口蹄疫病毒2b蛋白拮抗rig-i抗病毒作用研究

《口蹄疫病毒2b蛋白拮抗rig-i抗病毒作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文口蹄疫病毒2B蛋白拮抗RIG-I抗病毒作用研究TheStudyonFMDV2B-inducedAntagonisticEffectsonRIG-I-mediatedAntiviralActivity王国庆指导教师姓名刘磊教授（甘肃农业大学兰州730070）郑海学研究员（中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046）学科专业名称预防兽医学研究方向兽医微生物学与免疫学论文答辩日期2015年5月28日学位授予日期2015年6月19日答辩委员会主席陈智华教授评阅人蒲万霞研究员

2、孙晓林教授2015年6月ClassificationNo.：Secrecylevel：UDC：Schoolcode：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeTheStudyonFMDV2B-inducedAntagonisticEffectsonRIG-I-mediatedAntiviralActivityPostgraduate:WangGuo-qingAdvisor:Prof.LiuLeiProf.ZhengHai-xueSpeci

3、ality:PreventiveVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryMicrobiologyandImmunologySubmittedDate:May2015Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要口蹄疫病毒所引起的口蹄疫是偶蹄动物的烈性传染病，世界动物卫生组织(OIE)一直将其列为法定必报病，在我国被农业部列为一类传染病之首，口蹄疫的暴发往往会导致严重的经济损失。RIG-I样受体是天然免疫系统中一类重要的模式识别受体

4、，能够识别细胞质中的病毒RNA。RLR信号通路既受到宿主的严格调控，也能够作为病毒逃逸宿主抗病毒反应的靶点。目前，很多RNA病毒拮抗RIG-I抗病毒天然免疫的分子机制已经研究清楚，而口蹄疫病毒对RIG-I抗病毒作用的拮抗机制研究尚不明朗。本研究以口蹄疫病毒拮抗RIG-I抗病毒天然免疫为切入点，构建了猪RIG-I以及A型口蹄疫病毒蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、2B、3A、3B、3C、3D）的真核表达质粒，并通过westernblotting和间接免疫荧光实验对构建的真核表达质粒进行了表达验证，证明其成功表达，同时证明猪

5、RIG-I蛋白定位于细胞的胞浆中。感染实验发现口蹄疫病毒能够诱导细胞内RIG-I的转录上调，表明两者间存在着重要联系。过表达实验证实RIG-I具有抑制FMDV复制的作用，而下调表达RIG-I可以促进FMDV的复制，表明RIG-I在机体抗口蹄疫病毒感染过程中发挥着重要的作用。同时，在口蹄疫病毒感染过程中，还发现RIG-I在蛋白水平上随感染时间的延长会被逐渐降解。随后将构建好的口蹄疫病毒各个病毒蛋白质粒分别与RIG-I质粒共转染293-T细胞，发现口蹄疫病毒2B蛋白可以降解RIG-I，而且通过westernblotting和间接

6、免疫荧光实验证实2B蛋白可以剂量依赖性的降解RIG-I。为了确定2B蛋白与RIG-I互作的结合域，本研究将2B基因分为三段分别构建了突变体质粒，命名为2B（1-50）、2B（50-100）、2B（100-150），接着将2B各个突变体质粒分别与RIG-I质粒共转染293-T细胞，发现2B（100-150）即2B羧基端可以降解RIG-I。然后又对2B和内源性RIG-I的关系进行了研究，结果发现2B蛋白可以剂量依赖性的抑制内源性RIG-I的转录和表达，进一步开展了2B及其突变体过表达实验，结果证实2B（1-50）即2B氨基端可以

7、抑制RIG-ImRNA的转录。为了探明2B是通过与RIG-I直接互作还是通过其他途径来进行降解RIG-I的分子机制，笔者又做了间接免疫荧光、免疫共沉淀以及蛋白酶体和溶酶体抑制实验，结果显示2B和RIG-I存在共定位并发生互作，并且2B降解RIG-I不利用蛋白酶体和溶酶体途径，而是通过与RIG-I直接互作发挥降解作用。总之，本研究证实了猪RIG-I具有抗口蹄疫病毒感染的功能，并且发现口蹄疫病毒2B蛋白具有拮抗猪RIG-I抗病毒天然免疫的作用，初步探明了2B蛋白降解RIG-I的分子机制。这些研究结果，揭示了口蹄疫病毒免疫逃逸的机

8、制，为进一步研究宿主与病原间相互作用的分子机制以及开发抗病毒药物和研制新型疫苗提供了理论依据。关键词：口蹄疫病毒；RIG-I；天然免疫；2B蛋白；拮抗机制I甘肃农业大学2015届硕士学位论文summarySummaryFoot-and-mouthdisease(FMD)isahighlyi