rig-i与几种病毒相互作用的分子机理研究

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1、分类号S859.7学校代码10129UDC11.220学号2009301025RIG-I与几种病毒相互作用的分子机理研究StudyonMolecularMechanismofInteractionofRIG-IandSeveralViruses申请人：杨彬学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物传染病与免疫病理学指导教师：王凤龙教授田波研究员论文提交日期：二〇一二年四月摘要维甲酸诱导基因I(retinoicacidinducible–geneI,RIG-I)是细胞质中的模式识别受体，RIG-I能够识别病毒复制产生的双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)和

2、5’三磷酸基团的单链RNA(singlestrandedRNA,ssRNA)，并且通过激活I型干扰素来引发抗病毒免疫反应。本实验以肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CoxsackieA16，CA16）以及人类免疫缺陷病毒(HIV)为研究对象，探讨RIG-I激活后对EV71复制的影响，RIG-I对EV71和CA16及HIV的非编码区(UTR)的识别作用，柯萨奇病毒A组16型和HIV对RIG-I介导的信号通路的影响，以明确RIG-I介导的抗病毒免疫应答以及病毒对RIG-I的抑制机理。1．分别用Poly(I:C)和表达RIG-IN端的质粒转染RD

3、细胞，24h后感染EV71，24h后收获细胞和上清。提取细胞RNA并反转录为cDNA，Real-timePCR测定细胞中RIG-I与IFN-的mRNA的表达水平和EV71的RNA水平，用免疫印迹的方法检测RIG-I和EV71的蛋白表达水平，将感染病毒的细胞上清进行病毒滴度的测定。研究结果表明：RIG-I被激活之后RIG-I与IFN-的mRNA的表达水平上升，并且RIG-I的蛋白表达可以被检测到。感染细胞中的EV71的RNA水平和病毒蛋白表达水平下降，并且病毒滴度显著降低。2．将表达RIG-I全长的质粒和带有IFN-启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒及内对照报告载体转染293T细胞，

4、24h之后将体外转录合成及纯化的EV71、CA16和HIV的UTR转染293T细胞，24h后检测报告基因活性。将UTR转染RD细胞，24h后用免疫印迹的方法检测IRF-3的单体和二聚体。将带有绿色荧光蛋白(GFP)的IRF-3转染RD细胞，24h后将UTR转染RD细胞，24h后荧光显微镜观察。将转染Flag-RIG-I质粒的RD细胞提取物与生物素标记的RNA孵育，用streptavidinagarosebeads将细胞提取物pull-down，之后SDS-PAGE分析并用抗Flag的抗体免疫印迹。将RIG-I与UTR进行免疫共沉淀实验。研究结果表明：UTR能够诱导IFN-启动子的活

5、性，转染UTR后，内源的IRF-3的二聚体可以被检测到，并且可以使活化的IRF-3进入细胞核，RNA结合试验证明合成的UTR能够与RIG-I相结合。3．将带有IFN-启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN--luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞，之后用CA16感染细胞，24h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞，在感染6h、12h、24h以及48h后用Real-timePCR方法测定细胞中IFN-的mRNA的表达水平。将pIFN--luc、pRL-CMV、表达RIG-I质粒和表达CA16的3C蛋白质粒或HIV的蛋白酶共转染细胞，24h后检测报告基因活性。将表达RIG

6、-I基因N端质粒、带有绿色荧光蛋白GFP的IRF-3质粒以及表达CA16的3C蛋白或HIV的蛋白酶共转染细胞，24h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒、表达IPS-1的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒或HIV的蛋白酶共转染细胞，24h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质间相互作用。研究结果表明：CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调，CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶抑制了RIG-I诱导的IFN-的启动子活性以及IRF-3的核迁移，CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶与RIG-I存在相互作用，并且3C蛋白和HIV的蛋白酶阻碍了RIG-I对接头蛋白IPS-1的招募。研究证实：RI

7、G-I的激活以及其诱导的IFN-对EV71的复制有抑制效应；EV71、CA16和HIV的UTR可以被RIG-I识别并且激活信号转导从而诱导Ⅰ型干扰素的产生；CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶通过与RIG-I相互作用从而抑制RIG-I介导的IFN-的诱导。关键词：维甲酸诱导基因I；干扰素调节因子3；干扰素；肠道病毒71型；柯萨奇病毒A组16型；人类免疫缺陷病毒StudyonMolecularMechanismofInteractionofRIG-Ian