中华绒螯蟹（eriocheir sinensis）生殖相关基因的克隆及其表达模式研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论琴i论文题目广師日中华绒螯蟹�Eriocheirsinensis生殖相关基因的克隆及其表达模式研究研究生姓名王敏吴萍指导教师姓名苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教龍_学慨侧賴_材料。_翅研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：a期：苏州

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3、"论文作者签名：日期：2^1中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）生殖相关基因的克隆及其表达模式研究中文摘要摘要生殖细胞的发生是发育生物学研究的主要内容之一，同时也是一个复杂的发育调控并涉及时空的多基因活动过程。其中原始生殖细胞起源、迁徙、分化等方面的研究，是备受关注的生物学研究方向。与其他模式生物相比，十足目动物关于生殖发育的分子机制方面的研究相对薄弱。因此，鉴定和发现十足目生殖相关的基因并探索其功能，具有重要意义和潜在的应用价值。本文以中华绒螯蟹为研究对象，通过现有研究和相关文献的查阅，对与中华绒螯

4、蟹生殖发育有着密切联系的vasa、piwi、nanos、PL10基因进行研究。研究主要分为四个部分：1、中华绒螯蟹vasa基因的表达分析及表达模式研究vasa基因是生殖质的主要组成成分之一，且在生殖腺中特异性表达，常可作为示踪生殖腺形成的分子标记。本文采用实时荧光定量PCR技术对vasa基因在中华绒螯蟹胚胎及幼体发育阶段的表达情况进行了研究，研究发现，vasamRNA在胚胎发育时期表达量相对幼体发育阶段表达量要高，推测vasamRNA可能主要作用于胚胎发育阶段。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明，vasamRNA在精

5、母细胞中分布于染色质中，在精子细胞中主要分布于核杯，在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现，胚胎和幼体发育时期vasamRNA表达集中分布，可根据vasamRNA的分布初步推断中华绒螯蟹的性腺生成轨迹。2、中华绒螯蟹piwi基因克隆及表达研究Piwi基因在果蝇中有维持生殖干细胞和调节细胞分裂的功能，甲壳类中对此基因的研究非常少。本文采用SMARTTMRACE技术，克隆了piwi基因全长序列。piwi基因的cDNA全长3253bp（GenBank注册号：KR061909），5’UTR26bp，3’UTR179b

6、p，开放阅读框ORF2868bp，编码955个氨基酸。多序列比对和同源性分析表明中华绒螯蟹的piwi基因和三疣梭子蟹的piwi基因同源性为70%。跨模区分析表明PIWI蛋白为亲水性蛋白结构。通过实时荧光定量PCR分析表明，piwimRNA在血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺、肠、卵巢、精巢中均有表达。但是在性腺中的表达要明显高于其他各组织，随着精巢的发育变化，piwimRNA的表达量逐渐减少，在精母细胞时期表达量最高；同样在卵巢中piwimRNA也随着卵巢的发育而发生波动，在卵母细胞期表达量最高。在胚胎和幼体

7、发育阶段，大眼幼体期表达量最高。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明，piwimRNA在精母细胞中分布于染色质中，在精子细胞中主要分布于核杯中，在卵母细胞中定位于I中文摘要中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）生殖相关基因的克隆及其表达模式研究细胞质。整胚原位杂交发现，以piwimRNA阳性信号指示的生殖腺原基在心跳期已比较明显，溞状幼体I期时分布于头胸甲与腹部交接处，随着发育逐渐集中于头胸甲背部，至溞状幼体II期时已向头胸甲迁移，溞状幼体III期时更加集中，完全位于头胸甲的背面的一个区域。3、中华绒螯蟹na

8、nos基因克隆及表达研究nanosmRNA和vasamRNA是性腺的最初成分P颗粒中的2个最重要的组成成分。本文采用SMARTTMRACE技术，克隆了中华绒螯蟹nanos基因，nanos基因cDNA序列全长2886bp（GenBank注册号：KR061910），5’UTR59bp，3’UTR1543bp，开放阅读框ORF1284bp，编码427个氨基酸。跨膜区分析表明NA