家蚕体内活性氧代谢及相关基因表达调控

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1、分类号：Q965学校代码：10712UDC：595.7研究生学号：2010060052密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文家蚕体内活性氧代谢及相关基因表达调控学科专业农业昆虫与害虫防治研究方向：昆虫生化与分子生物学研究生张磊指导教师：吕志强教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌Classificationcode:_Q965_Universitycode:10712UDC:595.7Postgraduatenumber:2010060052Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorth

2、westA＆FUniversityin_2015_REACTIVEOXYGENSPECIESMETABOLISMANDREGULATIONOFRELATEDGENESINTHESILKWORM,BOMBYXMORIMajor:AgriculturalEntomologyandPestControlResearchfield:InsectphysiologyandbiochemistryNameofPostgraduate:LeiZhangAdviser:Prof.ZhiqiangLuDateofsubmission:May2015YanglingShaanxiChina项目资

3、助本研究得到国家自然科学基金资助（31272497）ThisworkwasfinanciallysupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(no.31272497).家蚕体内活性氧及相关基因表达调控摘要自然界中，病原微生物主要通过食物传播进入宿主体内。昆虫通过取食感染细菌后，肠道是抵御外界病原物的第一重要防线。肠道免疫主要通过肠道上皮细胞产生活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）及抗菌肽（Antimicrobialpeptide,AMP）来防御病原菌浸染。家蚕作为重要的模式昆虫，也具有重要的

4、经济价值，研究家蚕免疫机制及抗病机理对于建立病原-微生物模型建立及蚕病的防治具有重要意义。本研究中我们利用革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus,S.a；黑胸败血菌Bacillusbombyseptieus,B.b；藤黄微球菌Micrococcusluteus,M.l及肺炎链球菌Streptococcuspneumonia,S.p）及革兰氏阴性菌（绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa,P.a；粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens,S.m及鼠疫耶尔森菌Yersiniapseudotuberculosis,YPIII）通过喂

5、食及注射两种方式感染家蚕，统计家蚕死亡率，然后检测家蚕肠道及血淋巴中的H2O2浓度变化，并通过半定量PCR及荧光实时定量PCR检测了中肠组织中活性氧代谢相关基因及抗菌肽基因的转录变化情况。随后我们利用原核表达得到了家蚕过氧化物酶5（BombyxmoriPeroxiredoxin5）的重组蛋白并对其进行了体外活性检测，并同样利用定量PCR检测了细菌感染后BmPrx5在中肠，脂肪体及血细胞中的转录变化情况。主要结果如下：(1)通过细菌注射感染结果证明，革兰氏阴性菌（S.m及P.a）对家蚕的平均致死率高于革兰氏阳性菌（S.a及M.l）。喂食S.m后中肠活性氧代谢相关基因上调最为明显

6、,所有生成ROS的基因的变化倍数低于分解ROS基因的变化，导致感染后肠道H2O2水平一直低于对照。(2)通过细菌喂食感染家蚕证明家蚕致病菌黑胸败血菌（B.b）比绿脓杆菌（P.a）具有更强的致病性，喂食感后8h可诱导家蚕肠道内H2O2水平显著升高，当感染时间增加，进入到血腔中的细菌同样引起血淋巴中活性氧水平的显著升高。通过荧光实时定量PCR研究ROS代谢相关基因的表达变化，结果显示P.a感染后8h可诱导肠道内双氧化酶（Duox）及过氧化氢酶（CAT）的转录上调，而感染后16h，P.a可诱导一氧化氮（NO）合成关键基因（一氧化氮核酶2，NOS2）的上调表达，喂食细菌感染同样可以诱

7、导家蚕中肠抗菌肽基因的上调表达，而抗菌肽Glovorin2及Glovorin3在感染初期转录上调最为明显。进一步证明ROS、NO及AMP的产生在家蚕肠道免疫防御中的重要作用。(3)我们克隆了家蚕过氧化物酶5（BmPrx5）基因的cDNA序列，基因ORF全长565bp，编码188个氨基酸残基。序列分析结果显示BmPrx5含有两个Cys（Cys48及Cys152）属于atypical2-Cys过氧化物酶家族。通过原核表达及纯化得到重组蛋白BmPrx5，体外活性检测显示BmPrx5具有降解H2O2及保护DNA