talen技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究

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1、《诚和皆聲從中＠资３刮ｇ終硕±研究生学位论文Ｗｍｍｍ？？？－？：＇－．－－？．．．．－北京协和医学院研究生院．＇．．？＂．’、．学校代码：３１００２学号：Ｓ２０口０２０００１硕±学位论文ＴＡＬＥＮ技术构建斑马鱼先天性化＼脏病巧基因嵌除模型的研究所院：国家卫生计生委科学技术研究所姓名：刘静指导教师：孙德明研究员导师小组；孙德明何嘉玲学科专业；动物学研究方向：疾病动物模型完成日期：２０１５年４月２７日中国医学科学院＆北京

2、协和医学院硕±学位论文目录摘要ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩＩ０Ｕ胃１１、斑马鱼概述１２、斑马鱼胚胎也脏发育概述１３、、先天性屯脏病与併化／基因概述２４、ＴＡＬＥＮＴ３４．１ＴＡＬＥＮ技术简介３４．２ＴＡＬＥＮ技术的原理３４．３ＴＡＬＥＮ的构建方法４４．４ＴＡＬＥＮ技术应用５５、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９５６、本文的研究意义５材料和方法６实验材料６１、实验动物６２、菌种、质粒６３、工具醇６４、试剂盒６

3、５、其他试剂６６、主要仪器及耗材６７、主要试剂配制７实验嫌８１、基本方法８中国医学科学院＆北京协和医学院硕±学位论文１．１斑马鱼伊化ＪＴ若基因的提取８１．２引物设计与合成８１．３ＰＣＲ扩增目的片段９１．４电泳检测ＰＣＲ产物９．５１０１普通ＰＣＲ产物纯化１．６质粒的提取１０１．７质粒的双酶切鉴定１１１．８普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收１１１．９触１２１．１０１２氯化钩法制备感受态细胞１．１１转化１３．１２１３１阳性克

4、隆的筛选与鉴定１．１３体外转录１３．１４斑马鱼饲养及繁殖１１４１４．１．１斑马鱼的饲养环境１４１．１４２斑１４．马鱼饲料１．１４．３斑马鱼的雌雄鉴别１５１．１４．４受精产卵１５１．１４１５．５庇胎解化１．１４．６幼鱼的培育１５１．１５显微注射１５Ｕ６现脉１６２、ＴＡＬＥＮ实验流程１６２．１敲除祀点的选择与确认１６＂＂２ＭＤ－．２采ＴＡＬＥ１７用单元组装法构建ｐ载体中国医学科学院＆北京协和医学院硕±学位论文２．３构建ＴＡＬＥＮ表达终载体

5、１７２．４ＴＡＬＥＮ粒体外转录Ｓ质１８２．５ＴＡＬＥＮ１８体内活性检测２６／１．敲除动物模型检测８斑马鱼饼化结果与分析１９１、斑马鱼拼化／基因的範点分析结果１９２、化／基因扩增与敲除祀１９阱点比对＂＂３－、单元组装法构建ｐＭＤＴＡＬＥ载体２０－－３ＭＤ－ＭＤ－．１左半位点（ｐＴＡＬＥＬ）、右半位点（ｐＴＡＬＥＲ）构建方案．．．．．．．．２０－３ＭＤ－－－．２左半位点（ｐＴＡＬＥＬ）、右半位点（ｐＭＤＴＡＬＥＲ）构建过程．．．．．．．．２１－－４－ＰＥＡＳ－Ｒ２

6、４、ＰＣＳ２Ｌ和ＰＣＳ２ＰＥＲＲ终载体的构建与鉴定５ＴＡＬＥＮ体内２５、活性检测６、斑马鱼饼拍４敲除动物模型检测２７６．１酶切法检测ＴＡＬＥＮ敲除效率２７６．２Ｆ检测ｏ代基因型２８６３斑马鱼胚胎屯、８．脏结构观察及也率的测量２；讨１＆３０３３参考趙３４３８附录１：综述附录２：中英文缩略词表４７附录３：所用载体信息４９附录４；测序结果５０５５１附录：个人简介致谢５２中国医学科学院＆北京协和医学院硕±学位论文独创性声明巧

7、５３学位论文版权使用授权书中国医学科学院＆北京协和医学院硕±学位论文摘要一目的先天性也脏病（ＣＨＤ）是人类种非常普遍和具有破坏性的出生缺陷性疾病，其发生与卿基因突变有关。卿Ｗ参与调控也肌细胞中某些特定基因的表达，对也肌细胞的形成、必脏前体细胞的迁移和分化、也瓣膜及间隔发育等具有重要作用。基因敲除技术构建各基因敲除的动物模型有助于人类先天性一屯、脏病致病机制和治巧的进步研究。类转录激活因子效应物核酸酶ＴＡＬＥＮ（）介导的铅向修饰技术是目前广泛使用的成熟的基因敲除技术，它主要含有两个

8、重要的结构域：持异性识别核酸的靴点识别域和切断ＤＮＡ序列的核酸酶功能结构域。人工构建针对醉的４一外显子的重组核酸酶ＴＡＬＥＮ基因第，在体内对特定位点产生ＤＮＡ双链断裂，利用细胞自身ＤＮＡ损伤后的ＮＨＪＥ引入基因突变、敲除或敲入，实现基因定点修饰的目的，并建立斑马鱼先天性也脏病ｇａ的４基因敲除的动物模型