外切菊粉酶的热改性研究

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1、分类号密级UDC编号硕士研究生学位论文外切菊粉酶的热改性研究Studyonthethermalmodificationofexo-inulinase学院生命科学学院专业名称微生物学研究生姓名何丽梅学号1523120016导师姓名周峻沛职称教授黄遵锡职称教授2018年6月8日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全

2、意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：彳＾＃＠ｗｇ年６月Ｂ日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人授权云，允许论文被查阅和借阅南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、缩印或扫描等复制手段保，可以采用影印存和汇编本学位论文。学位论文作者签名指导教师签名：日ｐｆ１年６月Ｓ／年／月ｆ日Ｉ摘要摘要菊粉富含于菊芋、菊苣等多种菊科植物中，是一种来

3、源丰富的可再生资源。菊粉能被菊粉酶水解，生产果糖或高果糖浆、菊粉寡糖和燃料酒精等产品，在食品、医疗保健、生物能源等方面都有广泛的应用。本文所研究的InuAGN25DVS是一种低温外切菊粉酶。地球总面积的大约75%都属于低温环境，很适合低温酶作用；在低温下的处理可防止营养损失和食品品质降低，酶的生产需要酶具有良好的热稳定性，而低温酶普遍热稳定性差，需要在保证活性的同时提高热稳定性；随着温度降低，酶的催化活性往往降低，需要提高酶在低温下的活性。为了得到热稳定性提高的InuAGN25DVS突变体或者低温活性提高的InuAGN25DVS突变体，本

4、文通过理性设计的方法设计了删除137EEDRK141的突变体MutE137Δ5、8点突变的N61E-K156R-P236E-T243K-D268E-T277D-Q390K-R409DMut8S、删除了InuAGN25DVSN端3个氨基酸—Q23、T24和G25的MutQ23Δ3。将野生酶和突变酶在大肠杆菌中进行异源表达、纯化，切除纯化酶的His标签，并进行酶学性质测定，研究结果如下：1.突变体MutE137Δ5的最适pH为6.0，与野生酶InuAGN25DVS一样；最适温度为35℃，与野生酶相比下降了10℃，在30℃时相对酶活比野生酶增加

5、了约20%，在低温下的活性有了提高。在50℃下保温1小时后野生酶有约65%的相对酶活，而突变体MutE137Δ5有约40%的酶活。2.突变体Mut8S的最适pH为6.5，较野生酶增加了0.5个pH；最适温度为40℃，与野生酶相比下降了5℃；在50℃下保温1小时后野生酶有约65%的相对酶活，而突变体Mut8S的相对酶活基本没变为100%。3.突变体MutQ23Δ3的最适pH为6.0，与野生型酶InuAGN25DVS一样；最适温度是45℃；在50℃下保温1小时后野生酶有约65%的相对酶活，而突变体MutQ23Δ3的相对酶活基本没变为100%。

6、I摘要本文通过理性设计的方法得到了1个低温活性提高的外切菊粉酶MutE137Δ5、2个热稳定性提高的外切菊粉酶Mut8S和MutQ23Δ3。本研究提高了低温外切菊粉酶InuAGN25DVS的应用潜能，同时也为糖苷水解酶第32家族外切菊粉酶的热改性及相关适应机理提供依据。关键词：菊粉；菊粉酶；热改性；理性设计IIAbstractAbstractInulinisrichinvariousasteraceaeplantssuchasJerusalemartichokeandchicory,andisarichsourceofrenewabler

7、esources.Inulincanbehydrolyzedbyinulinasetoproducefructoseorhigh-fructosesyrup,inulinoligosaccharides,andfuelalcohol,whicharewidelyusedinfood,healthcare,andbio-energy.InuAGN25DVSusedinthispaperisalow-temperatureexo-inulinase.About75%ofthetotalareaoftheearthbelongstoalow-t

8、emperatureenvironmentandissuitableforlow-temperatureenzymeaction.Treatmentatalowtemperaturecanpr