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万方数据浙江大学硕士学位论文单位代码：!Q335学号：21Q!鱼!鱼鱼洳≯J、暗硕士学位论文中文论文题目：英文论文题目：堕主i!i圣堑Q坠Q￡主Q丕也鱼!墨鱼丝盟也gQ￡鱼Q笪Q坠agamSt比砌C刎Z“聊W1lt‘．T厂．··TT·‘1‘ 万方数据浙江大学硕士学位论文Im叭m帅叭Ⅷ吣㈣呲帆V2696185棉花抗黄萎病的毒素鉴定技术研究论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3： 万方数据浙江大学硕士学位论文Utilizationoftoxillforscreenillgofcottonagainst圪厂ffcf，厅“mwiltAumor’ssignature：Supervisor’ssignamre：Ex锄iningCom加itteeChai叩erson：ExamiIlingCommitteeMeInbers：Dateoforaldefence：2Q13=Q3：Q墨 万方数据浙江大学硕士学位论文浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘芏或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日 万方数据浙江大学硕士学位论文目录目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯i致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．工工Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯工工I1文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1棉花黄萎病的研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1棉花黄萎病的危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2棉花黄萎病菌种的形态与分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．3棉花黄萎病菌的病征及其致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．4棉花黄萎病菌的传播途径及其防治方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．5棉花与黄萎病菌的互作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．1．6棉花抗黄萎病育种研究的进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2棉花黄萎病菌毒素的研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～71．2．1真菌毒素的概念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．2黄萎病菌毒素的成分及其物理特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．3黄萎病菌毒素的产毒条件及其提取方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3棉花抗黄萎病性的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101_3．1棉花抗黄萎病鉴定的分类方法和病情分级标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．3．2棉花抗黄萎病性的鉴定——病原菌活体鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．3．2．1棉花抗黄萎病性的鉴定——成株期鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．3．2．2棉花抗黄萎病性的鉴定——苗期鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3．3棉花抗黄萎病性的鉴定—毒素鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．4黄萎病菌毒素在棉花抗病鉴定中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．5本研究的内容、目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．5．1本研究的主要内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．161．5．2本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172棉花黄萎病菌的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．2．1．1供试菌种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．1．2供试培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．1．3实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19 万方数据浙江大学硕士学位论文目录2．2．2．1不同黄萎病菌菌落形态的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．2．2黄萎病菌的分子检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．2．2．1真菌基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．2．2．2分子检测黄萎病菌⋯⋯：⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202_3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202_3．1不同黄萎病菌菌落的形态特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．3．2黄萎病菌的PCR检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223棉花成株期抗黄萎病性的鉴定——温室盆钵接菌法⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2．1．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．1．2供试棉花品种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．1．3培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．2．1．4实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。253．2．2．1菌麦的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．2．2菌土的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．2．3棉花幼苗的培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．2．4播种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．2．5病情调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．263．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．3．1棉株的发病情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．263．3．1．1棉株的发病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．3．1．2棉株叶片的病情调查结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．2棉花茎杆杆的发病情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．3．2．1棉花茎杆杆的发病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．2．2棉株茎杆杆的病情调查结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．3．3棉株平均病指的调查结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．304棉花苗期抗黄萎病性的鉴定——无底纸钵蘸根法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．324．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．324．2．1．1供试菌株和供试棉花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．2．1．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．2．1_3实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．2．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．334．2．2．1孢子液的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯334．2．2．2无底纸钵蘸根法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯334．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34 万方数据浙江大学硕士学位论文目录4．3．1棉苗发病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．344．3．2棉苗发病情况调查结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．354．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．365毒素鉴定棉花抗黄萎病性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯385．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．385．2．1．1供试菌株和棉花品种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．385．2．1．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．395．2．1．4实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯405．2．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．405．2．2．1毒素的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯405．2．2．2毒素蛋白浓度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯405．2．2．3非基于组织培养技术的毒素鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯415．2．2．3．1毒素对棉籽胚根生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．415．2．2．3．2叶片涂抹毒素法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯415．2．2．3．3毒素浸根法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯425．2．2．4基于组织培养技术的毒素鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯425．2．2．4．1无菌苗的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯425．2．2．4．2愈伤组织的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．425．2．2．4．3筛选培养基上最适毒素鉴定浓度(以安阳菌为例)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．435．2．2．4．43种不同黄萎病菌毒素对棉花愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．445．2．2．4-5毒素对不同棉花品种愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．445．2．2．4．5．14种棉花愈伤组织在不含毒素的培养基上的生长情况比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯445．2．2．4．5．2毒素(以安阳菌毒素为例)对4种棉花愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯．445．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．455．3．1棉花黄萎病菌产毒量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一455．3．2非基于组织培养技术的毒素鉴定法的可行性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯455．3．2．1不同黄萎病菌毒素对棉种胚根伸长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯455．3．2．2叶片涂抹毒素法鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯465．3．2．3毒素浸根法的鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯485_3-3基于组织培养技术的毒素鉴定法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯505．3．3．1高温灭菌后的毒素和未灭菌毒素(以安阳菌毒素为例)的活性差异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯505．3．3．2毒素在愈伤组织培养基上的最适鉴定浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯525．3．3．33种不同黄萎病菌毒素对棉花愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．535．3．3．4毒素(以安阳菌毒素为例)对不同棉花愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯555．3．3．4．14种棉花愈伤组织在不含毒素的培养基上的生长情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．555．3．3．4．2毒素(以安阳菌毒素为例)对4种不同棉花愈伤组织生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯．575．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59参考文献：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61 万方数据浙江大学硕士学位论文致谢本研究是在导师王学德教授的悉心指导下完成的。王学德老师从论文选题、试验设计、实验材料到论文撰写等各个环节都给予了精心的指导和帮助。两年半以来，导师渊博的专业知识、严谨的治学态度、求是创新的科学精神、敏锐的洞察力以及对科学执着的探索精神等对我产生了深刻的影响，使我终生受益。导师多年来的谆谆教诲和在学习、科研、生活上的关心照顾，让我感觉到慈父般的温暖，值此论文完成之际，谨向王老师表示诚挚的感谢与崇高的敬意!在浙江大学读研期间，我得到了许多老师和同学的关心、鼓励和帮助。衷心感谢浙江大学的祝水金教授、石春海教授、胡晋教授、邬飞波教授、曹家树教授、汪自强教授、吴建国副教授、张宪银副教授、金晓丽副教授、洪彩霞老师和张帆老师等在学业上和生活上对我的关怀和指导。感谢实验室同门袁淑娜、Noreen、waqas、倪密、范凯、赵亦静、李凤、王铭等在学习、科研和生活等中给予我的关心、支持和帮助。同时，感谢同学王复标、王兵、文婷婷、秦国臣、Ⅵchea、尚可、余世洲、欧婷、闫成海、李红艳等对我在科研和生活上的帮助，特别感谢我的室友张春娇、王瑞果、王晶，在我最低落、最无助的时候，是她们不断的鼓励我，给我力量，对我的生活无微不至的关心和照顾。论文的顺利完成得益于老师和同学在科研、生活和学习上给予我的帮助和支持，在此真诚的感谢他们!感谢浙江省金华市农业科学研究院的郑寨生推广研究员、蒋梅巧老师等对我学习上、科研实践、生活上的关心和帮助!感谢我的父母和姐妹多年来在生活、学习上对我的鼓励和支持!最后，谨向参加本论文评阅和答辩的各位专家致以最真挚的感谢!两年半时光匆匆而过，慈爱的王老师、热情的同学们、美丽的紫金港、恬静的华家池，是你们陪伴我走过了这样幸福快乐而又不断收获与提升的两年半，这两年半也将成为我生命中最宝贵的财富，在此愿大家永远开心幸福!张改霞2013年3月于浙江大学 万方数据浙江大学硕士学位论文摘要棉花黄萎病是棉花生产过程中最具毁灭性的病害之一，属于土传病害。棉花黄萎病菌具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久等特点。防治棉花黄萎病最简单、经济、有效的方法是选育抗病品种。然而，国内外棉花抗黄萎病品种的培育进程缓慢，其中，除了棉花抗性种质资源的缺乏外，另一个重要原因就是缺乏一套简单、快速、高效的棉花抗黄萎病性鉴定方法。为了解决以上问题，本研究试图用毒素代替病原菌鉴定棉花抗黄萎病性，并分析了毒素鉴定在棉花抗黄萎病性鉴定中的可行性，结果如下：1．采用温室盆钵接菌法和无底纸钵蘸根法分别比较V08sn．1、安阳菌、V07d亿3种黄萎病菌的致病力差异，结果表明3种黄萎病菌对棉花的致病力呈显著性差异，其中V08sn．1致病力最强，安阳菌中等，V07d亿最弱。且两种方法所得出的黄萎病菌致病力间呈明显的正相关，相关系数为O．933，但所得出的棉花抗黄萎病性级别却不完全吻合。其中，通过以上两种接菌方法，棉花Z儿0584对V08sn．1均表现为感病；而对安阳菌分别表现为感病和耐病；对V07d也分别表现为耐病和抗病。2．毒素抑制棉花胚根伸长的实验验证了黄萎病菌毒素具有致病活性。利用叶片涂抹毒素法和毒素浸根法，测定3种黄萎病菌毒素对棉花的致萎度。结果表明，这3种毒素对棉花致萎度呈显著性差异，且以上两种鉴定方法与温室盆钵接菌法的鉴定结果都呈明显的正相关，相关系数分别为0．847和0．856。此外，这两种毒素鉴定方法所得出的棉花黄萎病抗性级数与温室盆钵接菌法完全吻合。说明毒素鉴定法用于棉花抗黄萎病性鉴定是可行的、准确的。3．i贝0定毒素处理对棉花愈伤组织生长的影响，实验结果表明，不同毒素处理对棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量的影响呈显著性差异，且棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量与温室盆钵接菌法的鉴定结果呈明显的正相关，相关系数分别为．0．822，0．913，O．963。此外，同一毒素对不同棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量的影响也呈显著性差异，说明基于组织培养技术的棉花抗黄萎病鉴定方法是可行的。本研究表明用毒素代替病原菌鉴定棉花抗黄萎病性是可行的，为加快棉花抗黄萎病育种进程提供了技术保障。基于组织培养技术的棉花抗黄萎病鉴定方法为毒素代替抗生素用于转基因材料的筛选和鉴定提供了新的思路，减少了抗生素的使用量，大大降低了实验成本。关键词：棉花黄萎病菌毒素组织培养抗病性 万方数据浙江大学硕士学位论文Abstract昆力fcf胁“mwiltisasoil-bomedisease，andcausesⅡlemostdeVastatingdiseasesincottona11oVertheworld．殆Ⅳfcf胁“聊如砌口PhaVeawidegeo脚icaldistribution，widehostraIlgeanddiss锄inatedbymanyways，melongsulⅣiValtimeandsoon．HoweVer’noea’ectiVe如n百cidesareaVaildbleagainstthjspathogen．Themostsimple，economicalandef．fectivememodtocontrolingcotton圪所cf胁“mwiltisbreedingresistantV撕eties．However，meprocessofbreedingissoslowaIldtimecons啪mg，onereaSonb咖nd廿1isislackofresistantg锄plasmresources，Ⅱleotherislackingasimple，fast，andemcientidelltificationmemodoffmdingcottonresistaIlceto阮r“c舭“，，zwilt．TbsolVetheproblem，misstudyusedtoxinsisolated舶m跆，．ffcf刀“m如^，f口einsteadofusingpathogenforidenti伽ngofcottonresistanceto跆，．ffcf胁比垅wilt．Theresultsareasfollows：1．Cottonplantswere孕owninpotsandinfectedwimthreedi岱叮eIlts仃ainsof跆，．ffcf胁“聊如Jiz以口Pn锄edV08sn一1，Anyanga11dV07df2．Theresultsshowed吐1atalls仃ainsof跆疗fcfZfZ“聊如，i眈ecouldcausediseaSe，howeVermede伊eeofVimlencewasdi侬=rent．V08sn-1washi曲lyVimlent，AnyaIlgismedium，andV07d也istheweal【est．Aparallelexperimentwasconductedingrowmroomoncottonseedlinggrowninbottomlessp印erpotsandinfbctionwaSdeVelopedbyinoculatingsporessuspension．TheresultshaVeasi鲥ficaIltpositiVecorrel撕onwimcottonplantsinoculatedwim圪r矗cf胁“m如础口einear山enpotsinthenethouse．T11econ．elationcoemcientisO．933，butresistaJlce伊adedidnotexactlymatch．’rhrou曲these觚oexp耐mens，co№nshowedSensibilitytoV08sn-1；buttoAnyang，itrespectiVelyshowedSensibilityandTolemce；besides，itreSpectiVelyshowedToleranceaIldResistaIltancetoV07df2．2．7rocheckthebioactiVit)roftoxin，cottonseedswere仃eatedwimtoxinaftereme玛enceofradical．Alltypesoftoxinsinhibitedcottonradicleelongation．LeafpaintingwithtoxinproducednecroticsyIllptoms；howeVer，thedegreeofchlorosisaJldnecrosiswausdiff打entfordi髓rent如nguss仃．ains．111experimentcottonrootsweresoakedintoxillstoseemeefrectofdi岱玎ent1(indoftoXisoncottonseedlinggrowtll．ResultsreVealedthatalltheseⅡlreetoxinsareVirulenttocottonseedlingsandmeirvimlencewassi印ificantlydi虢rent丘．omeachomer．MoreoVer’si鲥ficalltpositiVecorrelationwasobseⅣedbe俩eentoxin仃eatedaIldpanlogeninoculatedexperiIllents．T11e 万方数据浙江大学硕士学位论文Abstractcorrelationcoe伍cientb娟Veencottonplantsinpotsand1eafpaintingorrootssoakedintoxinsareO．847and0．856．Besides，disease铲adeproduce4byusingtoxinsmatchedexacUywithcottonplantsinoculatedwith娩r疗cf胁“聊幽^Zf口e．Itdemonstratedt11atuseoftoxinforscreeningofcottonagainst殆，．疗cf刀i“，咒wiltisf．easibleandaccurate．3．Similally，cottoncalluswasalsoscreenedagainstdi鼢cnttypesoftoxinsd耐Ved仔omdi伺衙enttypesof殆所cf砌，，z如矗加P．IIlpresentstudy，cottoncalluswasgrownonmemediumcontailling纶ⅣfcfZ觑m幽Jlz，砌Ptoxins．Presenceoftoxinssigmficantlyreducedthe丘eshweightofmecallusmaIlcon仃olcallus．MoreoV％tlleactiVityofPODa11dMDAcontentswereincreasedintoxilltr．eatedcallus．Thecollrelationcoemcientsbetweencottonplantsinpotsandwei曲tgainforcallus，MDA，PODwere-0．822，0．913，O．963．Fu】曲enIlore，cottoncallus舶mdifR：renttypesofcotton孕．ownonmemediuIncontamingmes锄e跆，．ffcf，觑聊如^厅口Ptoxinsalsoshowedsigni矗cantdi妇衙encesinweightgain，MDAcontents，andPODactiⅥty．Iti11us缸．atesmatmetoxillsidentificationbasedontissuecultllretechn0109yisfeasible．1’hisstlldyd锄ons仃atedtllatusingtoxinsisolated自om殆，．ffcfZ胁聊如Jlz以口PinsteadofusillgdirectpachogenforscreeIlingpu印oseagainst跆rffcfZZf“mwiltismorefeasibleallde11Vironmentallycontrolled．1'11ismethodproVidestechnicalsupportinacceleratingcottonbreedillgfor殆rffcf，，f“mwiltresistance．SimilarlyscreeIlingofcallusagainst殆，．打cf胁“聊wiltbyusingtoxillproⅥdedneWideasforscreeIlingofresist觚tcalliinsteadofusiIlgVeryexpensiVeaIltibioticsthusmakingmismemodmorepreciseandcosteff．ectiVe．Keywords：Cotton，玩，ffcf胁“聊如矗加e，Tbxin，Tissuecultl】re，DiseaseresistaIlce．V 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述1文献综述1．1棉花黄萎病的研究概况1．1．1棉花黄萎病的危害棉花在植物学分类上属于被子植物门、双子叶植物纲、锦葵目、锦葵科、棉属植物，原产地是印度和阿拉伯等亚热带地区。目前，世界上棉花生产量较高的国家主要有中国、美国、印度、巴西、墨西哥、埃及、巴基斯坦、乌兹别克斯坦等。棉花作为世界上最重要的经济作物之一，它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，是关系国计民生的重要战略物资。棉花与人民的生活息息相关，对国民经济的健康稳定发展也有着重要影响。棉花的稳产高产是由多项综合条件构成的，而减产往往是由单一因素构成的。土壤、水肥条件及良种是棉花生产的基础条件，这些条件是容易满足的，病虫害、水灾虽然不是每年都发生，但这些灾害是不易控制的，其中，棉花黄萎病不仅是我国，也是世界各植棉国棉花生产的重要障碍(马存，2007)。棉花黄萎病俗称“金边黄”(熊又升等，2010)，是一种国际检疫性病害，对棉花危害极大，病重年份，甚至导致绝收。棉花黄萎病自1914年首次在美国弗吉尼亚州被C唧enter发现以来，至今己传播至亚洲、非洲、美洲中的多个植棉国家和地区，全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元(马春红等，2007)。我国棉花黄萎病自1935年由引进美国棉花品种斯字棉4B而传入，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南安阳等地发生危害(周庭辉等，2006)。此后，由于棉籽调运、串换频繁，加之耕作改制、种子处理和防治不利等原因，自20世纪70年代以来在我国逐渐发展和蔓延。至80年代末，黄萎病己遍及478个植棉市(县)，1993、1995、1996年棉花黄萎病暴发成灾，几乎遍及了我国各个主要产棉区(王莉等，2011)，2002、2003年在黄河流域和新疆棉区再次爆发(周庭辉等，2006)，严重影响了我国的棉花生产。棉花黄萎病具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久等特点，且生产上一直未找到理想的控制方法和防治技术，被称为“棉花癌症”。目前，它己成为制约我国棉花生产实现高产、稳产、优质的最主要障碍之一(李亚栋等，2011)，因此，加大棉花育种工作的投入，加快高抗棉花黄萎病品种的获得，成了日前广大科研工作者的主要任务之一。 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述1．1．2棉花黄萎病菌种的形态与分类棉花黄萎病菌初生菌丝体无色，后变橄榄色，有分隔，直径2．O．4．O岬。菌丝体常呈膨胀状，可由单根菌丝或数根菌丝芽殖形成微菌核。不同地区棉花黄萎病菌微菌核形成的数量、大小和性状有明显的差异。例如，在梅干培养基上，泾阳、栾城菌株产生的微菌核较多，且较大：四川南部和新疆和田菌株产生的微菌核较少、也较小；陕西菌株产生的微菌核多为长条形，且并列成串(王克荣等，1982)。棉花黄萎病菌分生孢子呈长卵圆形，单胞无色、极少分隔，大小为2．3．9．1岬×1．5．3．0岬。分生孢子梗直立、呈轮状分枝，每轮有3．4分枝，全长110．130岬，分枝大小13．8．21．4岬×2．3．2．7岬，梗基部无色透明，轮枝顶端或顶枝着生分生孢子(刘学堂等，1998)。近年来，越来越多的学者习惯依黄萎病菌的形态特征，将其分为菌核型、菌丝型和中间型。菌核型表现为菌落黑色，产生大量黑色微菌核，菌落中间常为白色气生菌丝团。菌丝型表现为菌落白色或浅黄色，气生菌丝发达呈绒毛状，培养两周后仍未出现黑色微菌核。中间型表现为菌落边缘光滑，微菌核产生少。棉花黄萎病菌在分类地位上属于半知菌亚门(DP甜纪m，，zycD砌口)、淡色孢科(M础加ce口e)、轮枝菌属(您州cf胁“聊)。在种的分类中，国际上曾长期存在争议。美国常用种名为殆所cf胁“m口Z6D一口肌f聊(黑白轮枝菌)，前苏联认为是殆rffcf，Zf“m如Jlz，f口P(大丽轮枝菌)。Sminl(1965)的形态学以及Schnamorst(1973)血清学反应关系认定黑白轮枝菌和大丽轮枝菌分属两个种，这一观点目前己为世界大多数学者所接受(刘学堂等，1998)。然而，在我国，1979年河北省植保土肥所、北京农业大学、中国农科院植保所对我国棉花病区的辽宁、河南、河北、陕西、四川、云南、新疆、江苏8省区9个菌系的280个单孢菌系经鉴定全是大丽轮枝菌。1980．1981年中国农科院植保所、山东农学院、安徽农学院、西南农学院对四川、湖南、湖北、安徽、江苏、山东、上海等7省市30多个菌株的单孢系继续鉴定。结果表明，供试菌系均属于大丽轮枝菌。一些茵系致病力不同是属于生理生化上的分化，而并非另属一种。虽然大量研究已表明，我国棉花黄萎病菌主要是大丽轮枝菌，但我国棉区幅员广大，气候条件复杂，寄主植物繁多，也还不能完全排除黑白轮枝菌存在的可能性。棉花黄萎病菌变异性较大，常因环境条件的影响而产生新的生理类型。Presley将来自15个国家的96个菌系划分成16个营养体亲和群，并发现亲和性和致病性有着明显相关性，即落叶型菌系属于同一亲和群，而致病性较弱的非落叶型菌系则属于另一亲和群。姚耀文(1982)报道1977．1978年全国棉花黄萎病菌生理型联合试验组，用8省区的10 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述个棉花黄萎病菌系对9个鉴别寄主进行致病力测定，认为可将其分为三个生理类型。生理型I：致病力强，以陕西泾阳菌系为代表，在9个鉴别寄主上均表现感病。生理型II：致病力弱，以新疆和田、车排子菌系为代表。生理型III：致病力中等，以河南安阳菌系为代表。这三个生理类型是目前我国普遍认可的黄萎病菌致病力分化类型。1．1．3棉花黄萎病菌的病征及其致病机理自然条件下棉花幼苗发病少或很少出现症状，一般在生长中后期大量发病。由于病原菌的致病力差异、棉花不同品种的抗感特性、棉花的生育期以及环境条件的影响，棉花黄萎病的症状也不完全相同。常见的是病株下部叶片上的叶缘和叶脉间出现浅黄色斑块，后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂，后期病株基部生出细小新枝。纵剖病茎，木质部上产生浅褐色变色条纹。广大学者在多年棉花黄萎病抗病育种工作中观察到，相同品种在同一棉田生长过程中，其棉花黄萎病的症状类型、发病率、病害严重度等方面常存在较大差异。这种差异是由于棉花植株个体间的抗病性差异，还是由于土壤中棉花黄萎病菌的致病力变异引起，亦或是两者互作的结果，是一个值得研究的理论问题和现实生产问题。关于棉花黄萎病菌的致病机理，学术界主要存在“堵塞说”和“毒素说”两种。“堵塞说”认为黄萎病菌侵入寄主植物后，在寄主体内分泌各种蛋白，如细胞壁降解酶、蛋白酶、毒素等，导致寄主维管束堵塞和细胞坏死，引起植物叶片变色和植株失水萎蔫。细胞壁降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展。大量的研究表明，黄萎病菌产生的细胞壁降解酶活性与其致病力呈正相关(Carder等，1987)。蛋白酶能降解寄主的防卫相关蛋白，或利用寄主的细胞壁蛋白作为营养物质。“毒素说’’认为毒素是导致植株发病萎蔫的主要原因。大丽轮枝菌分泌的轮枝菌素是导致黄萎病的关键因子。陈旭升(1998)用落叶型菌系VD8的外泌毒素处理棉苗，致萎棉苗的电镜切片观察发现，黄萎病菌毒素本身可以诱发棉苗维管束系统的堵塞。对棉苗茎部维管束所做的电镜观察发现，茎部许多导管的管壁急剧增厚，导管孔变得异常狭小。该研究结果表明，导管堵塞很可能只是棉苗对毒素产生的一种诱导防卫反应。因为导管木质素合成的加速，胶质侵填体的形成是植物诱导防卫反应最明显的体现。但棉苗过度肪卫反应的结果，却使维管束系统变得异常狭窄乃至堵塞萎蔫。因此，可以说，堵塞大概只是毒素诱导防卫反应的一种表现形式 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述而已。目前的研究结果表明，毒素致萎活性的主要成分为糖蛋白，但其确切的成分尚不清热．就毒蛋白组分而言，不同学者分离出不同分子量大小的、具有致萎活性的毒蛋白。Palmer等分离了1个18．5kDa、具有致萎作用的蛋白，并进一步利用质谱对该蛋白进行了测序，但该蛋白同己报道的蛋白质序列没有序列相似性，是一类功能未知的蛋白质。甘莉等(1995)的研究表明，棉花大丽轮枝菌致病力的强弱还与分泌的致病毒素的含量及其糖基化程度有关，强致病力菌系分泌糖蛋白含量高于弱致病力菌系。在大丽轮枝菌毒素研究中，不同学者所分离的致萎毒素结果各异，这可能与研究者所用菌株和分离纯化的方法不同有关，同时也说明大丽轮枝菌致病机制的复杂性(汪敏等，2011)。1．1．4棉花黄萎病菌的传播途径及其防治方法棉花黄萎病菌主要以菌丝和分生孢子的形态存在于棉株体内。棉花病株各部位的组织均可带菌，病叶作为病残体存在于土壤中是该病传播的重要菌源。棉籽带菌率很低，中科院微生物所种子实验表明，棉花种子带菌率为1．3％．6．7％。种子带菌主要分布在外部短绒上，种子内部带菌率极低，种胚一般不带菌。然而，棉籽却是病菌远距离传播的重要途径。棉花黄萎病为土传病害，病菌在土壤中直接侵染根系，穿过皮层细胞进入导管并在其中繁殖，产生的分生孢子及菌丝体堵塞导管，引起棉株发病。流水和农业操作也会造成病害蔓延。此外，棉花黄萎病菌的寄主范围很广，并且还在逐年扩大。目前己达660余种，其中以茄科、蔷薇科、菊科植物最多，其次是锦葵科、豆科和槭树科植物(王莉等，2011)。黄萎病菌侵染双子叶植物的能力很强。番茄、马铃薯、黄瓜、棉花、烟草、辣椒和茄子等都对其敏感，而一般禾本科作物如水稻、玉米和高粱等不受侵染。黄萎病菌单茵系具有寄主特异性，来源于不同寄主植物的菌系之间致病力有很大的差异，表现的症状亦不同(赵风轩等，2009)。钱清海等(1987)从65种植物分离到的大丽轮枝菌菌株接种棉花后，均能使之感染黄萎病，可见黄萎病菌能在不同的寄主植物间可以交互感染。因此，在病区加强田间杂草的清除，实行与禾本科作物轮作倒茬(李经仪等，1985)，以减少寄主植物的方法减少土壤中病菌的积累，从而有效抑制病害的发展。棉花黄萎病菌这种分布广、危害重、易变异、寄主范围宽、传播途径多、植物体外存活时间长的特点，给棉花黄萎病的防治造成了一定的困难(刘妲，2011)。目前防治棉花黄萎病的4 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述主要方法是利用农业措施防治、化学防治、生物防治和培育抗病品种等。利用农业措施防治棉花黄萎病是最基本的防治方法。加强检疫工作、轮作倒茬、加强田间管理等都能一定程度地减轻棉花黄萎病的发生。利用化学药剂进行棉花黄萎病防治是最快速、有效的防治方法。播前进行药剂拌种，苗期和蕾铃期多种药剂混合使用和不同药剂与壮苗剂混合使用，不但可较好地防治棉花黄萎病，还能提高黄萎病的抗病性。利用微生物防治棉花黄萎病是最生态、最具有前景的防治方法。随着绿色农业、有机农业的兴起，采用生物防治方法防治棉花黄萎病备受人们关注。Tehrani(2001)、李社增(2005)、齐东梅(2005)、邹俊(2005)等分别分离得到假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌NCD．2、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，并证明其对棉花黄萎病有有拮抗作用。马平(2001)等在棉铃中分离到的非致病镰刀菌VL．1、VL．2，在棉田发病高峰时对黄萎病有明显防治效果。宋晓研(2005)等筛选到对棉花黄萎病有很强拮抗作用的木霉菌株SMF。此外，利用无毒菌系或用弱毒株系和促生菌诱导棉花产生抗病性或进行交叉保护，也是生物防治中的一项重要内容。培育抗病品种是预防黄萎病最经济、有效的防治方法。辽棉l号是我国自育的第一个抗黄萎病品种，为全国棉花抗病育种提供了抗源。我国先后选育的抗病品种有：中棉所12、中棉所19等，但选育出的抗病品种都不理想，病指都比较高，还需高抗黄萎病新材料的发现(刘妲等，2011)。马存(1999)等研究鉴定表明，海岛棉抗黄萎病能力最强，亚洲棉抗黄萎性能最差，陆地棉抗黄萎性能界于两者之间。海岛棉抗黄萎病性能虽好，却不能直接利用。在陆地棉栽培品种中对黄萎病具有高抗的材料很少，现有的抗病品种在其抗性的稳定性、遗传力等方面均需进一步验证，而且由于黄萎病菌生理小种不断变化，从而出现许多新的致病类型，早期鉴定的抗性种质材料，随时间的推移抗性可能丧失；高抗黄萎病资源缺乏，限制了抗黄萎病育种进展。目前国内外还没有高抗黄萎病的棉花品种，即便有高度抗病的品种，经多年种植后，又会导致病菌产生侵染力更强的群落，使已有的棉花品种染病，因此抗病育种工作需不断进行。单一棉花黄萎病防治方法的防病效果都不理想，我国棉花黄萎病防治坚持“预防为主，综合防治”的植保原则。1．1．5棉花与黄萎病菌的互作大量研究结果证实寄主与病原菌间存在明显的互作，在寄主一病原菌系统中寄主植物的抗病性与病原物的致病力协同进化。因此，深入探讨寄主一病原物的互作格局，无论是对抗病理 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述论研究还是抗病育种实践都有极其重要的意义(吴元奇等，2009)。棉花与黄萎病菌间的互作关系复杂，多数学者认为棉花的生理生化抗性在抗病中起主导作用，但离不开多种抗性机制的协调作用。首先，棉花具有一定的组织结构抗性，包括固有的结构抗性和诱导的结构抗性，形成了一套抵抗黄萎病菌的物理障碍。组织结构的诱导抗性是指植物受到病原菌侵染后经过一系列的分子调控机制，诱发植株体内的一系列代谢变化，在细胞水平上出现形态结构的改变。如细胞壁的木质化和其他一些物质的沉积导致薄壁组织增生，胼胝体、侵填体、周皮以及乳突等结构的形成等以抵抗外来病原菌的入侵和扩展等，最终使植物获得抗性。组织结构的固有抗性主要体现在不同棉种维管束结构的差异上(徐理等，2012)。通常物理障碍的形成在耐病品种上要比感病品种普遍得多，这些物理障碍主要影响萎蔫形成的普遍率和程度(李亚栋等，2011)，是棉花抵抗黄萎病菌侵害的第一道屏障。其次，棉花形成了一套高效、快速的生理生化抗性机制。当植物受到病原菌侵染时，相关组织能够积累植物抗毒素，如棉酚、植保素、单宁等，这是植物抗病防卫反应的一个重要方面。棉酚作为一种重要的植物抗毒素在棉花抗病和抗虫过程中起着重要作用。棉花类萜物类物质可能通过抑制黄萎病菌的生长来限制黄萎病菌进入木质部，减轻病害的发生。虽然从基因诱导表达及生理活性分析等方面证实棉酚等次生代谢物参与了棉花对黄萎病的抗性反应，但该代谢路径在棉花抗黄萎病基因网络中的位置、功能以及如何将其应用于棉花抗病育种仍有大量工作需要开展(徐理等，2012)。有多位学者研究发现，棉花黄萎病抗性与体内一些多糖、激素、氨基酸及根部分泌物有关。品种抗性不仅取决于作用的有无，还取决于作用速度的快慢和量的多少。抗性与品种产生抗性机制的速度呈正比(李亚栋等，2011)。1．1．6棉花抗黄萎病育种研究的进展我国自20世纪50年代开始培育棉花抗黄萎病品种，数十年来，通过传统的育种方法取得了一些进展。如中86—6、豫棉19及豫棉21等品种的成功选育和推广，在一定程度上减轻了黄萎病的为害，提高了棉花产量和品质，进而稳定了棉花生产(李亚栋等，2011)。然而由于黄萎病在不同年份、不同气候条件下、不同地区发生程度差别大，病菌的变异也较快，所以棉花品种对其抗病性表现不稳定。从棉花抗黄萎病性的遗传基础看，要培育出高抗水平的品种似乎不太可能。虽然国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面做了大量工作，但由于这些防治措施的种种弊病和不足，收效不尽人意。今后，应将培育抗病品种与农业调控棉株抗病性并6 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述重，使棉花群体抗病性更上一个台阶，达到抗或高抗的水平，将该病所造成的损失减小到最低十分必要(马宗斌等，2012)。寄主与病原菌间关系的复杂性、病原菌生理分化的多样性以及环境因素的多变性，加之高抗种质资源的缺乏、抗病遗传机制的研究不够深入，致使棉花抗黄萎病育种进展缓慢(马宗斌等，2012)。目前棉花生产中推广的抗虫、抗病、高产品种，大多为“抗枯、耐黄”品种，主要原因是高抗黄萎病的抗源缺乏，导致抗病育种进展缓慢。我国的棉花品种资源约为8000份，其中高抗黄萎病的资源均属于野生棉和海岛棉，不能直接利用(李亚栋等，2011)。而且由于病菌生理小种的不断变化，出现了许多新的致病类型，一些抗性的种质材料也可能会随着时间的推移而丧失掉其抗性。另外，传统抗病育种工作周期较长、方法单一，也极大地限制了棉花抗黄萎病育种的效率，因此通过远缘杂交技术及通过转基因生物技术将这些资源中的抗黄萎病基因性状转移到陆地棉中，创造出抗性强的新物种、新材料，可从根本上解决陆地棉黄萎病抗源严重缺乏的问题。多年来，经过国内外学者的不断努力，已经发现了几个对棉花黄萎病有一定抗性的物质。例如，人工合成抗菌肽D4E1(R萄aSekaran等，2005；赵亦静等，2013)、BTD．S(NiMi等，2013)、D51(赵亦静等，2013)、葡萄糖氧化酶基因(M唧y等，1999、几丁质酶基因(Em枷等，2003；To}lidfk等，2005，2012)、天麻抗真菌蛋白(wang等，2004)、苜蓿抗茵肽基因(张海平等，2010，2009)等，研究表明，通过转基因技术将其导入棉花、烟草等植物中，能有效地提高植株的抗病性，这对培育棉花黄萎病抗性品种的研究具有重大意义。因此，随着对黄萎病遗传规律和抗性机理的进一步揭示，充分利用现代生物技术，将分子育种与常规育种手段相结合，采用符合棉花黄萎病遗传特点的育种方案，不断创新研究手段和技术方法，必将加快棉花抗病育种的进程，培育出高抗品种(李亚栋等，2011)。1．2棉花黄萎病菌毒素的研究概况1．2．1真菌毒素的概念毒素是植物病原真菌和细菌在代谢过程中产生的，能在很低的浓度范围内干扰植物正常生理功能的非酶类化合物。植物病原真菌毒素是一种对人、畜有害和能够加重植物病害发生的真菌次生代谢产物。在植物病理学中，真菌毒素是由病原真菌侵染感病植物后产生的有毒化学物质，这种物质只存在于感病植株中，用其接种健康植株时，能重现部分症状。这些真菌次生代谢产物大多属于低分子量化合物，主要包括环状肽类、低聚糖、类萜烯化合物、聚乙醇酰和生 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述物碱类等，而不包括酶类和生长调节剂。这些物质在低浓度下具有很强的生理活性(包括毒性和致病活性)。真菌毒素是由病原真菌产生的动植物本身不能进行生物合成的有毒化学物质，与真菌毒性物质(由病原真菌和植物都能产生的抑制植物生长发育的有害化学物质)不同(马存，2007)。病原菌的这种对植物有害的代谢产物，不仅可以在植物体内产生，也可以在人工培养条件下产生。无论用在何种条件下产生的毒素处理健康植物，都能够使寄主植物产生与病原菌侵染相同或相似的症状。植物病原真菌毒素在植物病害发生、发展过程中有明显的致病作用。1．2．2黄萎病菌毒素的成分及其物理特性毒素多属于低分子量次生代谢产物，主要包括环肽类、类帖烯类化合物、低聚糖、聚乙醇酰和生物碱等，这些化合物在各自的致病过程中起着重要的作用。自从Keell等首次报道棉花黄萎病菌毒素是一种蛋白脂多糖复合物以来，国内外学者对毒素的分离纯化、活性组分、作用机制、抗病品种选育方面等进行了较多研究(沙月霞等，2005)。1922年Bewley提出了黄萎病菌培养滤液存在外源致萎物质。黄萎病菌在培养基上能产生低分子量和高分子量植物毒素代谢物，这种毒素能诱发类似黄萎病菌的致病。S仃oddan从病菌培养滤液中分离到一种具有微纤维酶活性的蛋白质成分和一种果糖胶，这两种成分对离体苜蓿叶片都具有致萎作用。我国仇元、吕金殿1962．1965年指出棉花黄萎病的培养滤液中含有毒素物质，明确了培养滤液的生物学特征和在棉花品种抗性鉴定上的应用前景。章元寿等(1989)测定大丽轮枝菌不同致病力类型的5个菌株毒素的成分，实验结果表明各菌株的毒素都含有蛋白质、多糖和脂类物质，并发现致病力强的菌株毒素所含的蛋白质和多糖的量高于致病力弱的菌株毒素，而脂类物质的量却低于弱菌株毒素：经蛋白酶处理后的各菌株毒素则不能使棉花致萎，因此毒素中的蛋白质组分在毒素对棉花的致萎作用中占有重要地位。目前，国内外学者比较一致的认为，棉花黄萎病菌毒素的主要有效成分是一种蛋白质。一般的蛋白质是不耐高温的，而棉花黄萎病菌毒素表现出一些普通蛋白质不具有的特殊属性。陈旭升等(1998、2002)将3个黄萎病菌系的粗滤液用100℃水浴煮沸1h，结果发现，热煮处理后的毒素与未做热处理的毒素致萎峰一样，说明黄萎病菌外泌致萎毒素具有热稳定性。然而，也有学者研究发现，不同致病力菌系毒素经高温处理后受到破坏，不能使棉苗萎蔫；未经热处理的毒素能使棉苗萎蔫。此外，除陈旭升等的研究以外，目前国内外分离纯化得到的毒素分子其分子量皆在10000Da以上，尚未发现分子量小于10000Da的高活性致萎毒素组分，这可能8 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述与他们在分离纯化过程中采用的处理步骤有关。由于黄萎病菌毒素中含有分子量小于10000Da的活性致萎组分，因此不宜采用分子量在10000Da以上的超滤膜超滤浓缩毒素粗滤液。1．2．3黄萎病菌毒素的产毒条件及其提取方法不同的培养条件下，黄萎病菌的产毒量不同。选择最适的产毒条件对研究黄萎病菌毒素至关重要。吴蔼民等(1999)以南京菌株BP2为供试菌株，从动态学角度探讨不同pH值、光照、振荡时间、温度等培养条件对其产毒量的影响，以期明确黄萎病菌的最适产毒条件。研究结果表明，培养液pH值为6．8时，菌株产毒量较高，其中，pH值为7时毒素产量最高，这与章元寿等(1988)的报道结果基本一致。而陈旭升等(1998)认为pH值为4．8．5．0时，最适宜黄萎病病菌发挥正常的产毒功能；每天照光24h与照光12h条件下病原菌产毒量相当，均较黑暗条件略高；振荡条件下，菌株毒素产量高于同期静止培养条件下的毒素产量，且振荡时间越长毒素产量越高；温度为26．28℃时，菌株的产毒量最高，此温度也较适宜黄萎病菌的生长。吴蔼民等(1999)还比较了不同致病力菌株的产毒量差异，发现强致病力菌株的产毒量较弱致病力菌株高，这是否与病原菌的生理型有关，还有待进一步研究。关于黄萎病菌产毒条件的最适培养时间，不同的学者的研究结果不尽相同。李凤等(2012)等认为振荡培养8天以上即可，而李颖章(2000)、赵明敏(2006)、侯丽娟(2010)等建议振荡培养14天，李雪玲(2003)、李凤祥(2009)、桑茜(2010)、肖松华(2007)等培养15天，张慧霞(2008)等培养21天。造成不同学者菌株培养时间不同的原因，可能是其使用的菌株存在活性、致病力等方面的差异，但目前较普遍认同的最适培养时间为15天。棉花黄萎病菌毒素的提取方法，依毒素纯度、浓度等要求不同而有差异。常用的毒素提取方法有活性炭法、有机溶剂法、硫酸铵分级沉淀法、硫酸铵．丙酮协同沉淀法等。齐俊生等(2006)先用中性滤纸将菌液过滤，低温冷冻干燥浓缩后，用柱层析进行纯化，即得黄萎病菌毒素滤液。张兴华(2008)、肖松华等(2007)将菌液经过300∞『mill离心20min后，取上清液经O．45岬微孔滤膜真空过滤，所得到的滤液为无菌的毒素滤液；然后取5mL滤液经pH=7．O磷酸缓冲液透析24h，经透析后的滤液即为最终的毒素滤液。陈旭升等(2002)用硫酸铵分级沉淀法提取毒素，而张慧霞等(2007)在陈旭升的基础上加以改进，用硫酸铵．丙酮协同沉淀法提取毒素。将培养好的菌液，用4层脱脂纱布过滤，滤液在8℃条件下经150009离心20min后，取上清液用0．22岬滤膜过滤，收集上清液备用：将研细的硫酸铵按20％的饱和度加入上述上清液中，同时加入等体积预冷的丙酮，10000r／min下离心30min，弃去沉淀(沉淀为初步 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述分离的杂蛋白)，取上清液加硫酸铵至90％饱和度，同时加入等体积丙酮，4℃保存过夜后10000r／min下离心30min，弃去上清液，沉淀用5mm01／L的磷酸缓冲液(pH7．0)溶解即可。这种提取方法相对繁琐，比较耗时、耗力。马春红等(2007)利用黄萎病菌毒素的物理特性，将菌液水浴煮沸1h，浓缩并杀死其中杂茵后，经3000r／min离心20min，取上清液经0．45岬微孔滤膜真空过滤，所得滤液即为粗毒素液。目前，毒素滤液主要用于黄萎病菌的致病力测定、对植株组织生理生化的影响等方面的研究，对毒素纯度要求不高，故大多学者(李颖章等2000、侯丽娟等2010、桑茜等2010)多采用相对简单的离心一滤膜过滤法。将培养好的菌液用4层脱脂纱布过滤后，滤液在8℃条件下150009离心20min，取上清液经0．45岬滤膜过滤即得毒素粗滤液。值得指出的是不同学者使用的离心速度从30009．150009不尽相同，离心时间大多在20．30min。这可能是因为实验室条件不同或杂质含量不同所致，但从研究结果上看，都能对棉株组织产生一定的影响。1．3棉花抗黄萎病性的鉴定1．3．1棉花抗黄萎病鉴定的分类方法和病情分级标准棉花黄萎病抗性鉴定方法较多，因划分依据而异。依鉴定时期，分为苗期鉴定和成株期鉴定；依考察性状，分为棉株外部症状鉴定和剖杆鉴定；依鉴定场所，分为温室鉴定和大田鉴定；依接种物，分为黄萎病菌活体鉴定和病菌毒素鉴定；依接种菌组成，分为单菌系鉴定和混合菌系鉴定；依接种方法，分为针刺接种、蘸根接种及病床、病圃自然侵染鉴定等。在抗性鉴定中，病情分级标准及抗、感类型划分指标直接影响鉴定结果的准确性。在具体工作中，一般以棉株外部症状，尤其是叶片发病轻重及多少或以维管束病变程度确定病级，较多使用5级分级标准，也有采用10级分级标准。具体到苗期鉴定、成株期鉴定或某一鉴定方法，不同学者使用的病级标准及抗感指标不尽相同。但品种的群体抗性，在调查发病株率和严重度的基础上，同行广泛以病情指数进行评价。不同的鉴定方法及其相应的病级标准及抗、感指标，对相同材料的抗性评价结果有时不尽相同，甚至偶尔截然相反。目前尚缺乏一套试验条件控制严格、操作规范性好、鉴定灵敏度高、结果稳定性强、适应性广的良好鉴定方法(景忆莲等，2008)。10 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述1．3．2棉花抗黄萎病性的鉴定——病原菌活体鉴定1．3．2．1棉花抗黄萎病性的鉴定——成株期鉴定目前棉花抗黄萎病性鉴定的方法很多，大体可以分为棉花黄萎病菌活体鉴定和毒素鉴定。其中，病原菌活体鉴定是抗性鉴定中比较传统的方法，具有简单、经济、能较真实反映抗性强弱等优点，但鉴定周期一般较长，环境条件不易控制。棉花黄萎病菌活体鉴定又可分为成株期鉴定和苗期鉴定。成株期鉴定主要有自然病圃鉴定和人工病圃鉴定两种。自20世纪50年代，四川省简阳棉花试验站等单位开始在重病田进行抗黄萎病鉴定工作，至今自然病圃或人工病圃鉴定仍然是抗性鉴定的主要方法(马存等，2002)。自然病圃多选在棉区的自然病地上，要求病地本身发病均匀而重，菌系具有代表性，病圃能真实反映被鉴定材料抗性强弱。自然病圃鉴定是黄萎病抗性鉴定中最传统也是比较准确的方法，具有简单、经济、效果好等优点，但是鉴定周期比较长，需要有重病田块，适于棉花重点材料的成株期抗性鉴定。人工病圃是通过模拟自然病田发病环境，人工接种病原物诱导棉株发病形成的病圃。一般选用地势平坦、土质优良、肥力均匀、排灌方便的田块作为病圃。用棉籽、麦粒砂等培养基培养黄萎病菌，于棉花播种或移栽前接入病圃。病圃需补充菌量时，大多采用“病杆还田’’或“菌液浇根”等方法。人工病圃鉴定的优点是能人为控制病原菌的种类、接菌相对均匀、可适当控制病原菌菌量、较好地保证发病程度和发病均匀度、鉴定结果可靠性强，被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗病鉴定方法，在抗病育种过程中应用最为普遍。缺点是同自然病圃鉴定一样，易受外界气候条件的影响(如遇高温少雨的年份，发病便会很轻，影响鉴定结果)，具有较强的季节性，鉴定历时太长，贯穿棉花整个生育期，需要大量的人力、物力和空间，且发病程度往往高于自然病圃(史认辉，2010)。棉花对黄萎病的抗性机制很复杂，不同菌系之间的致病力及形态变异很大。同一品种在不同地区、不同土壤结构的黄萎病抗性鉴定结果可能截然不同，因此，在某地区大量推广某棉花品种前，多地点进行病圃鉴定十分必要。然而，利用自然病圃或人工病圃连续筛选培育抗病品种的方法在棉花抗黄萎病育种中效果并不理想。在一些地区选育出的抗病品种引种到其它地区时，却表现耐病甚至感病，究其原因主要是两个地区的棉花黄萎病菌属于不同的生理型，具有致病力的分化。这就又要求研究工作者克服土壤、气候条件等因素造成的影响，寻找新的鉴定方法。 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述1．3．2．2棉花抗黄萎病性的鉴定——苗期鉴定苗期鉴定具有快速，不受生长季节限制等优点，主要方法有无底纸钵蘸根法、纸钵撕底蘸根法(石磊岩等，1987)、有底塑钵定量注菌法(马峙英，1997)、无底塑钵菌液浇根法(简桂良等，2001)、六棱塑料钵定量注菌液法(王省芬，2002)、切根蘸菌法(马平，2004)、叶片针刺涂抹法(齐俊生等，2006)等。苗期鉴定一般在温室内进行，其优点是便于人为控制生态条件，鉴定周期短，并且节省人力、物力和空间。其中，应用最多是纸钵撕底蘸根法和无底塑钵菌液浇根法。早在20世纪70年代末期至80年代中期，中国农业科学院植物保护研究所、中国棉花研究所等单位为了寻找一种快速鉴定棉花黄萎病抗性的方法，多年致力于相关试验研究，认为纸钵撕底蘸根法是快速、准确、简便的温室苗期抗黄萎病性鉴定的方法(马存等，2002)。石磊岩等(1987)采用3种不同菌液浓度，对纸钵撕底蘸根法和无底纸钵蘸根法这两种方法的鉴定效果进行了比较。结果发现，无论哪种浓度，都显示出纸钵撕底蘸根法的病情指数比无底纸钵蘸根法的要重，与田间黄萎病圃对棉花抗感病鉴别的敏感程度相当。但该方法也存在着一些缺点，撕底伤根不均匀；每次需制作大量的纸钵，费工、费时，且纸钵易破；与田间试验相比，发病偏重等，因此，棉花黄萎病菌苗期鉴定方法仍需不断地探索与改进。90年代，简桂良等通过一系列的试验，对纸钵撕底蘸根法进行了改进，改为无底塑钵菌液浇根法，此方法比传统的纸钵撕底蘸根法更简便，发病较轻，能准确客观地反映品种的抗性。简桂良等(2001)采用无底塑钵菌液浇根法，通过对不同棉花品种、不同菌系、不同接菌浓度的鉴定结果与田间鉴定结果比较，表明这两种方法的相关性较好，其相关系数达O。808，达极显著相关。然而，伤根时所用力大小很难把握；再者，钵中通常要种几棵苗，各苗的根系发育情况也不尽相同，在钵底部的分布多少也有差异，这就照成了伤根程度的不同，因此容易出现同一钵中棉苗病指之间差异很大，会出现根系发育不好的棉苗的病指偏低的假抗性现象。自然病圃或人工病圃鉴定都需要有一个适宜发病的环境条件和发病过程，需要较长时间，且往往受到自然条件的影响，有可能使本来感病的试验材料不能充分表现其感病性；又需较大的人力、物力和空间(孙文姬等，1994)等。室内苗期鉴定与病圃鉴定相比，其优点是比较灵活、易搬动，可人为地控制发病条件，适合于种质资源材料和大批新品种(系)的抗黄萎病性筛选(张兴华等，2008)。然而，苗期鉴定方法也有一定的缺点，如伤根程度很难做到统一，不能反映各生育期抗性水平等，这是造成苗期鉴定与病圃鉴定结果存在差异的主要原因之一。张兴华等(2008)研究发现苗期鉴定与成株期鉴定结果的相关系数一般在0．7．0．9之间。由于不同棉花品种的耐病力和恢复力不同，有的品种前后期表现出的抗病性差异较大，造成苗期和 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述成株期抗病鉴定结果不一致，因此，苗期抗病鉴定具有一定的局限性，一般适合于棉花种质资源材料和大批棉花新品种(系)的抗病性检测筛选，对于重点材料仍应进行成株期鉴定。1．3．3棉花抗黄萎病性的鉴定——毒素鉴定抗病鉴定是棉花抗黄萎病新种质创造、抗病新品种选育过程中一个重要的技术环节。常规的抗病鉴定方法易受环境条件、接菌量、接菌均匀程度等发病因素的影响，导致鉴定结果不够稳定，不能准确反应棉种的真实抗性，容易将抗病材料淘汰。目前，我国棉花抗黄萎病育种进展缓慢的主要原因之一就是尚未建立一套真正简便、快速、高效的抗病鉴定方法。近年来，随着对棉花黄萎病菌毒素研究的不断深入，用毒素代替病原菌鉴定棉花抗黄萎病菌性，有着越来越广阔的前景。这不仅是因为它可以消除生物间相互干扰和污染的复杂情况，而且由于方法简便、精确、极易定量等特点，对在分子水平上探讨和深入研究寄主和病原物间的相互作用也有极大的便利。无论在理论上还是在应用上都展现出了极其重要的意义(张慧霞等，2008)。为了探索新的快速鉴定黄萎病抗性的方法，自80年代末，就有不少单位试图以毒素代替病原菌进行黄萎病抗性鉴定。但对于到底能否用毒素鉴定代替传统的病圃鉴定，至今未见明确的结论。然而，不少研究者相信，随着毒素鉴定技术体系的不断完善，终将取代病圃鉴定而成为棉花抗病鉴定的主导方法(肖松华等，2007)。黄萎病菌毒素鉴定大致可分为非基于组织培养技术的毒素鉴定和基于组织培养技术的毒素鉴定两种。对于前者的研究较多，并取得了一定的成果。章元寿等(1991)用棉花黄萎病菌JV200l毒素检测二叶期棉苗的致萎反应，经对1989．1990年120个棉花品种(系)的室内毒素检测，发现棉苗致萎度与田间病圃鉴定结果之间呈正相关，说明室内毒素鉴定能够反应棉花在田间病圃内的抗、感病程度。肖松华等(2007)利用病圃鉴定和毒素鉴定，分别对35个具有陆地棉遗传背景的野生棉种质渐渗系和抗、感病对照进行抗黄萎病性鉴定，毒素浸根试验结果表明，毒素浸根72h后，供试品种(系)对棉花黄萎病毒素伤害的抗性存在显著差异。根据苗期毒素鉴定的72h致萎度，能够准确预测供试品种(系)成株期在病圃鉴定中对黄萎病的抗性水平。殷剑美等(2007)、张兴华等(2008)的研究结果也证实了室内用毒素检测棉苗的致萎度能反映棉花成株期在田间病圃对于棉花黄萎病的抗性程度。张慧霞等(2008)采用毒素针刺叶片法证实了毒素鉴定的可行性。这种非基于组织培养技术的毒素鉴定方法可在室内人工控制条件下，大批量、快速鉴定出棉花的抗病性，是一种快速、经济、有效的筛选抗病材料的检测方法。 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述基于组织培养技术的毒素鉴定方法目前研究与应用的相对还较少。国内外学者对于这种方法的科学性还存在着争议。主要集中在毒素在细胞水平上和整个植株水平上对棉花的表达效应可能不一样。有报道说棉花品种在培养基上对黄萎病菌毒素表现为抗病，在大田植株上却表现为感病，但从大田棉株分离部分细胞在培养基上培养，再次表现为抗病。近年来，关于真菌毒素在培养基上对愈伤组织的抗性反应已有不少报道。真菌毒素属于化学物质，用毒素处理愈伤组织便于吸收传导，且可定量对愈伤组织施加选择压力而诱导其抗性。目前，利用毒素进行筛选抗病突变体己取得了可喜进展。国内外己从烟草、油菜、马铃薯、燕麦、水稻等作物中获得了抗病突变体。应用毒素对培养的组织或细胞进行抗性筛选始于70年代，Carson首先将烟草野火毒素用于筛选烟草抗火疫病愈伤组织并获得具有稳定抗性的再生植株。据统计现已有17种作物50余种病害的突变体问世，是各种微生物技术手段中获得抗性新材料或品系数最广泛的(孙桂英，2004)。我国在这方面的研究起步较晚，但进展较迅速。郭丽娟等自1981年开展了诱导抗玉米小斑病突变体的研究，以玉米小斑病菌产生的致病毒素为选择剂，在短期内诱导和筛选出抗玉米小斑病的突变体，并建立了一套简便可行的筛选和鉴定体系。郭丽娟(1991，1992)等利用细胞工程技术筛选出小麦抗根腐病和赤霉病的突变体，并在此基础上将己获得的突变株继续进行多年多点的抗病鉴定，结果表明，抗病突变株表现有较强的抗根腐病菌和赤霉病菌侵染的能力，突变株的抗病性不因代数增加而发生变化，从中己选出4个抗性强而稳定，农艺性状好的新种质投入利用。周嘉平(1990)、王荔(1999)等进行了烟草抗黑胫病突变体筛选，并成功建立了其抗性体系。刘正坪等(1998，2001，2003等)通过研究黄萎病菌毒素对茄子愈伤组织的毒害作用、细胞膜透性、抗病相关酶活性的影响等，以期探索一条准确、有效的筛选抗病突变体途径。刘正坪等认为用组织培养技术筛选抗病的抗源材料，首先要明确毒素是否对愈伤组织生长有影响、毒素筛选压力和筛选指标。然后在合适的筛选压力下用组织培养诱导抗毒素的细胞突变体、培养再生植株，对再生植株进行抗病性鉴定并连续选择以培育新的抗病品种。棉花抗病系的研究进展比较缓慢，有学者利用枯萎病菌毒素，从经诱变的珂字棉201愈伤组织中筛选出了一些耐毒细胞系，并对耐毒素细胞系进行了一些与抗病有关的生化分析。结果发现，毒素处理2d后，耐毒细胞系的还原性糖、可溶性总糖、可溶性蛋白质、单宁、棉酚及一些氨基酸的含量均比毒素处理前有明显增加，而对照细胞系则相反。毒素处理前后生化物质的变化，说明耐毒细胞系在受到毒素侵害时，会迅速产生一些化学保护性物质以增强其耐毒性。我国的姚明镜、李颖章、仇元、吕金殿等人在棉花黄萎病菌毒素及抗性突变体产生方面做了大14 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述量的研究。姚明镜等(1995)研究发现经黄萎病菌培养滤液处理后，抗感细胞系的过氧化物酶和多酚氧化酶活性、可溶性蛋白质及部分游离氨基酸含量的变化都有明显不同的趋势。李颖章。。’‘。?。一等(2000)用黄萎病菌毒素诱导棉花愈伤组织POD、SOD活性和PR蛋白的变化，研究发现，感病品种POD活性升高迅速，抗病品种POD活性的升高较之缓慢。SOD活性的变化主要发生在诱导前期，可见不同品种的棉花对黄萎病菌毒素的敏感性不同表现出不同的抗性。这些研究成果为毒素应用于抗病资源的快速筛选与鉴定、体细胞抗性突变体的筛选等提供了可靠的参考依据。组织培养技术已在筛选和创造棉花抗病资源材料中得到广泛应用，人们通过组织培养技术，预期培育出新的抗病品种。利用组织培养进行抗病育种，通常是在培养基中同时接上筛选材料和病原菌，然而这种传统方法至少存在两个问题：一是培养细胞很难均匀的暴露在病原菌中；二是病原菌在培养基中的生长速度比细胞本身生长的快、用合适的毒素代替病原菌接种能很好地克服这些困难。1．4黄萎病菌毒素在棉花抗病鉴定中的应用黄萎病菌毒素的研究不仅对揭示病害致病机理有重要意义，而且有着广泛的实际应用价值。黄萎病菌毒素在棉花抗病育种中应用广泛。首先可用毒素筛选抗性品种和突变体。利用毒素代替病原菌对待测材料进行作用，可以简单、快速、有效地筛选出抗性资源，为抗病育种奠定基础。赵明敏等(2006)利用茄子黄萎病菌毒素作为选择剂，结合组织培养技术，离体筛选茄子抗黄萎病突变体，开拓一条体细胞抗病育种的新途径。以毒素作为选择剂，用离体培养的愈伤组织进行筛选抗病突变体具有效率高的优点，且变异体的抗性水平能在愈伤组织水平上表现出来。病原菌毒素属于化学物质，用毒素处理愈伤组织便于吸收传导，且可定量对愈伤组织施加选择压力而诱导抗性。近年来，利用毒素进行筛选抗病突变体取得了可喜进展。国内外己从烟草(周嘉平等，1990)、油菜(吴力游等，1997a；1997b)、马铃薯(BehIll(e等，1980)、水稻(敖世恩等，2006)等作物中获得了抗病突变体。其次，相比于用病原菌孢子悬浮液或菌饼直接接种供试棉株鉴定其抗病性，利用毒素进行抗病性鉴定，更加快速、简便、有效。肖松华等(2007)研究发现，黄萎病菌分泌的毒素是引起棉株致萎的主要原因，毒素鉴定72h致萎度与病圃鉴定病指之间具有高度的正相关，说明以毒素鉴定代替病圃鉴定，进行棉花抗黄萎病性鉴定是可行的。李颖章等(2000)、沙月霞等(2005)、桑茜等(2010)也都有相似的报道。吕金殿、张献龙、仇元等也对棉花黄萎病菌毒 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述素做了较多研究，为毒素代替黄萎病菌用于黄萎病抗性鉴定提供了依据。夏正俊(1997)认为用毒素代替病原物，可以简化或克服许多致病因子变化而影响试验结果，且有助于人们更加深入地了解病原菌的特性。随着分子生物学和生化技术的不断发展，黄萎病菌致萎毒素的研究也将继续深入，从病原菌致萎毒素的视角了解棉花对黄萎病的抗感机理，将大大拓宽有关棉花黄萎病研究的思路，推动我国棉花抗黄萎病育种技术研究的进程。再次，用毒素代替抗生素，可用于转基因品种的筛选和鉴定。据调查，中国每年抗生素使用量是欧洲平均水平的两倍。过分依赖和滥用抗生素，必将给人类带来毁灭性的灾难，将抑制黄萎病菌(毒素)作用的基因倒入转基因载体中，用含有毒素的培养基筛选和鉴定转基因品种，会大大减少抗生素的使用量。此外，黄萎病菌毒素在植物病害防治上也有较好的应用前景。首先，毒素可以诱导棉株抗病性。吴洵耻等(1987)通过接种黄萎病菌弱菌株，以诱导优质高产但感病的棉株产生对强致病力菌株的抗性，使病情得到控制。其次，黄萎病菌毒素的研究，为开发新型、高效、安全、环保型黄萎病菌杀菌剂提供了理论依据。这种杀菌剂可以通过抑制病菌产生毒素或钝化毒素达到控制病害的目的，也可以使寄主细胞的毒素受体失活，减轻病害。目前，由于对棉花黄萎病菌的致病机理等了解的还不是很透彻，国内外还没有研制出可抑制毒素作用的杀菌剂，但这方面的前景是十分广阔的。再次，黄萎病菌毒素多为非寄主专化性毒素，不仅对寄主有毒害作用，对其它一些植物也有一定的毒性，可进一步研究开发为生物除草剂。利用毒素对寄主的专化性不同，还可辅助进行真菌分类，使防治更具有针对性。随着棉花黄萎病菌毒素研究的不断深入，有关毒素的应用前景也越来越广阔。1．5本研究的内容、目的和意义1．5．1本研究的主要内容本研究以毒素代替病原菌用于室内棉花抗黄萎病性的鉴定，避免了棉花黄萎病菌在大田的传播与蔓延。通过多种棉花抗黄萎病鉴定方法与温室盆钵接菌法比较。结果表明，毒素浸根法是一种简单、快速、高效、准确的鉴定方法；而基于组织培养技术的毒素鉴定方法具有很好的可行性，不但可以用于鉴定不同毒素对同一棉花品种的致病力差异，还可以准确区分同一毒素对不同棉花品种的致病力差异。毒素鉴定不仅有利于加快棉花抗黄萎病品种的育种进程，也为毒素代替昂贵的抗生素用于转化子的筛选提供了可能。16 万方数据浙江大学硕士学位论文文献综述1．5．2本研究的目的和意义棉花黄萎病不但是国内检疫性病害，更是国际检疫性病害。棉花黄萎病的发生会给棉农造成严重的经济损失。棉花黄萎病菌危害大、寄主广、易变异，目前还没有有效的防治方法。培育棉花抗黄萎病品种是最有效、经济的途径。然而，国内外黄萎病菌抗性材料缺乏，严重阻碍了棉花抗黄萎病品种的发展。即使有抗病材料，因其遗传不稳定，且黄萎病菌易变异，很可能本来抗病的品种，随着时间的推移，而表现为耐病或感病。对于同一品种，不同的地区、不同的鉴定方法等得出的抗病性结果也不尽一致。因此，探索一套试验条件控制严格、操作规范性好、鉴定灵敏度高、结果稳定性强、适应性广的良好鉴定方法在棉花抗黄萎病品种选育过程中起着至关重要的作用。本研究通过非基于组织培养技术的毒素鉴定和基于组织培养技术的毒素鉴定方法分别与温室盆钵接菌法的研究结果相比较，两者呈明显的正相关，表明了毒素鉴定的可行性。毒素鉴定与温室盆钵接菌法和无底纸钵蘸根法相比，节省了大量的人力、物力、财力，环境因子影响小，接种量准确、均匀，且节省了大量的空间资源，缩短了鉴定周期，是一种更加简单、快速、高效、准确的鉴定方法。基于组织培养技术的毒素鉴定方法，只需要极少量的种子即可获得大量的愈伤组织，这对于转基因材料或珍贵野生材料等抗病性的鉴定意义重大，也为某品种在当地推广前的抗黄萎病性鉴定提供了便。基于组织培养技术的毒素鉴定方法的可行性研究为毒素在组织培养中的应用提供了理论依据，也为毒素代替抗生素用于转基因材料的筛选和鉴定、棉花抗黄萎病突变体的筛选等研究提出了可靠的研究途径。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定2棉花黄萎病菌的鉴定2．1引言棉花黄萎病不但是国内检疫性病害，也是世界性检疫性病害。棉花黄萎病的发生甚至会对棉农造成毁灭性的损失。我国的棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(殆历cf胁“m幽JizZf口P)引起的真菌性维管束系统病害。棉花黄萎病菌地理分布十分广泛，自1935年从美国引进斯字棉以来，黄萎病菌就在我国各地区间蔓延，到目前为止，几乎覆盖各个棉区。棉花黄萎病菌的寄主范围很广，并且还在逐年扩大。不同寄主来源的棉花黄萎病菌可能引起交叉侵染。生态环境的不同和病菌本身的变异，常引起黄萎病菌产生生理分化，导致出现新的致病力类型。国内外研究表明，棉花黄萎病菌存在着不同的类型或生理小种。各地区的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化和提高。来自不同国家和地域的棉花黄萎病菌在陆地棉、海岛棉、亚洲棉等棉种上的致病力存在显著差异，但因品种不同而又有变化。我国将黄萎病菌系划分为菌丝型、菌核型、中间型3种培养类型。不同培养类型的菌株，致病力也有一定的差异。本文通过对黄萎黄萎病菌的培养性状的观察、分子检测，证实本研究中供试的3种菌株均为黄萎病菌。不同黄萎病菌的菌落颜色、质地、形态各不相同。2．2材料和方法2．2．1实验材料2．2．1．1供试菌种根据前人研究鉴定结果，挑选具有强(V08sn．1)、中(安阳菌)、弱(V07d也)致病力黄萎病菌菌株各一个(表2．1)。此外，以枯萎病菌Fuj作为PCR阴性对照。本研究中的供试菌株均来自实验室内保存菌种。18 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定2．2．1．2供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：称取2009新鲜马铃薯，洗净去皮，切成小块后，加水1000m1左右煮沸15．20min，纱布过滤，再加20．259葡萄糖和15-189琼脂，充分溶解后分装，高压蒸汽(121℃)灭菌25min，冷却至80℃左右倒平板。每平板30．40ml培养基。2．2．1．3实验仪器超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、电子天平、照相机、PCR仪、电泳仪等。2．2．2实验方法2．2．2．1不同黄萎病菌菌落形态的比较将斜面保存的菌株分别接入PDA平板培养7．10d，用直径为O．6cm的打孔器取菌落置于PDA平板中心，每皿1块，每菌株3皿，25℃培养15d后观察菌落颜色、质地、形态。2．2．2．2黄萎病菌的分子检测2．2．2．2．1真菌基因组DNA的提取(1)试剂：真菌核酸提取缓冲液：200r】m01嘶s．HClpH8．5，250mmolNaCl，25mmolEDTA，O．5％SDS：苯酚(啊s饱和酚)；氯仿：异丙醇；70％酒精等。(2)真菌DNA的提取，步骤如下：19 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定①用经高压灭菌的小药匙刮取培养7．10d的黄萎病菌菌丝，在液氮下研磨成粉，置于2m1离心管中。⑦向离心管中加入500pl真菌核酸提取缓冲液，摇匀后，置于65℃恒温水浴锅水浴30min。o将匀浆液与350“l苯酚混合后，加入150“1氯仿。130009离心30min。④取上清液，重复第三步。⑤取上清液，加入500肛l氯仿混合后，130009离心10111in。⑥取上清液，加入300Ul异丙醇，混合后，130009离心2miIl。⑦弃上清液，加入200p170％酒精，混合后，130009离心5min。@倒出酒精，室温干燥至彻底去除残余乙醇为止。⑨DNA沉淀溶于4mlTE缓冲液中，电泳法测定模板浓度，并适当稀释待用。2．2．2．2．2分子检测黄萎病菌PCR反应体系：新百诺PCR反应miX，12．5pm01引物(采用朱有勇等(1999)报道的引物zhul：CATCAGTCTCTCTGT．兀ATACCAACG和zhl晓：CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA)；O．01．0．05嵋基因组DNA模版，总体积20扯l。所有操作于冰浴条件下进行，直至95℃预变性。然后设置30次循环(变性95℃1min，退火51℃30s，延伸72℃30s)，最后72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，凝胶电泳成像仪观察并照相。2．3结果与分析2．3．1不同黄萎病菌菌落的形态特征菌丝图2．1V08sn．1菌落形态特征一菌核型(左：正面照右：背面照)Fig．2．1Theculturecharact甜sticsofV08sn-l—sclemtiumtype20同心纹微菌核 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定图2．2安阳菌菌落形态特征一中间型(左：正面照右：背面照)Fig．2．2Theculturecharacteristicsof口，纱口，lg。-middletype同心纹图213V07df2菌落形态特征一菌丝型(左：正面照右：背面照)Fig．2．3111eculturecharact甜sticsofV07df2⋯filamentous帅ev08sn．1菌落中间白色，周围均为黑色，菌丝致密，为绒毛状或棉絮状；菌落呈同心圆状或辐射状，产生大量黑色微菌核：属于菌核型菌株(图2．1)。安阳菌菌落表面光滑，有同心纹，培养2周后产生极少量微菌核；属于中间型菌株(图2．2)。V07d亿菌落表面呈白色或浅黄色，底部为淡黄色，质地较硬、气生菌丝发达；无同心纹，培养2周后仍未出现黑色微菌核；属于菌丝型菌株(图2．3)。本研究结果与倪密(2012)的研究结果一致。这三种黄萎病菌培养性状不同，三者的致病力也有较大的差异。杨凤祥(2009)等研究认为，一般来说，菌核型菌株致病力最强，菌丝型致病力最弱，中间型致病力中等。这与本研究结果一致。根据棉花黄萎病菌的培养类型初步判断病菌致病力对棉花抗黄萎病性鉴定提供了理论依据。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定2．3．2黄萎病菌的PCR检测结果黄萎病菌的PCR检测由来已久，目前已报道的引物已有很多。本研究采用朱有勇等(1999)报道的引物(zhul和zhu2)，3种黄萎病菌均能扩增出目的条带(324bp，图2．4)，枯萎病菌无扩增条带，研究结果证实该对引物的有效性，表明该研究中涉及的供试黄萎病菌均无变异，与倪密(2012)的研究结果是一致的。为了证明这对引物的专一性，还加上了枯萎病菌作为阴性对照。1234562．4讨论500bD250bD图2．4黄萎病菌的特异PCR检测Fig2．4ThePCRbasedidentificationofK出^“口P注：样品顺序依次为1．Marker：2．空白对照：3．V08Sn-1；4．安阳菌：5．V07df2；6．阴性对照(枯萎菌Fuj)。大丽轮枝菌是一种土传维管束寄生真菌，主要以菌丝和分生孢子的形态存在于棉株体内，引起棉株发病。此外，棉花黄萎病菌变异性较大，常因环境条件的影响而产生新的生理类型。近年来，越来越多的学者习惯依黄萎病菌的形态特征，将其分为菌核型、菌丝型和中间型三种类型。杨凤祥(2009)等研究认为，菌核型菌株致病力最强，菌丝型致病力最弱，中间型致病力中等。这种鉴定方法简单、高效，能根据黄萎病菌的形态特征初步推测出不同黄萎病菌的致病力差异。本研究收集了3种致病力不同的黄萎病菌菌株v08sn．1、安阳菌和v07df2，通过生理形态学和分子生物学技术对其进行了系统鉴定。PCR鉴定结果表明，本研究供试的3种病菌均黄萎病菌。3种黄萎病菌的形态学观察实验发现，3种病菌的生理类型不同，其中v08sn一1为菌核型，安阳菌为菌丝型，V07df2为菌丝型。此外，本研究还对黄萎 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花黄萎病菌的鉴定病菌的背面菌落进行了观察和拍照。多年来，黄萎病菌菌落观察的研究多停留在菌落的正面观察，而轻视甚至忽略了菌落的背面观察，菌落的背面观察研究可能给病菌分类及鉴定提供新，的思路，使病菌的分类更系统、更全面、更准确。黄萎病菌的鉴定手段多种多样，但各有优缺，在加上黄萎病菌变异性大，很难仅依靠一种鉴定方法即确定黄萎病的类型。另外，病原菌的表型特征与其遗传特点、分子信息之间也必然存在某种联系，在实验研究中，应综合各种鉴定方法，结合使用，以最终对棉黄萎病菌作出准确的鉴定。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法3棉花成株期抗黄蓑病性的鉴定——韫室盆钵接菌法3．1引言棉花黄萎病是我国危害最重的棉花病害，是我国棉花产量大幅提高的最主要瓶颈。在自然病田，棉花黄萎病一般在苗期不表现症状，现蕾期开始发病，花铃期发病最盛。根据气象条件的不同，棉花品种抗病性不同，会出现不同类型的发病症状。最常见的症状均从下部叶片向上发展，发病初期，病叶边缘和叶片之间的叶肉开始褪绿，局部出现不规则的黄色斑块，叶片较挺而不萎蔫。随着病势的进一步发展，黄斑颜色开始加深变褐色，斑块逐渐扩大，病叶边缘向上卷曲，主脉的叶肉仍保持绿色，叶肉变厚变脆，叶片呈掌状斑驳，似“西瓜皮”状。选育和种植抗病品种是控制黄萎病最经济有效的措施。然而，目前，棉花抗黄萎病育种工作进展缓慢，其中一个重要原因是传统的抗病鉴定技术周期长，且易受到季节、环境条件等的限制。因此，如何快速、有效地鉴定棉花抗黄萎病性成为棉花抗病育种中亟待解决的问题。棉花黄萎病是土传病害，用病圃鉴定可使品种的抗感性得到真实的表现。病圃分为自然病圃和人工病圃。其中人工病圃通过模拟自然病田发病环境设计而成。本实验在常规人工病圃的基础上，加以改进，将棉苗在温室盆钵内培养，不但有效地控制了环境条件的影响，还能严格控制接菌量，使土壤接菌量分布均匀，各处理病指较一致；在棉花成株期进行叶片发病情况调查和剖杆鉴定，使鉴定结果更准确、有效，且与常规人工病圃相比，节省财力、物力、人力。3．2材料与方法3．2。1实验材料3．2．1．1供试菌株供试菌株同上。3．2．1．2供试棉花品种陆地棉Z儿0584，该品种为本实验室培育品种，农艺性状良好，但不抗棉花黄萎病。24 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法3．2．1．3培养基大麦培养基：将大麦与纯净水以1：7的比例在高压锅中煮5h左右，至半开化状，以保证大麦中的营养物质充分暴露。然后将煮好的大麦分装在锥形瓶中，每瓶5009左右。高压蒸汽(121℃)灭菌25min。3．2．1．4实验仪器电子天平(1／10000)、超净工作台、高压灭菌锅、相机等。3．2．2实验方法3．2．2．1菌麦的制备将高压灭菌后的大麦培养基冷却后，接种黄萎病菌菌丝体于麦粒上。置于25℃条件下培养10．12d，待麦粒上长满白色的菌丝体时，即可用于接种鉴定。3．2．2．2菌土的制备将大麦培养基培养的黄萎病菌按菌土比2％的比例接入土壤中，分装于盆钵中待用。3．2．2．3棉花幼苗的培养将棉花种子用O．1％HgCl2消毒处理10min后，用无菌水漂洗3-5次，播种于装满无菌土的纸钵中。置于组织培养室内培养，室内温度保持28℃，湿度40％。每个一天浇一次水，待棉苗长至3．4片真叶时，移至温室。每盆钵中种一棵棉花，每个菌株10个重复，以不接种黄萎病菌的棉花做对照。将棉苗置于温室大棚中培养，室温30℃左右，每隔一天浇水一次。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法3．2．2．5病情调查观察经病菌侵染25d后的棉苗的发病情况，之后每隔7d观察一次，记录经病菌侵染50d后的棉苗叶片和茎杆的发病率、病情指数。病叶鉴定分级标准：O级：健株；1级：病叶占总叶片的25％以下；2级：病叶占总叶片的25％．50％；3级：病叶占总叶片的50％．75％；4级：病叶占总叶片的75％以上，病株矮小，结铃很少。剖杆鉴定分级标准：O级：茎杆维管束无变色；1级：茎杆维管束病变占剖面25％以下；2级：茎杆维管束病变占剖面的25％．50％；3级：茎杆维管束病变占剖面的50％．75％：4级：茎杆维管束病变占剖面的75％以上。根据调查结果计算棉花叶片和茎杆杆的发病率和病情指数，以两者鉴定所得病指的平均值为综合评价病指，作为评判各菌株致病力水平的依据。分级标准如下：综合评价病指0．01．10．00为高抗(HR)；10．01．20．oo为抗病(R)；20．01．35．oo为耐病(T)：>35．oo为感病(S)。发病率(％)=(发病棉株数／棉株总数)×100病情指数=[∑各棉株的病级数／(棉株总数×4)]×1003．3结果与分析3．3．1棉株的发病情况3．3．1．1棉株的发病症状病菌侵染棉苗50d后，棉叶发病显著(图3．1)，且不同病菌对棉株的致病力不同(图3．2)。对照棉株生长正常，叶片呈深绿色，极少棵棉株出现部分黄萎病病斑。而经三种不同黄萎病菌侵染过的棉株均发病。其中，V08sn．1菌株侵染过的棉株发病最重，棉叶呈明显的“西瓜皮”26 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法状，叶片边缘干枯萎蔫，向内卷曲，且病斑面积占叶片50％以上；整株植株除新长出的心叶外，均有病斑产生；下部叶片黄化、枯萎、脱落，植株矮化。V07df2侵染过的棉株发病相对较轻，棉叶没有出现严重的干枯萎蔫，叶片边缘稍稍向内卷曲，叶片肉质相对较厚；新叶一般不发病，下部叶片没有明显的枯黄、脱落；植株与对照相比，矮化不明显。安阳菌侵染过的棉株发病中等，整株植株上，发病重的叶片与V08sn．1侵染后的症状相似，叶片严重枯萎、卷曲，甚至脱落；发病轻的叶片病斑面积较小(多从叶缘开始)，叶缘稍向内卷曲；新叶一般不发病，下部叶片枯黄、萎蔫，但程度不及V08sn．1侵染过的植株重。图3．1不同病菌侵染后，棉花叶片(取倒四叶)的发病症状Fig3．1111enecroticsylnptomsofcottonleaves(fonhleaf舶mt叩)merin慨tedbyⅣ出M口P图3．2不同黄萎病菌侵染后，棉株发病症状Fig3．2111enecroticsyTnptomsofcottonplants狮erin‰tedbyⅣ如胁口e27 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法3．3．1．2棉株叶片的病情调查结果调查结果显示，3种病原菌侵染后的棉株发病率均为100％，对照发病率为10％。对照棉株存在一定的发病率，可能是因为在日常管理中，人员的走动、除草、浇水等活动时，将病株上的病菌带至对照棉株上，引起发病：温室盆钵接菌实验培养周期长，在此期间，风等外界因素的影响，也可能是引起对照病株发病的原因；此外，土壤未经严格灭菌，土壤内也可能含有少量致病菌，最终引起发病。为了进一步区分不同黄萎病菌间致病力的差异，本研究对棉株的病级进行调查，以计算出的病指作为抗性评价指标。其中，V08sn．1侵染后的棉株的病情指数最高，为65．oo；安阳菌侵染后的棉株病情指数中等，为40．oo；V07d也侵染后的棉株病情指数相对最低，为27．50；对照病指为7．50。通过SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，3种不同的黄萎病菌对棉花的致病力呈极显著差异(图3．4)。此鉴定结果证实了3种不同类型的黄萎病菌致病力差异显著。其中，菌核型致病力最强，菌丝型致病力最弱，中间型致病力中等，这与杨凤祥等(2009)的研究结果一致，但与宋晓研等(1993．1995)的研究结果有差异(宋晓研等认为，菌丝型菌株致病力最强)。这可能是因为宋晓研等用的菌丝型菌株为新发现的菌株。一方面，新菌种在当地属于强势菌株，另一方面，此菌株在实验室内培养次数相对较少，致病力等遗传条件还不稳定：但随着时间的延长，当地棉种对其产生抗性，其致病力可能下降，表现为弱致病力。而本研究中用到的茵丝型菌株已经过多代的实验室内培养、转接，致病力等遗传条件己较稳定。3．3．2棉花茎杆的发病情况3．3．2．1棉花茎杆的发病症状对棉株进行剖杆鉴定，结果发现，对照植株的维管束不变褐，维管束干净，呈白色或淡绿色，而病菌侵染过的棉株维管束都出现了不同程度的变褐(图3．3)。其中，V08sn．1侵染过的棉株维管束颜色最深，呈褐色或灰褐色：变褐面积达50％以上，茎杆变得干枯易断。安阳茵侵染过的棉株维管束变褐程度较V08sn．1轻，多呈灰褐色；茎杆没有出现明显的干枯现象，不易折断。v07df2侵染过的棉株维管束发病最轻，维管束颜色最浅，呈淡灰褐色；变褐面积较小，茎杆不易被折断。28 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法图3．33种病菌侵染后棉株茎杆的发炳症状Fig3．3111esymptomsofcottonsteIIlsmerin钕tedbyK如触乜P3．3．2．2棉株茎杆的病情调查结果3种黄萎病菌侵染棉株50天后，对棉株进行剖杆鉴定。结果显示，对照棉株病指为7．50。V08sn．1侵染后的棉株茎杆发病重，病指达57．50，安阳菌侵染过的棉株茎杆发病中等，病指为35．oo，V07df2侵染过的棉株茎杆发病最轻，为20．oo。通过SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，3种不同的黄萎病菌对棉花的致病力呈极显著差异(图3．4)。然而，这3种黄萎病菌对棉株茎杆的病情指数均小于对棉株叶片的病情指数。这可能是因为棉花叶片更易受到环境条件的影响，不能十分真实、准确的反应棉株发病情况。3．3．3棉株平均病指的调查结果前人多用棉花叶片病指和茎杆病指的平均值来表示黄萎病菌侵染后棉株的病情指数，以其作为棉花抗黄萎病性的综合评价指标。本研究综合棉株叶片和茎杆的发病情况，得出，V08sn．1侵染的棉株的平均病指仍旧最高，为61．25，棉株表现为感病(S)：安阳茵次之，为37．50，棉株表现为感病(S)；V07d亿侵染后的棉株平均病指最低，为23．75，棉株表现为耐病(T)。SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，3种不同的黄萎病菌对棉花的致病力呈极显著差异(图3．4)。以叶片和茎杆平均病指为评价指标估测棉花黄萎病菌的致病力，更为准确、可靠。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法3．4讨论冒孽百叶片病情指数茎杆病情指数平均病指l对照●V08sn一1i安阳菌■V07df23．43种黄萎病菌侵染后，棉株病情指数的比较Fig3．4ThevirulenceofthrccⅣ如胁口Poncotton注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同病菌处理下的棉株病情指数呈显著性差异病圃鉴定是最传统、真实、准确的棉花抗黄萎病鉴定方法，是新鉴定方法的参照，因此，病圃鉴定结果的准确性直接影响着新鉴定方法结果的真实性、准确性。然而，病圃鉴定也存在着一定的缺陷，鉴定周期长，占用大量的空间，整个鉴定期需要耗费大量的人力、物力、财力等；鉴定结果易受环境条件的影响，地域差异、气候差异等因素都能造成鉴定结果的差异，使鉴定结果不能准确地反应棉种的抗病性或黄萎病菌的致病力等。棉花黄萎病为检疫性病害，须在特定的区域种植，不得在非病区或轻病区种植。为提高病圃鉴定的准确性、简便性，本研究通过温室盆钵接菌法检测不同黄萎病菌对棉花的致病力差异。此鉴定方法一方面较好的控制了温度等环境条件，减少了环境因素造成的鉴定误差；另一方面温室盆钵接菌法更易控制接菌量，使结果更准确，同时避免了病圃的制作过程，节省了人力、物力、财力等。不同鉴定方法及其相应的病级标准和抗、感指标，致使相同材料的抗性评价结果不尽相同，甚至截然相反。侵染过程中试验条件的随机变异，单株抗性评价标准的不统一，直接影响抗性材料在育种过程中上的应用。然而，本研究以棉株叶片和茎杆的平均病指作为棉花抗黄萎病性评价标准，增加了鉴定结果的准确性，这与马存(2007)等的观点一致。研究结果表明，通过温室盆钵接菌法鉴定棉花抗黄萎病性，3种不同的黄萎病菌表现出的致病力间差异显著，且菌O0O7654321 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花成株期抗黄萎病性的鉴定一一温室盆钵接菌法核型菌株V08sn．1表现出强致病力，中间型菌株安阳菌表现出中等致病力，菌丝型菌株V07d也表现出弱致病力。这与杨凤祥等(2009)的研究结果一致。但是，温室盆钵接菌法依旧未能解决病圃鉴定占用空间大、周期长的难题。此外，这种接菌方法通过棉株日常管理等途径，常常将病株上的病原菌带到对照棉株上，导致部分对照棉株也感病，造成黄萎病致病力的评价误差。为了克服以上难题，同时加快棉花抗黄萎病品种的选育进程，不少学者开始探索苗期鉴定新方法。 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法4棉花苗期抗黄萎病性的鉴定——无底纸钵蘸根法4．1引言苗期鉴定一般是在室内进行，苗期鉴定具有快速，不受生长季节限制等优点。用病菌孢子悬浮液接种鉴定是最常用的苗期鉴定方法，常见的有纸钵撕底蘸根法、无底塑钵浇根法、针刺叶片接种法等。但不同的鉴定方法都有一定的缺陷，如接菌不均匀、伤根程度不同、发病情况差异大等。棉花对黄萎病的抗性表现取决于病菌的致病力、接种强度和环境条件等，特别是环境条件中的温度和湿度因素，黄萎病最适宜发病温度是28℃．30℃，湿度40％，过高或过低的温湿条件都不利于病菌发病。本研究采用无底纸钵蘸根法，整个鉴定过程在组织培养室内进行。室内环境条件设置为温度28℃，湿度40％，减小了环境因素对棉花黄萎病发病程度的影响。此外，无底纸钵蘸根法方法简单，伤根程度较纸钵撕底蘸根法轻，是苗期鉴定中较为简便、高效的一种鉴定方法。4．2材料与方法4．2．1实验材料4．2．1．1供试菌株和供试棉花供试菌株和供试棉花品种同上。4．2．1．2培养基查氏培养基(Czapek)：取Na_N03：2．009，K2HP04：1．oog，KCl：0．509，MgS04’7H20：0．509，FeS04：O．019，蔗糖：30．oog，加蒸馏水定容至1000ml，高压蒸汽(121℃)灭菌20min。4．2．1．3实验仪器等。电子天平(1／10000)、超净工作台、高压灭菌锅、恒温摇床、血球计数板、显微镜、相机 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法4．2．2实验方法4．2．2．1孢子液的制备取4片直径为0．6锄、在PDA培养基上培养5．7d的棉花黄萎病菌，接种于150m1Cz印ek液体培养基中。在25℃黑暗条件下，110r肺in震荡培养3．5d。将培养好的菌液，用两层纱布过滤后，在孢子滤液中加入几颗无菌玻璃球，摇床震荡或手动震荡1．2min，使成团的孢子被打散。然后用1．2层灭菌擦镜纸过滤。最后使用血球计数板计数，调配孢子悬浮液浓度。配成1×107个分生孢子／毫升悬浮液，现配现用。4．2．2．2无底纸钵蘸根法无底纸钵蘸根法将纸钵撕底蘸根法与无底塑钵浇根法结合。采用无底纸钵蘸根法鉴定棉花黄萎病抗性，具体方法如下：将脱绒催芽后的棉种播种在装有灭菌土的纸杯(高90IIⅡn，直径75mm，杯底剪掉)中，每杯播4粒种子，每个菌株播种5杯。在28℃的组织培养室内培养，待棉苗长出1．2片真叶时使用。浇水时把水倒入托盘，让水缓慢渗入纸杯中，以防土壤板结，影响生长。棉花长出1．2片真叶时接菌，先将无底纸钵置于玻璃板上稍用力转两圈，使底部棉根产生伤口，再把纸杯放入盛有15ml菌液(以清水处理作对照)的培养皿内，待吸干后，放入原托盘中。接菌前一天应停止浇水，接菌后，也不宜马上浇水，应保持缺水状态12h后再浇水，以确保菌液被棉苗全部吸收。之后，每隔一天浇一次水，保持一定湿度以利发病。一般接菌15天后开始观察发病情况，之后每隔一周调查一次，30天后调查记录发病情况，调查指标包括发病率、叶片发病病情和株高。病情调查采用石磊岩等棉花苗期5级制进行棉苗黄萎病分级：O级：健株，叶片无病状；1级：0．1％．25％的叶片表现病状，叶肉变为淡黄色或有不规则形的黄色病斑；2级：26％．50％的叶片显病状，病斑颜色大部分变为黄色或黄褐色，叶片边略有卷枯；3级：51％．75％的叶片表现病状，有少数叶片凋落；4级：76％以上叶片发病，多为褐色掌状枯斑，叶片有的脱落成光杆，严重时甚至整株枯死。根据调查结果计算棉苗发病率和病情指数，以鉴定所得病指为评价指标，作为评判各菌株致病力水平的依据。分级标准如下：综合评价病指O．01．10．oo为高抗(HR)，lO．1．20．00为抗 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法病(R)，20．01．35．00为耐病(T)，>35．00为感病(S)。4．3结果与分析4．3．1棉苗发病症状图4．1经3种不l司黄委炳函孢子悬浮液侵染后，棉苗的友炳症状Fig4．1111esyTnptomsofcottonseedlingsaRerin钕tedbyⅣd口M口Pspores3种不同棉花黄萎病菌孢子悬浮液侵染棉苗30天后，调查棉苗叶片病情指数和株高。结果显示，对照棉苗生长正常、健壮，叶片为深绿色。而经3种不同黄萎病菌孢子悬浮液侵染后的棉苗均出现不同程度的发病症状(图4．1)。其中，V08sn．1孢子悬浮液侵染后的棉苗发病最重，部分叶片己脱落，留有2．3片顶部叶片，有的棉苗甚至脱落成光杆。但值得注意的是，保留下的叶片多嫩绿，且叶片面积较大。出现这种情况的原因，一方面，可能是部分棉苗死后，或大量叶片脱落后，纸钵内保留更多的养分，平均每棵棉苗可以汲取的养分也更多，增强了棉苗的抗病性，对于项部新叶来说，还没有受到病菌的严重危害，可以较旺盛生长；另一方面，伤根处理时，用力不均匀，造成部分棉苗受侵染程度不同。安阳菌孢子悬浮液侵染后的棉苗发病中等，下部叶片干枯甚至脱落，中部及上部叶片黄化，出现不均匀病斑。V07df2孢子悬浮液侵染后的棉苗发病相对较轻，棉苗下部叶片黄化，干枯叶片较少见，中部及上部叶片部分黄化，且病斑较安阳菌孢子悬浮液侵染后小，与V08sn．1和安阳菌孢子悬浮液侵染后的，棉苗相 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法比，较健壮。4．3．2棉苗发病情况调查结果通过无底纸钵蘸根法对3种不同黄萎病菌孢子悬浮液的致病力进行调查。结果表明，经3种黄萎病菌孢子悬浮液侵染后，棉苗发病程度不一。其中，经V08sn．1孢子悬浮液侵染后，棉苗发病率为100％，病指为65．oo，棉种表现为感病(S)；安阳菌孢子悬浮液侵染后，棉苗发病率为94．70％，病指为35．oo，棉苗表现为耐病(T)：V07d晓孢子悬浮液侵染后，棉苗发病率为80％，病指为17．50，棉苗表现为抗病(R)。对照棉苗生长正常，发病率和病指均为O。此接菌方法的棉株与温室盆钵接菌法相比，对照棉株不存在发病情况，这可能与不同接种方法有关。本接菌方法将不同处理的棉苗分别置于各自的托盘中培养，隔离条件好，直接浇水于托盘中，不需除草等活动，减少了人员对棉株的碰动；且棉苗培养周期相对较短短，组培室内无风等外界因素的影响。sAS9．1．3软件处理数据得，不同黄萎病菌孢子悬浮液处理下，棉苗病情指数呈显著性差异(图4．2)。807060靼50篓4。古302010Ov08sn．1安阳菌黄萎病菌类型图4．23种黄萎病菌孢子悬浮液侵染后，棉苗叶片发病情况Fig4．2111e啊nlletlceofmree∥如矗妇Psporesoncononsc。dlingleaves注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同病菌孢子悬浮液处理下的棉花叶片病情指数呈显著性差异此外，本研究对不同黄萎病菌孢子悬浮液处理后，棉苗的株高进行调查，结果表明，经V08sn．1孢子悬浮液侵染后的棉苗株高为23．473士O．570cm，安阳菌孢子悬浮液侵染后的棉苗株高为26．174士0．396cm，V07d也孢子悬浮液侵染后的棉苗株高为28．230士0．451cm，对照株高为29．952士O．821cm。SAS9．1．3软件处理数据得，不同黄萎病菌孢子悬浮液处理下，棉苗株高呈显 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法著性差异(图4．3)，且棉苗株高与其病情指数呈明显的负相关，这与顾爱星等(2010)的研究结果一致。353025E20恤15鞲1050ck黄萎病菌粪型vd图4．33种黄萎病菌孢子悬浮液侵染后，棉苗株高间的差异Fig4．3111epl锄theightofcotton撒crinfbctedbythree矿d口触口Pspores注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同病菌孢子悬浮液处理下的棉花株高呈显著性差异本研究对苗期鉴定与成株期鉴定结果进行比较，两种方法无显著性差异，且呈明显的正相关，相关系数为0．933。表明无底纸钵蘸根法能准确区分不同病菌间的致病力差异及棉花品种抗感性差异，能较好地代替温室盆钵接菌法用于棉花抗黄萎病性鉴定。4．4讨论本研究结果显示，3种不同的黄萎病菌孢子悬浮液通过无底纸钵蘸根法侵染后的棉苗，叶片病情指数均比对应的温室盆钵接菌法低，这可能是因为无底纸钵蘸根法伤根较轻引起的。这与石磊岩等(1987)的研究结果是相似的。虽然SAS9．1．3软件数据分析得出，这两种方法的鉴定结果没有显著性差异，且相关系数高达O．933，但是两者所得出的棉种抗性级别却不尽一致。两种鉴定方法均得出棉株对V08sn．1表现为感病(S)，但是温室盆钵接菌法得出棉株对安阳菌表现为感病(S)，对V07df2表现为耐病(T)，而无底纸钵蘸根法的鉴定结果表明棉株对安阳菌表现为耐病(T)，对V07df2表现为抗病(R)。这可能是因为无底纸钵蘸根法伤根较轻、接菌量不够均匀或相对不足引起的。无底纸钵蘸根法与温室盆钵接菌法相比，虽然能大大地节省人力、物力、财力等，但鉴定 万方数据浙江大学硕士学位论文棉花苗期抗黄萎病性的鉴定一一无底纸钵蘸根法周期一般也较长，需要1．2个月。而且，不同研究者的操作规范性较难统一，如用力程度不同导致伤根程度差异、孢子量的差异等，最终引起鉴定结果不同，甚至截然相反。在选育抗性品种过程中，可能会因此失去最优品种，造成严重的损失。因此，探索一套操作规范性好、鉴别灵敏度高、结果准确性强、试验条件控制严格、简单、快速的鉴定方法十分必要。 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．1引言温室盆钵接菌法和无底纸钵蘸根法都存在着接菌量不够精确、鉴定周期长等缺陷，探寻和建立简单、快速、准确的鉴定方法，以满足当前棉花黄萎病基础研究与抗病性鉴定的需要是十分必要的。快捷的鉴定技术也是棉花抗黄萎病育种取得重要进展的前提。前人研究结果表明，棉花黄萎病菌分泌的毒素是导致病害的主要因子，毒素侵染后的叶片能产生与棉株上类似的病斑。本研究利用叶片涂抹毒素法和毒素浸根法测定3种黄萎病菌毒素对棉花致萎度，并将其与温室盆钵接菌法进行相关性比较，验证了毒素鉴定的可行性，为利用黄萎病菌毒素进行棉花抗病鉴定提供了理论依据。利用棉花组织培养技术，测定了不同毒素处理下对同一棉花愈伤组织生长的影响和同一毒素对不同棉种(系)愈伤组织生长的影响，结果表明，不同处理下棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量的影响呈显著性差异，说明基于组织培养技术的棉花抗黄萎病鉴定方法是可行的，这为毒素在培养基上的应用提供了依据，也为毒素代替抗生素用于转基因材料的筛选和鉴定提供了可能。毒素鉴定方法在组织培养室内进行，环境条件控制好；毒素均匀混于水中或培养基中，接种均匀：叶片涂抹毒素法和毒素浸根法整个鉴定周期只需15．20d，鉴定周期短：所需空间小，是一种简单、高效、快速、准确的鉴定技术。而基于组织培养技术的毒素鉴定应用前景广阔，是值得探索的新领域。5．2材料与方法5．2．1实验材料5．2．1．1供试菌株和棉花品种供试菌株同上。供试棉花品种：z儿0584(陆地棉)、Coker302(陆地棉)、亚洲棉和海岛棉。 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．2．1．2培养基(1)无菌苗生长培养基：为MS培养基的大量元素(见表5．1)；附加30∥L的葡萄糖和7∥L的琼脂；pH值为5．8。(2)愈伤组织诱导培养基：为MSB(MS培养基的无机盐、B5培养基的有机物)或LS培养基为基本培养基(见表5．1)；附加O．1m∥LKT，O．2m∥L2，4-D，O．75∥LMgCl2，30∥L的葡萄糖和2．6∥L的植物凝胶；pH值调为5．8。(3)继代培养基：为MSB培养基(MS培养基的无机盐、B5培养基的有机物)，但IⅢ03加倍，无NH4N03(见表5．1)；附加0．75∥LMgCl2，30∥L的葡萄糖和2．6∥L的植物凝胶；pH值调为5．8。表5．1MS、LS和B5培养基的基本成份Table5．1Basicmediumcomponentsfortissuecultureofcotton 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性(4)PDA培养基和查氏培养基同上。5．2．1．4实验仪器高压蒸汽灭菌锅、pH仪、电子天平、超速离心机、电磁炉、超净工作台、相机、紫外分光光度仪等。5．2．2实验方法5．2．2．1毒素的制备将新鲜菌块(直径O．6cm)移入装有100mL无菌查氏培养基的250mL三角瓶中，于25℃下11帆／min振荡培养15d，菌液在8℃条件下，经15000舢离心20min，取上清液(或取上清液经O．45肛m微孔滤膜真空过滤)，所得到的滤液即为粗毒素滤液。5．2．2．2毒素蛋白浓度的测定毒素浓度的测定采用Bradford等(1976)方法，具体操作如下：(1)考马斯亮蓝G．250溶液的配置：精确称取50mg考马斯亮蓝G．250，溶于25m190％(v／v)的乙醇中，加入85％(w／v)磷酸50ml，最后用蒸馏水定容至500ml，贮放在棕色瓶，此溶液常温下可放置一个月。(2)牛血清白蛋白标准溶液的配制(现用现配)：准确称取25mg牛血清白蛋白，溶于25ml蒸馏水中，即为1000¨g／m1的原液。再分别取O．1，O．2，O．3，O．4和0．5ml母液于试管中，用蒸馏水加至5m1，即成含有20，40，60，80和100烬／“的蛋白质标准液。视情况变化，也可取母液量减半，进而配制成10，20，30，40和50嵋／ml的蛋白质标准液。(3)标准曲线制作：于10ml离心管中，加入下列溶液(表5．2)，同时做三个重复。表5．2牛血清白蛋白标准溶液的配制T{出le5．2Thest柚出Ird1ineofBSA(BovineSemmAlbumin) 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合均匀(纵向倒转20次)后，放置2min，在岛津u2450型分光光度计上测定595m处的光密度，比色杯厚度为1cm，以蒸馏水1ml代替标准蛋白质溶液作为空白对照。记录各管测定的光密度OD595，以标准蛋白质浓度为横坐标，以OD595为纵坐标，绘制标准曲线。(4)样品测定：取待测液1m1(视浓度适当稀释)，按上述标样处理方法与考马斯亮蓝溶液反应，测得溶液的0D595。根据标准曲线找出相应的毒素蛋白质浓度。5．2．2．3非基于组织培养技术的毒素鉴定5．2．2．3．1毒素对棉籽胚根生长的影响棉花种子经硫酸脱绒晾干后，在0．1％HgCl2溶液中浸泡8-10min，并不断的轻轻摇动，然后用灭菌的蒸馏水冲洗3．5次，以获得无菌的棉种。挑选饱满一致的棉种在28℃恒温培养箱内催芽，待胚根长度大于等于棉种长度时，挑选胚根长度一致的棉种，置于铺有两层滤纸的、含有5m110肛g／ml毒素液的培养皿中。每皿放6粒种子，每个处理3次重复。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养，用去离子水作对照，处理48h．72h，记载胚根长度。5．2．2．3．2叶片涂抹毒素法棉籽在无菌土中播种，待棉苗长出2片真叶时备用。将第二片真叶置于铺有两层滤纸的培养皿中，涂抹10“幽nL的毒素液。每个处理5次重复，置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内，用去离子水作对照，处理72h，记载棉叶发病情况。采用叶片涂抹毒素法接菌72h后，按以下病情分级标准进行调查：0级：不形成病斑；1级：病斑面积占叶片面积的25％以下；2级：病斑面积占叶片面积的25％．50％；3级：病斑面积占叶片面积51％．75％：4级：病斑面积占叶片面积75％以上。根据调查结果计算棉叶发病率和病情指数，以鉴定所得病指为评价指标，作为评判各菌株致病力水平的依据。分级标准如下：综合评价病指O．01．10．oo为高抗(HR)；10．1．20．oo为抗病(R)；20．01．35．oo为耐病(T)；>35．oo为感病(S)。41 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．2．2．3．3毒素浸根法在组织培养室28℃条件下培养棉苗，按常规管理。待棉苗长出1．2片真叶时，用清水浇透纸钵土壤，轻轻将棉苗与土壤分离，并在自来水下轻轻冲洗掉棉苗根部的泥土及掐掉棉苗的根毛和部分较长的幼根。然后，将棉苗浸入含有30ml毒素液的试管中，毒素液浓度为10¨g／mL，每个品种处理10株，5次重复，并设去离子水及空白培养液处理为对照。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内，处理72h，记载棉苗致萎度。采用毒素浸根法接菌72h后，按以下病情分级标准进行调查：O级：无症状；1级：仅子叶轻度萎蔫；2级：两子叶明显萎蔫，真叶轻度萎蔫；3级：子叶严重萎蔫，黄化失水，真叶萎蔫，失水；4级：全株萎蔫，真叶脱落。根据调查结果计算棉苗发病率和病情指数，以鉴定所得病指为评价指标，作为评判各菌株致病力水平的依据。分级标准如下：综合评价病指O．01．10．00为高抗(HR)；10．1．20．00为抗病(R)；20．01．35．00为耐病(T)：>35．oo为感病(S)。5．2．2．4基于组织培养技术的毒素鉴定5．2．2．4．1无菌苗的获得棉花种子经硫酸脱绒晾干后，在O．1％HgCl2溶液中浸泡8-10min，并不断的轻轻摇动，然后用灭菌的蒸馏水冲洗3．5次，接种到无菌苗生长培养基中(胚根向上)，于28℃条件下暗培养5．7d。5．2．2．4．2愈伤组织的获得取5．7d苗龄的无菌苗下胚轴，切成0．5．0．8cm的小段，将这些小段置于愈伤组织诱导培养基上培养，每瓶放4．6个，每15．20d换一次培养基，30．40d后，将诱导出的愈伤组织置于继代培养基上增殖，每15d换一次培养基，于为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养。42 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．2．2．4．3筛选培养基上最适毒素鉴定浓度(以安阳菌为例)将棉花愈伤组织分别置于含有不同浓度(1．0p∥ml，2．5“g／ml，5．0pg／ml，7．5p∥ml，10．0肛∥m1)高温灭菌后和未灭菌的安阳菌毒素的MSB培养基上培养。每个处理5次重复，每个培养皿上放3．4个愈伤块。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养，以不加毒素的愈伤组织做对照，培养lOd。观察棉花愈伤组织生长情况，记录愈伤组织增重量、颜色变化、POD、MDA含量差异。(1)棉花愈伤组织POD的测定方法：①样品制备：鲜样O．1加入1ml磷酸缓冲液(O．05M，pH7．8)，稍许石英砂，研磨成匀浆；移入10ml离心管中，再用4m1磷酸缓冲液分两次洗涤研钵，并全部转入离心管中；10000咖in、4℃下离心20min：上清夜贮于4℃冰箱中保存备测。其中，磷酸缓冲液O．05M(pH7．8)的配制：取0．6639NaH2P04·2H20和16．3849Na2HP04。12H20，加PⅥ’109，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM，加蒸馏水定容至1L。用前冰箱或冰上预冷。②试剂配制：1．5％愈创木酚(1．5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100m1)：300uM的H202：取30％的H2021．53ml，用蒸馏水定容到50ml。⑧实验步骤：100ul酶液+2700ul磷酸缓冲液+100ul愈创木酚+100ulH202，于普通比色皿，轻轻摇匀，～70动力学测定1min。选择时间段较为笔直的曲线斜率为POD活性值，此后测定均参考该时间段。结果计算：POD(mM儋)=POD活性值×A×v×a／(E×w)式中，A为反应液总体积／ml；V为提取液总体积／ml；a为测定液体积／ml；w为材料鲜重儋；E为吸光系数／mM·cm。1(2)棉花愈伤组织MDA的测定方法①样品制备方法同上。②试剂配制：5％三氯乙酸(TCA)：259三氯乙酸定容到500mL。MDA反应液：2．59硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5％三氯乙酸定容到500mL。43 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性③实验步骤：0．5mL酶液+2．5mL反应液，沸水浴反应15min，立即冰浴，480眦／min离心10min，上清转入新管，波长450，532和600下比色，MDA反应液调零。结果计算：丙二醛含量(nM．91)=(D532一D600)×A×V／(a×1．55×10。1×w)式中，A为反应液总量(mL)；V为提取液总量(mL)；a为测量用提取液量(mL)；w为材料鲜重(g)。1．55×10‘1为丙二醛的消光系数(uM／L)。5．2．2．4．43种不同黄萎病菌毒素对棉花愈伤组织生长的影响将棉花愈伤组织置于分别含有2．Opg佃1V08sn．1、安阳菌、V07d亿毒素的MSB培养基上培养。每个处理5次重复，每个培养皿上放3．4个愈伤块。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养，以不加毒素的愈伤组织做对照，培养10d。观察棉花愈伤组织的生长情况，记录愈伤组织增重量、颜色变化、POD、MDA含量差异。POD和MDA的测定方法同上。5。2．2。4．5毒素对不同棉花品种愈伤组织生长的影响5．2．2．4．5．14种棉花愈伤组织在不含毒素的培养基上的生长情况比较将4种不同棉花愈伤组织(ZJl0584、Coker302、亚洲棉和海岛棉)分别置于不含毒素的MSB培养基上培养。每个处理5次重复，每个培养皿上放3．4个愈伤块。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养，培养10d。观察不同棉系愈伤组织生长情况，记录愈伤组织增重量、颜色变化、POD、MDA含量差异。POD和MDA的测定方法同上。5．2．2．4．5．2毒素(以安阳菌毒素为例)对4种棉花愈伤组织生长的影响将4种不同棉花愈伤组织(z儿0584、Coker302、亚洲棉、海岛棉)分别置于含有2．0“g／m1安阳菌毒素的MSB培养基上培养。每个处理5次重复，每个培养皿上放3．4个愈伤块。置于培养条件为28℃，光暗比为16／8的组织培养室内培养，培养10d。观察不同棉系愈伤组织生长情况，记录愈伤组织增重量、颜色变化、POD、MDA含量差异。POD和MDA的测定方法同上。 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．3结果与分析5．3．1棉花黄萎病菌产毒量3种不同的黄萎病菌产毒量不同，其中，V08sn．1的产毒量最高，毒素浓度为78．46“g／ml，安阳菌毒素浓度为55．80肛g／ml，V07df2的产毒量最低，毒素浓度为43．64pg／ml。结合前文研究结果表明，致病力最强的菌株产毒量最高，致病力最弱的菌株，产毒量最低。这与桑茜(2010)等学者的研究结果一致。3种黄萎病菌毒素颜色均为黄色系，但深浅不同。其中v08sn．1毒素的颜色最深，V07d也毒素的颜色最浅，安阳菌毒素的颜色介于两者之间。因此，可以推测出，黄萎病菌毒素浓度可能和毒素颜色呈正相关，有关这方面的研究较少，还需进一步的深入。5．3．2非基于组织培养技术的毒素鉴定法的可行性5．3．2．1不同黄萎病菌毒素对棉种胚根伸长的影响种子发芽及棉花胚根获得方法见本章实验方法中5．2．2．3．1。毒素接种棉花胚根72h后，观察胚根伸长情况。结果表明，对照棉籽胚根生长较快，胚根白色，未见明显的萎缩、失水、变褐现象；多可见黄绿色子叶，胚根平均伸长4．58土0．15cm。而经3种不同黄萎病菌毒素侵染过的棉种，胚根伸长均受到不同程度的抑制(图5．1)。V08sn．1毒素处理后的胚根伸长最慢，胚根多萎缩、失水、根尖变褐；很少见到黄绿色子叶，胚根伸长较短，平均伸长1．89士0．09cm。安阳菌毒素处理后的棉种，胚根多为白色，少量胚根萎缩、失水、变褐，程度不及V08sn．1严重；可见部分黄绿色子叶，胚根平均伸长3．08士0．29cm。V07df2毒素处理后的棉种，胚根多生长正常，极少见萎缩、失水、变褐现象：胚根平均伸长3．32士0．16cm。用SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，这3种黄萎病菌毒素对胚根伸长的抑制呈显著性差异(图5．2)。表明，毒素是具有活性的，通过毒素抑制胚根伸长的实验验证了毒素用于棉花抗黄萎病性鉴定的可能性。45 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性^∈0删啦警凼lO图5．1毒素对胚根伸长的抑制Fig5．1TheinhibitionofthI‘ee矿da^^白Ptoxinstocottonradical曰目日目目酉安阳菌图5．23种黄萎病菌毒素侵染后，胚根伸长量的比较Fig5．2Thee眠toftoxin舶m肜如^，曲Ponl即gmofcononradical注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同黄萎病菌毒素处理下的棉种胚根伸长量呈显著性差异5．3．2．2叶片涂抹毒素法鉴定结果叶片涂抹毒素72h后，观察叶片(第二片真叶)发病情况。结果表明，对照叶片不感病，叶片嫩绿，未出现褪绿斑。经3种不同黄萎病菌毒素侵染过的棉叶，均出现明显的发病症状(图5．3)。发病症状的出现往往不是整片叶，而是从项部叶缘开始，然后是叶脉附近组织。开始出现症状时，叶片一般先表现为失绿、变黄，然后逐步卷曲、枯萎，枯萎有时并不连片，也有可 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性能在某叶脉附近出现坏死点，斑点的大小会随着侵染时间的延长而逐渐扩大。经V08sn．1毒素处理过的棉叶，叶脉周围出现了黄色斑点，严重的部分己变灰褐色，且斑点较大。安阳菌毒素处理过的棉叶，叶脉周围也出现了黄色甚至灰褐色斑点，但斑点相对较小，褐色部分颜色也不及V08sn．1深。V07df2毒素处理过的棉叶，叶脉周围只出现了黄色斑点，未见灰褐色斑点。图5．3叶片涂抹毒素72h后炳斑特点Fig5．3ThesyTnptomofleaVesaRer仃eating州thK如肋口Ptoxinsfor72h3种不同黄萎病菌毒素侵染棉叶72h后，调查叶片的发病率及病情指数。结果显示，对照棉叶不发病，发病率和病指均为0。经3种不同黄萎病菌毒素侵染过的棉叶均发病，且发病率均为100％。V08sn．1毒素处理后的棉叶发病最重，病情指数为60．oo，棉种表现为感病(S)。安阳菌毒素处理后的棉叶发病中等，病情指数为35．oo，棉种表现为耐病(T)V07d也最轻，病情指数为15．oo，棉种表现为抗病(R)。此鉴定方法所得出的棉种抗黄萎病性级别与温室盆钵接菌法不尽一致。两种鉴定方法均得出棉株对v08sn．1表现为感病(S)，但是温室盆钵接菌法得出棉株对安阳菌表现为感病(s)，对V07df2表现为耐病(T)；而叶片涂抹毒素法的鉴定结果表明，棉种对安阳菌表现为耐病(T)，对V07d也表现为抗病(R)。这可能是因为棉花黄萎病为土传病害，病菌一般从根部侵入，而叶片涂抹毒素法是从叶片表面接种，不是从根部接种，导致鉴定结果与温室盆钵接菌法不完全吻合。47 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性7060榻50辇4。篓3。吉20lOOckv08sn．1安阳菌黄萎病菌毒素图5．43种黄委病菌毒素侵染后，棉叶病情指数比较Fig5．4111e“rulalceofⅡlree矿出柚韶toxins0nco讹nleaves注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同黄萎病菌毒素处理下的棉叶病情指数呈显著性差异SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，这3种黄萎病菌毒素对棉叶的致萎度呈显著性差异(图5．4)。叶片涂抹毒素法与温室盆钵接菌法的鉴定结果进行比较，结果显示，两者不存在显著性差异，相关系数为0．847。毒素涂抹叶片法侵染后的棉叶，叶片病情指数普遍比对应的温室盆钵接菌法低，这可能与黄萎病菌的侵入途径有关(棉花黄萎病为土传病害，黄萎病菌多从根部侵入植株)：另一方面，可能是因为，叶片表面有蜡质物质等，对叶片内部组织起到一定的保护作用，毒素不易侵入，致使棉叶发病较慢且轻。5．3．2．3毒素浸根法的鉴定结果待棉苗长至2片真叶时，毒素浸根试验证实，24h、48h后棉苗萎蔫度不能真实反映棉苗对黄萎病菌毒素的抗性水平，而毒素浸根72h后，棉苗萎蔫度变化不大，相对稳定(图5．5)。萎蔫出现的时间和程度依毒素液的不同而有一定差异。其中，V08sn．1毒素对棉苗的致萎度出现的最早且最重，发病率100％，病指达70．oo，棉苗表现为感病(S)；子叶干枯甚至脱落，真叶失水、萎蔫。安阳菌毒素对棉苗的致萎度中等，发病率loo％，病指为40．oo，棉苗表现为感病(S)：子叶失水、萎蔫，甚至干枯，部分真叶失水、下垂。V07df2毒素对棉苗的致萎度出现的最晚且最轻，发病率100％，病指为27．50，棉苗表现为耐病(T)；子叶失水、萎蔫，少量真叶失水。 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性807060概靼50蓑4。苎30宣20lOO图5．53种不同黄萎病菌毒素处理72h后，棉苗萎蔫症状Fig5．5Eff＆tofⅣda^，蛔PtoxjnsoncottonsccdlingaRer72hcklck2v08sn-lvdv07df2黄萎病菌毒素图5．63种黄萎病菌毒素处理棉苗72h后，棉茁叶片病情指数比较Fig5．6ThedegreeofvillJlenceofthreeKda^，胁etoxinsoncottonseedlings注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同黄萎病菌毒素处理下的棉苗叶片病情指数呈显著性差异49 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性用SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，这3种黄萎病菌毒素对棉苗的致萎度呈显著性差异(图5．6)。对毒素浸根法与温室盆钵接菌法的鉴定结果进行比较，结果显示，两者不存在显著性差异，相关系数为O．856。虽然毒素浸根法与温室盆钵接菌法的相关系数不及无底纸钵蘸根法与温室盆钵接菌鉴定法大，但是毒素浸根法鉴定出的棉种抗性级别与温室盆钵接菌法完全吻合。毒素浸根法是遵从黄萎病菌从根部侵入的理论基础，将棉苗浸入毒素液中，观察毒素对棉苗的致萎度。这种鉴定方法简单、快速、高效、准确，可应用于棉花抗黄萎病育种早期世代大批量材料的筛选。随着鉴定技术体系的不断完善，终将取代病圃鉴定而成为棉花抗病鉴定的主导方法。5．3．3基于组织培养技术的毒素鉴定法5．3．3．1高温灭菌后的毒素和未灭菌毒素(以安阳菌毒素为例)的活性差异将未灭菌的毒素直接用于培养基中，易造成培养基的污染，使基于组织培养技术的毒素研究无法顺利进行。若采用微孔过滤灭菌，一方面，可能会造成部分毒素有效成分的丢失；另一方面，这种灭菌方法费时、费力，操作不便。高温灭菌简单方便，但是经高温灭菌后的棉花黄萎病毒素是否会失活或者失活率有多大等，目前学术界还无一致结论。为此，本研究首先对高温灭菌后的毒素和未灭菌的毒素的活性差异进行了比较，为后期黄萎病菌毒素能够大量、简便地用于组织培养技术中提供理论支持。本研究结果表明，棉花愈伤组织在MSB培养基上培养10d后，经高温灭菌后的毒素和未灭菌的毒素分别处理过的棉花愈伤组织都出现了不同程度的变红、褐化。随着毒素侵染时间的延长和毒素浓度的增加，愈伤的变红、变褐率增加。如图5．7所示，在O．2．5¨∥ml毒素浓度间，棉花愈伤组织增重量变化差异明显，且在2．5“∥ml毒素浓度后，愈伤组织增重量变化不大，在10肛∥ml毒素浓度时，愈伤组织增重量几乎为0。而对照棉花愈伤组织生长旺盛，愈伤组织块呈嫩绿色。棉花愈伤组织在MSB培养基上培养10d后，棉花愈伤组织MDA含量(图5．8)随着毒素浓度的增加而呈先上升后下降的趋势，在5肛g／ml处达到一个峰值，之后下降。这可能是在5¨咖l之前，愈伤组织体内MDA对外界胁迫敏感，MDA含量快速升高，但是随着毒素浓度的增加，毒害时间的延长，部分愈伤细胞死亡，MDA含量下降。棉花愈伤组织在MSB培养基上培养10d后，愈伤组织POD含量(图5．9)随着毒素浓度的增加而呈先上升后下降的趋势，在1pg／ml处达到一个峰值。这可能是在1“g／ml之前，愈伤50 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性组织体内POD对外界胁迫敏感，POD含量快速升高，但是随着毒素浓度的增加，毒害时间的延长，部分愈伤细胞死亡，POD含量下降。7芑6仓5高4鄂3骚哥2$铟10l2，557．510一灭菌前一灭菌后安阳菌毒素浓度(Jlg，1n1)图5．7高压灭菌前后不同浓度安阳菌毒素处理下愈伤组织增重量的比较Fig5．7E脑tofvariousconc朗仃ationsof矿如^f妇e(Anyang)toxinsonweightgainofcallus注：灭菌前指未灭菌的毒素，灭菌后指经高温灭菌后的毒素；兰∞言E5■加《a=250l2．557．510安阳菌毒素浓度(雌柚1)一灭菌前．一灭菌后图5．8高压灭菌前后不同浓度安阳菌毒素处理下愈伤组织内MDA含量的比较Fig5．8111eMDAcont即tsofcallusmer廿髓ting、ⅣithV撕ousconc∞tmtjonsof矿出肋口P(Anyang)toxins注：灭菌前指未灭菌的毒素，灭菌后指经高温灭菌后的毒素薹@芎量、一●加8l2018Ol2．557．510安阳菌毒素浓度(Il卫佃I)一灭菌前一灭菌后图5．9高压灭菌前后不同浓度安阳菌毒素处理下愈伤组织内POD含量的比较Fig5．9111ePODcontelltsofcallus撕ert恻ingwithV州ousconc肌tmtionsof矿如胁ⅡP(Anyaflg)toxins注：灭菌前指未灭菌的毒素．灭菌后指经高温灭菌后的毒素5105050爿～、：i=71i：尸／一 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性用SAS9．1．3软件处理数据，分析得出，用高压灭菌前后的黄萎病菌毒素分别处理棉花愈伤组织，引起的毒害作用差异不大。在棉花愈伤组织增重量、MDA、POD含量水平上，高温灭菌后的毒素和未灭菌的毒素对棉花愈伤组织的毒害作用都没有显著性差异，且呈明显的正相关。相关系数分别为0．975，0．978，0．980。此研究结果表明，棉花黄萎病菌毒素具有耐高温性，灭菌后的毒素仍保持较高的活性。这与王克荣等(1982)、陈旭升等(2002)的研究结果是一致的。毒素的热稳定性可能与其组成成分有关。国内外多数学者认为，棉花黄萎病菌毒素的主要成分为糖蛋白。糖蛋白中的糖链部分一般是以蛋白质构象修饰者的身份参与作用，而直接充当“活性部位”的证据则很少，然而，糖链在稳定蛋白质活性中心所起的作用是无法低估的，一般不含糖的蛋白质加热后容易变性；而糖蛋白随着糖链的裂解，其稳定性也将趋于丧失。棉花黄萎病菌毒素之所以可耐高温，很可能与它的高含糖率有关。本研究结果为之后毒素在组织培养基上的使用提供了便利，解决了毒素在培养基上易产菌的难题。此外，高温灭菌代替了过滤灭菌的程序，减少了过滤灭菌过程中，部分毒素有效成分的缺失。这也为高温灭菌后的毒素用于基于组织培养技术的棉花抗黄萎病性鉴定方法提供了可能。5．3．3．2毒素在愈伤组织培养基上的最适鉴定浓度从图5．7可以看出，用大于2．5ug／ml安阳菌毒素处理棉花愈伤组织，愈伤增重量变化不大。用1“∥ml和2．5“∥ml安阳菌毒素处理棉花愈伤组织，都能较好地表达安阳菌毒素的致病力。但是考虑到本研究中使用的3种黄萎病菌致病力的差异明显，安阳菌属于标准菌株，中等致病力，而V08sn．1属于强致病力菌株，V07d亿属于弱致病力菌株。如果以1．0“g／ml毒素浓度为最适毒素浓度，对v07d亿(弱致病力)来说，愈伤组织增重量可能与对照没有明显差异；而如果以2．5u咖l毒素浓度为最适毒素浓度，则对V08sn．1(强致病力)来说，毒素对愈伤组织的毒害过重，甚至导致部分愈伤组织死亡，不能准确地表达毒素对棉种的致病力差异。综合以上，可以选择2．0“咖l毒素浓度为最适毒素浓度。从图5．8和5．9也可以看出，2．0¨∥m1毒素浓度的愈伤组织MDA、POD含量也较接近峰值，与对照差异较明显。 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．3．3．33种不同黄萎病菌毒素对棉花愈伤组织生长的影响图5．102．0p∥ml不同黄萎病菌霉素处理下，棉花愈伤组织的生长情况Fig5．10ThesymptomsofcottoncallusaRertreatingwitllthree2．Op∥m1”如^以口Ptoxins以上研究表明，无论是叶片涂抹毒素法还是毒素浸根法等，非基于组织培养技术的毒素鉴定棉花抗黄萎病性的方法均显示出，3种棉花黄萎病菌毒素对陆地棉zJl0584表现出不同的致病力，且差异显著。然而，在培养基上，3种黄萎病菌毒素对陆地棉ZJl0584愈伤组织的致病力如何呢?本实验对此进行了研究。研究结果表明，棉花愈伤组织在MSB培养基上培养10d后，经3种不同黄萎病菌毒素处理过的愈伤组织出现不同程度的变红、变褐现象(5．10)，而对照愈伤组织生长正常，呈黄绿色。随着毒素侵染时间的延长，愈伤组织变红、变褐率也随之增加。其中，经v08sn．1毒素处理过的棉花愈伤组织出现变红现象最早，一般1d后即可见到；10d后，全部愈伤组织已经变褐，愈伤组织表面有水分产生(酚类物质的反应产物)；愈伤组织变软。棉花愈伤组织表面的水分是组织内酚类物质的反应产物，而酚类物质的增加量是组织受毒害严重程度的体现。安阳菌毒素处理过的棉花愈伤组织一般在1．2d后，可见愈伤组织变红现象；10d后，部分愈伤组织为红色，部分变褐，且表面有少量水分产生；愈伤组织变软。而经V07d晓毒素处理过的愈伤组织一般在2d后才可见变红现象；10d后，愈伤组织极少部分变褐，多数为米黄色或红色，少见水分产生；愈伤组织变软。本研究结果表明，V08sn．1毒素对棉花愈伤组织的毒害作用最强，安阳菌毒素次之，V07df2毒素最弱。53 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性≥剖制■单螭_叠ckv08sn-1、-dv07df2黄萎囊曹●謇图5．1l不同黄萎病菌毒素处理下，棉花愈伤组织增重量的比较Fig5．1lEffbctofdif五暑rentkindsof矿IE缸^f妇Ptoxinsonweightgainofcallus注：a、b、c、d表示在0．05水平下，不同黄萎病菌毒素处理下的棉花愈伤组织增重量呈显著性差异25；20百15E咧10伽《呈50vdv07df2黄羹囊曹毒素图5．123种不同黄萎病菌毒素处理下，棉花愈伤组织内MDA含量的比较Fig5．12TheMDAcont∞tsofcallusaRern_cating、“thdifI宅rentkindsofK出^如口Ptoxins注：a、b、c、d表示在0．05水平下。不同黄萎病菌毒素处理下的棉花愈伤组织内MDA含量呈显著性差异≥-，、之百E昌L’一酬钔ao2550b—C厂]黄萎病菌毒素v07df2图5．13不同黄萎病菌毒素处理下，棉花愈伤组织内POD含量的比较Fig5．13ThePODcont朗tsofcallus硪ertreating、vithdiff白．肌tkindsofⅣ如肋口Ptoxins注：a、b、c、d表示在O．05水平下，不同黄萎病菌毒素处理下的棉花愈伤组织内POD含量呈显著性差异7654321O 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性棉花愈伤组织在MSB培养基上培养lOd后，经3种不同黄萎病菌毒素处理过的棉花愈伤组织增重量(图5．11)、MDA(图5．12)、POD(图5．13)含量差异很大，均呈显著性差异，且与温室盆钵接菌法呈明显相关性，相关系数分别为．O．822，0．913，O．963。此研究结果表明，基于组织培养技术的毒素鉴定方法是可行的。在生产上，这种鉴定方法特别适用于某地区新品种引进时，鉴定当地不同黄萎病菌系对此棉花品种的致病力，或者说这个棉花品种在当地对不同黄萎病菌的抗性，从而确定这个品种是否适合在这个地区推广。但是，目前，这种鉴定方法的研究及应用相对还较少，还没有一套完整的抗性分级标准，之后，还应对棉花与毒素间的互作关系做进一步的研究，探索出一套有效、准确的抗性分级标准，使基于组织培养技术的毒素鉴定方法的应用更加广泛。5．3．3．4毒素(以安阳菌毒素为例)对不同棉花愈伤组织生长的影响5．3．3．4．14种棉花愈伤组织在不含毒素的培养基上的生长情况以上研究己证实，基于组织培养技术的毒素鉴定方法可以准确地测定出不同黄萎病菌的致病力差异，但是这种方法是否也适用于不同棉种的抗黄萎病性的测定呢?本实验拟以不同棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量为评价指标进行研究。然而，保证评价指标有效的必要前提是在不加黄萎病毒素的培养条件下，不同棉花愈伤组织的增重量、MDA、POD含量没有显著性差异。因此，本研究首先对不加毒素条件下，不同棉花愈伤组织的生长情况进行了比较。coker302亚洲棉海岛棉棉花品种(系)图5．14不含毒素培养基上，不同棉花愈伤组织增重量的比较Fig5．14The台镪hweightofcallusd甜vedf如mdifR=relltkindsofcottoninabsefIceoftoxin注：a表示在0．05水平下，不含毒素处理条件下的不同棉花愈伤组织增重量不呈显著性差异55654321O芑^?酬删期聚寐蝠倒 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性16141210到10584coker302亚洲棉海岛棉椎花品种(系)图5．15不含毒素处理条件下，不同棉花愈伤组织内MDA含量的比较Fig5．15111eMDAconterItofcallusd甜Ved舶mdif‰ntkindsofcononinabs∞ceoftoxin注：a表示在0．05水平下，不含毒素处理条件下的不同棉花愈伤组织内MDA含量不呈显著性差异zJl0584coker302亚洲棉海岛棉棉花品种(系)图5．16不含毒素处理条件下，不同棉花愈伤组织内POD含量的比较Fjg5．16111ePODcont舶tof训lusderived舶mdiffb姗tkindsofcottoninabs∞ceoftoxin注：a表示在0．05水平下，不含毒素处理条件下的不同棉花愈伤组织内POD含量不呈显著性差异sAs9．1．3软件处理数据，分析得出，不加毒素的培养条件下，不同棉花愈伤组织的增重量(图5．14)、MDA(图5．15)、POD(图5．16)没有显著性差异。此研究表明，不同棉花在愈伤组织阶段，棉花品种的差异不会造成其愈伤组织增重量、MDA、POD含量的差异。为利用棉花黄萎病菌毒素鉴定不同棉花品种抗病性提供了理论依据。^^-^a，IoEcv删加《a兰09876543210奄，-!I^嘶／lo蜀=_v●加Dol 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性5．3．3．4．2毒素(以安阳菌毒素为例)对4种不同棉花愈伤组织生长的影响本研究在以上结论的基础上，进一步对含毒素的培养条件下，不同棉花愈伤组织增重量、MDA、POD含量进行了比较。结果表明，不同棉花愈伤组织受到毒素的毒害程度不同(图5．17)。Z儿0584和Coker302都属于陆地棉，其中Z儿0584为本实验室多年来培育的品种，具有较好的农艺性状，但不抗黄萎病，Coker302农艺性状相对较差，不抗黄萎病。这两个陆地棉品系对安阳菌毒素的抗性较差，都出现了较严重褐化，但褐化程度不同。ZJl0584的愈伤组织相对较好，有部分愈伤经10d的毒素毒害后，还表现为黄绿色：而Coker302中未见黄绿色愈伤组织。亚洲棉受到毒素的毒害程度最重，愈伤组织全部褐化，且表面有大量的水分产生。海岛棉受到的毒害程度较轻，部分愈伤组织褐化，愈伤生长较旺盛，呈米黄色；但愈伤组织质量较差，愈伤组织变软。本研究结果表现出的海岛棉抗黄萎病性最强，陆地棉次之，亚洲棉最差的结论，与姚耀文等(1982)的研究结果一致。表明利用黄萎病菌毒素接种不同棉花的愈伤组织鉴定不同棉花品种(系)的抗黄萎病性是可行的。图5．172．0p∥m1安阳菌毒素处理下，不同棉花愈伤组织的生长情况Fig5．17ThenecroticSymptomsofcottoncaIlusaRer仃eatingwith2．0耻∥mlⅣ如厅矗口PtoxinSAS9．1．3软件处理数据，分析得出，在同一毒素处理下，不同棉花愈伤组织的增重量(图5．18)、MDA(图5．19)、POD(图5．20)呈显著性差异。此研究结果从生理生化的角度表明，在组织培养技术的基础上，用毒素代替黄萎病菌，鉴定不同棉花的抗黄萎病性是可行的。同一 万方数据病菌毒素对不同抗、感性的棉花品种的毒害差异显著。这与侯丽娟等(2010)的研究结果一致。这种鉴定方法不用培养棉苗，节省空间和棉籽，特别遁思量_些珍贵的转基固材料或野生材料的抗黄萎病性鉴定。lO．90．8O．70．6O．50．4O-3O．2O．10卫10584coker302亚洲棉海岛棉棉花品种(系)图5。182。0飕／mJ安阳菌毒素处理下。不同棉花愈伤组织增重量的比较Fig5．18Theweightgainof4kindsofcottoncallusafI￡rtrea矗ngwith2．0“g／mlKda^nⅡPtoxin注：a、b、c表示在O．05水平下，2．0pg／ml安阳菌毒素处理下的不同棉花愈伤组织增重量呈显著性差异252015105O刭10584coker302亚洲棉海岛棉棉花品种(系)图5．192．0p∥ml安阳菌毒素处理下，不同棉花愈伤组织内MDA含量的比较Fig5．19111eMDAof4kindsofcononcaIlus心ertreatingwith2．0¨∥ml旷如柚口Ptoxin注：a、b、c表示在0．05水平下，2．Op∥m1安阳茵毒素处理下的不同棉花愈伤组织内MDA量呈显著性差异；k^a)删删船耶果攀悃^^u^暑／Io￡高v删加《凸= 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性bT上C上一上coker302亚洲棉海岛棉棉花品种(系)图5．202．0“g／ml安阳菌毒素处理下，不l司棉花愈伤组织内POD含量的比较Fig5．20ThePODof4kindsofcottoncallusaner仃eatingwith2．0“∥mlKda^矗乜etoxin注：a、b、c表示在0．05水平下，2．0倒ml安阳菌毒素处理下的不同棉花愈伤组织内POD量呈显著性差异基于组织培养技术的毒素鉴定方法，整个鉴定周期大概40．50d，所需时间短；整个过程在组织培养室内进行，环境影响小；毒素均匀混于培养基中，毒素侵染均匀一致；毒素量使用量极少，使定量更准确；愈伤组织可以不增殖，用于不同黄萎病菌的致病力鉴定；不用培养棉苗，节省空间和棉籽，特别适合珍贵材料的抗性鉴定；是一种较为简单、快速、高效、准确的棉花抗黄萎病性鉴定方法。5．4讨论棉花抗黄萎病性鉴定是黄萎病菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制、抗病种质筛选、抗病品种选育等研究工作的重要基础，因此，准确、快速、规范的鉴定技术对于开展棉花抗病育种工作和提高病害综合防治成效等具有重要理论和实践意义(张翠芳等，2010)。多年来，国内外学者主要通过人工病圃鉴定和苗期鉴定，评估棉花抗黄萎病性。然而，人工病圃鉴定周期长，严重阻碍了棉花抗黄萎病育种进程；苗期鉴定因伤根不均匀等因素，往往造成鉴定出的抗性级别与病圃鉴定不吻合。这两种方法均不适合作为棉花抗黄萎病育种工作中的抗病性鉴定方法。随着黄萎病菌致病机理研究的不断深入，越来越多的研究表明，黄萎病菌毒素是导致棉花黄萎病发生的主要原因。本研究首先通过毒素抑制棉籽胚根伸长的实验验证了黄萎病菌毒素具有致萎活性；其次，通过叶片涂抹毒素法和毒素浸根法检测毒素对棉花的致萎度，结果表明，加埔¨M垃如c。642o；-^曲，I。墨巨v靼aoL 万方数据浙江大学硕士学位论文毒素鉴定棉花抗黄萎病性这两种方法均能简单、快速地鉴定出不同黄萎病菌的致病力差异，这与张慧霞等(2008)、肖松华等(2007)的研究结果一致。同时，本研究结果也表明了黄萎病菌毒素的确是导致棉花黄萎病发生的主要原因，章元寿等(1991)、殷剑美等(2007)、李颖章等(2000)、沙月霞等(2005)、桑茜等(2010)等也有相似的报道。但是叶片涂抹毒素法鉴定出的棉花抗性级别与温室盆钵接菌法不完全吻合，而毒素浸根法与温室盆钵接菌法鉴定出的棉花抗性级别完全吻合，这可能是因为黄萎病菌为土传病害，毒素浸根法是将棉苗根部浸于毒素液中，遵从黄萎病菌侵染特点，因此，鉴定结果较叶片涂抹毒素法更准确。毒素浸根法整个鉴定周期为20d左右，接菌均匀～致，是一种值得广泛推广应用的棉花抗黄萎病性鉴定方法。近年来，组织培养技术和转基因技术的应用越来越广泛。随着转基因技术在抗病性育种中的应用，对珍贵转基因材料的抗病性鉴定技术的需求也越来越高。第一代转基因种子往往较少，若通过传统的抗黄萎病性鉴定方法鉴定其抗病性，往往需要培养大量的棉苗，耗费种子；若将第一代转基因种子种植，繁殖第二代，则需要周期较长。为解决以上问题，本研究基于棉花组织培养技术探索了一种新的毒素鉴定方法。通过比较不同黄萎病菌毒素侵染过的棉花愈伤组织增重量、MDA、POD间的差异，鉴定不同黄萎病菌的致病力；比较同一毒素侵染过的不同棉系愈伤组织增重量、MDA、POD间的差异，鉴定不同棉种抗黄萎病性。通过组织培养技术，获得棉花愈伤组织后，只需不断继代，即可得到取之不尽的愈伤组织，用于鉴定不同黄萎病菌的致病力差异或者不同棉种的抗黄萎病性。这种鉴定技术也特别适用于某地区新品种引进时，鉴定此棉花品种对当地对不同黄萎病菌的抗性，从而确定这个品种是否适合在这个地区推广。基于组织培养技术的毒素方法的可行性研究为毒素在组织培养中的应用提供了理论依据，也为毒素代替抗生素用于转基因材料的筛选和鉴定、棉花抗黄萎病突变体的筛选等研究提出了可靠的研究途径。然而，本研究还未对黄萎病菌毒素在培养基上对棉花愈伤组织的致病力差异进行分级。在这方面，国内外也还没有一套完整的分级标准，致使很难以量化的形式将棉花对某一黄萎病菌毒素的抗性表示出来。因此，还不能准确判断培养基上的毒素鉴定法与温室盆钵接菌鉴定法鉴定出的棉花抗性级别是否完全吻合，这有待进一步的探索和研究。60 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