serex法筛选免疫相关性全血细胞减少症患者造血细胞靶抗原及其初步鉴定

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1、分类号：R55学校代码：10062密级：学号：2012601123博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：SEREX法筛选免疫相关性全血细胞减少症患者造血细胞靶抗原及其初步鉴定TITLEScreeningautoantigensonthehematopoieticcellofimmuno-relatedpancytopeniapatientsbySEREXandpreliminaryidentificationofthescreenedautoantigens一级学科：临床医学二级学科：内科学血液病学论文作者：郝山凤指导教师：邵宗鸿教授天津医科大学研究生院二O一五年五月

2、分类号：R55学校代码：10062密级：学号：2012601123学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：SEREX法筛选免疫相关性全血细胞减少症患者造血细胞靶抗原及其初步鉴定TITLEScreeningautoantigensonthehematopoieticcellofimmuno-relatedpancytopeniapatientsbySEREXandpreliminaryidentificationofthescreenedautoantigens一级学科：临床医学二级学科：内科学血液病学论文作者：郝山凤指导教师：

3、邵宗鸿教授导师组成员：付蓉教授王化泉主任医师天津医科大学研究生院二O一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：2015年05月20日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供

4、查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：2015年5月20日导师签名：日期：2015年5月20日中文摘要目的：筛选并鉴定出可能会作为免疫相关性全血细胞减少(immuno-relatedpancytopenia,IRP）患者骨髓造血细胞上的自身抗原。背景：IRP是一种免疫介导的血细胞减少症。前期研究发现IRP发病机制首先是某种原因引起T淋巴细胞调控失衡，Th2细胞比例增多导致B淋巴细胞数量/亚群/功能异常，进而产生抗骨髓未成熟造血细胞自身抗体并破坏或抑制骨髓造血，

5、最后引起的血细胞减少症候群。但是IRP自身抗体所攻击的造血细胞上的靶抗原目前尚不明确，之前本中心利用SDS-PAGE联合免疫印迹法发现了几种靶抗原，包括G蛋白偶联受体（GPCR）156变异体，P链人红细胞带3蛋白，乳铁蛋白及WD重复序列蛋白。自身免疫性疾病的靶抗原往往数个甚至数十个，所以以上方法所验证的抗原仅为极少数，因此本实验采用重组cDNA表达文库的血清学分析法（SEREX）继续寻找IRP自身抗体的靶抗原，并且进一步验证其抗原性。材料与方法：我们构建了K562细胞的噬菌体展示文库，用它替代人骨髓CD34+细胞的蛋白文库。然后用IRP患者和正常健康对照血清对这个文库进行血清免疫学分析。噬菌

6、体表达蛋白的初步挑选是建立在患者与正常健康对照组患者的血清抗体对靶蛋白亲和力差别的基础上,噬菌斑与IRP患者血清孵育，挑选出阳性噬菌斑进行洗脱、扩增、铺板、筛选，若阳性噬菌斑与患者血清呈阳性反应，而与正常血清孵育呈阴性反应，则进行该阳性噬菌斑测序。噬菌体表达蛋白的基因序列确认后，将该噬菌体携带的cDNA片段进行相对应蛋白的表达纯化。我们将FTL,TRMT112,TRAPPC三种基因分别进行基因克隆并且连接入表达载体pEASY-E1，连接成功的重组载体转入宿主菌Ecoli-BL21进行相应蛋白的表达；并对表达的蛋白进行WB验证以及镍柱纯化。最后我们用纯化的蛋白包被ELISA板，用121例IRP

7、患者和15例MDS患者，14例SAA患者以及34名健康对照血清通过间接ELISA方法来检测血清抗FTL抗体的水平以及抗EPOR抗体的水平，并且通过RT-PCR检测了FTL以及EPOR的mRNA表达水平。最后我们对IRP患者的临床指标进行了分析。结果：1.成功构建了cDNA表达文库，文库的库容，代表性以及重组率均符合下一步继续筛选的要求。-I-2．通过免疫印迹的方法初步挑选出了11个阳性噬菌斑，经过提取质粒测序