或者病毒进行特异性地识别并用CAS蛋白对其切割消化，从而达到对自身的免疫性保护。CRISPR是一段特殊的DNA重复序列，长度通常为21~47个碱基，可变的间隔序列为26~72个碱基。Cas存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。在细菌和古生菌中Crispr/cas系统主要分为三种类型，根据核心元件和序列的不同又分为约10种亚型。菌体通过摄取，表达以及干涉三个基本过程发挥