棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研究

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1、密级:论文编号:中囯农业r科学院学位论文棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研究StudyonRapidMolecularDetectionTechniqueofVerticilliumdahliaeofCotton硕士研宄生.•庞莉指导教师：蒋细良研宄员申请学位类别：理学硕士专业：微生物学研宄方向：微生物农药工程培养单位：植物保护研宄所研宄生院2015年4月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的

2、材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：t莉时间：j〇t5年彡月二5日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名：&$时间：年3月上日中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研宄论文作者庞莉专业微生物学研究方向微生物农药工程指导教师蒋细

3、良培养单位（研宄所、中心）植物保护研究所姓名职称单位专业签名中国农业大学农学宋渊教授微生物学评与生物技术学院中国农业科学院植生物化学与分子生物阅杨秀芬研宄员物保护研究所学人答辩中国农业大学农学杨定教授农业昆虫与害虫防治主与生物技术学院席中国农业科学院植邱德文研究员农业微生物学.物保护研宄所中国农业科学院植生物化学与分子生物张杰研宂员物保护研究所学答中国科学院动物研张润志研究员农业昆虫与害虫防治宄所辩中国农业大学草地张英俊教授草业科学研宄所委员;会议记录（秘书）1妫论文答辩时间地点2015.05.19中日楼301会议室密级：论文编号：中国农业科学院学位论文棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研究

4、StudyonRapidMolecularDetectionTechniqueofVerticilliumdahliaeofCotton硕士研究生：庞莉指导教师：蒋细良研究员申请学位类别：理学硕士专业：微生物学研究方向：微生物农药工程培养单位：植物保护研究所研究生院2015年4月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudyonRapidMolecularDetectionTechniqueofVerticilliumdahliaeofCottonM.S.Candidate：LiPangSupervisor

5、：ProfessorXiliangJiangMajor：MicrobiologySpecialty:MicrobialPesticideEngineeringApril2015摘要棉花黄萎病（cottonverticilliumwilt）主要是由大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）侵染引起的，是一种严重危害棉花生产的世界性土传真菌病害。该病菌可以在土壤中存活多年，成为翌年棉花病害的重要侵染源。因此，快速及时地检测出棉花黄萎病菌，对棉花黄萎病的早期监控预警及后期防治具有重要意义。土壤是棉花黄萎病菌生存的主要场所，但是由于土壤中存在着种类繁多且不计其数的微生物，从土壤中直接分

6、离得到病原菌十分困难；另一方面，由于土壤中腐植物质等抑制因子的存在，直接从土壤中提取病原菌DNA也比较困难。本研究改进了土壤中棉花黄萎病菌的DNA提取方法，并运用巢氏PCR技术，建立了土壤中棉花黄萎病菌的快速分子检测体系，具有高度的特异性和灵敏性，为建立基于微流控PCR技术的棉花黄萎病的快速检测技术奠定基础。论文主要研究结果如下：1、设计了棉花黄萎病菌的特异性引物VDS-F/VDS-R，通过反应条件优化，建立了棉花黄萎病菌的常规PCR检测体系，特异性扩增产物大小约520bp，检测灵敏度达到10pg级。该体系检测特异性强，可以准确检测棉花黄萎病菌的三种不同菌株VD、V991、V250，还可

7、以特异性地从含有棉花黄萎病菌的土壤及棉花植株组织中检测到病原菌。2、分析比较了5种土壤基因组的提取方法，建立了液氮研磨-试剂盒方法提取土壤棉花黄萎病菌DNA的标准程序。利用此方法提取的土壤棉花黄萎病菌基因组DNA质量较高，可以满足后续PCR扩增的要求。3、建立了土壤中检测棉花黄萎病菌的巢氏PCR检测技术。巢氏PCR第一轮引物为ITS1/ITS4，第二轮引物为VDS-F/VDS-R。利用改进的土壤提取方法提取带菌土壤的总DNA，该巢氏