hep介导禽致病性大肠杆菌ce129病原性的研究

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1、＇３風舖心芝；彎键苗攀￥，．：．＾斯＇巧ｒ＾济許藻袁．／矣Ａ，－寺辦ｔ游．０於：‘方鼻據叫大聲；＃ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ．＂，分、．、＜＊＾＂一＊：一．读＂參＾硕去学住冷丈，，；；：心糸’’‘若；＾無（学术型）＇＇巧＇Ｈｅ介导禽致病性大肠杆菌１２９病原性的硏究＜ｐ＾＾－、－形柳．ｊ．＊庐卷■’一－‘Ｉ．．．＊？辛－＜ｖ＾＾２２５００９■Ａ：江苏额州：指导教师姓名朱国强教授，扬州大学，，、＾－、．．．去学科专业名称申请学位级别；硕：垫度

2、盖堅ｉ＿＿勺２０？１５年６论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：月＇、学仿暢予草仿－；扬州大學学位授予日期：２０１５年６月：，‘六、、答辩委员会主席：郭爱珍教授．乂．户＾—識、满－卷也＞舞ｙ．讀杉起难少辦省心二Ｖ乂乂心苗誇寒友；瑣Ｖ．接辦警．．．＇．汾海．片軒攝茲．＞／．令，—二立占令＾Ｈｅｐ介导禽致病性大肠杆菌化１２９病原性的硏究ＳｔｕｄｙｏｎＨｅｐｍｅｄｉａｔｅｄＡＰＥＣＣＥ１２９ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ研究生：张琪导师：朱国强教授扬州大学畜禽

3、病原微生物实验室２０１５年６月Ｉ张與Ｈｅｐ介导舍致病性大肠巧菌ＣＥ１２９瘤原性的巧究Ｈｅｐ介导禽致病性大肠杆菌化１２９病原性的研究中文摘要ｖ一禽大肠杆菌病（ＡｉａｎＣｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）是养禽业最严重的传染病之，给养禽业造成了巨大经济损失ｉａｎＰａｔｈｏｅｎｉｃ化，至今尚无有效的防治措施。禽致病性大肠杆茜（ＡｖｇＡＰＥＣ）分离株众多，其详细致病机理还有待深入研究，但是已经证实众多的毒力基因是ｍ一其主要致病因子Ｉ型分泌系统（ｔｅＶＩｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｓｔｅＴ６ＳＳ）是，。Ｖｙｐｙ，

4、种新型分泌系统ＨｅＩ＾Ｈｑｐ管道是其主要结构，在细菌致病过程中扮演重要角色。本研究ｊ主要亚单位Ａｗｊ和Ａｅｐ；基因为切入点，探讨其在ＡＰＥＣＣＥ１２９菌株感染宿主过程中的病原性。试验通过比对ＮＣＢＩ上；２巧／、知？＾基因的已知序列，利用隆菌体Ｒｅｄ同源重组系统；对禽致病性大肠杆菌（ＡＰＥＣ）野生株ＣＥ１２９的ＶＩ型分泌系统（Ｔ６ＳＳ）＆巧／和Ａ巧２基困一沁和基因进行敲除对引物用于检测实验菌株ＡＰＥＣＣＥ１巧是否含有，。首先各设计’引物分别与ＧｅｎｅＢａｎｋ中已知的的９／和Ａｃ／７２基因序列５端同源。然后根据试验菌株的的！

5、７／’’一Ａｃ和沁７２基因再各设计对引物，其５端分别与／和Ａ巧２基因序列两侧同源，而３端则／ｆ与质粒ｐＫＤ３的氯霉素抗性基因同源，用于获得带氯霉素抗性基因的ＰＣ民产物，纯化后导入含有质粒ｐＫＤ４６的ＡＰＥＣＣＥ１２９菌株中，在Ｒｅｄ重组酶Ｂｅｔａ、Ｅｘｏ、Ｇａｍ作用下，氯霉素抗性基因片段依靠两侧同源序列与细菌染色体的範基因发生重组，将Ａｅｐ／和一基因置换下来，通过氯霉素抗性平板筛选获得阳性克隆，即完成次重组。再电转化导入编码Ｆｌｐ重组酶的质粒ｐＣＰ２０，通过对Ｃ诚两侧Ｆｌｐ位点的识别，消除抗性基因，即完成二次重组。最

6、后通过ＰＣＲ特异性检测和测序结果，验证缺失株ＣＥ１巧巧／、ＣＥ１２９加巧２和的成功构建。体外竞争试验结果表明，缺失株在与野生株的竞争中处于微弱劣势，相比，，其毒力被轻度弱化。血清杀菌试验结果显示野生株ＣＥ１２９缺失株畑１２９如巧／、ＣＥ１２９２１／２ＣＰ２、ＣＥ１２９＾ｉＡｗＭ／呼２巧抗血清补体杀菌的能力分别下降３２．７％、化１％和５０．６％（只＜０．０１）。生物膜定性定量试验结果表明，处Ｃ於缺失株形成生物膜能力下降４０％（？＜０．０１），回补株上升至８７％ｄＤＦ１细胞熟附试验结果表明，－ｄＡｃ於缺失／＜株的熟附能力下降

7、４６％（；７０．０１），回补诛上升至９６％。鸡化体内感染试验结果显示，苗Ａｃ护和单缺失株在鸡巧体内的増殖水平约为野生株的Ｖｓ，双缺失株约为野生１株的／２。ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ定量试验结果显示，Ａｃ；？／和的！７２基因具有协同表达关系；相比野生株ＣＥ１２９，缺失株ＣＥ１２９２１＆巧；对群体感应／ｗｘＳ、似成、／诉基因表达量分别下降２９％、ＩＩ扬州大学硕壬学位论文４１％、３３％（；？＜０．０５），Ａｃｐ／回补株分别上升至８５％、％％、％％，对抗血清存活因子０Ｗ如和ｍ基因表达量分别下调２９％和２４％（ｐ＜０

8、．０５），回补株分别上升至１０９％和１０５％；缺失株沈口９如对菌毛抑７＾基因表达量下调４７％（７＜０．０１），知补株上升至８８％，