暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpchi的克隆、表达及活性分析

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1、万方数据分类号：Q窆鱼鱼密级：公珏单位代码：!QQ墨鱼学号：2Q!QQ窆墨暗黑鳃金龟几丁质酶基因细劬z的克隆、表达及活性分析Genecloning、expressionandactivityanalysisofchitinasehpChifromHolotrichiaparallelaMotschulsky(Coleoptera：Scarabaeoidea)学位申请人：邹爽指导教师：郭巍教授学科专业：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年五月三十日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指

2、导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡塞些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：勾短签字日期：刃f年年乡月／日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解泣皇垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇堡垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数

3、据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书1学位敝储繇锻签字日期：矽／年年／月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：却象签字日期：力，々年<月I电话：邮编：万方数据摘要几丁质(chitin)是N．乙酰氨基葡萄糖的同聚物，在昆虫生长发育的各个时期，几丁质的含量和分布都需要相应发生变化。几丁质酶(chitinase)属水解酶类，能够将几丁质长链降解为寡聚物。昆虫几丁质酶存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中，表达水平随昆虫不同生长发育阶段而变化，对昆虫几丁质的代谢起

4、重要调控作用。为了得到鞘翅目特异性几丁质酶基因，本研究免疫筛选已构建的暗黑鳃金龟(HolotrichiaparallelaMotschulsky)中肠cDNA表达文库，得到暗黑鳃金龟几丁质酶基因，命名为hpChi，并对其特性进行分析。hpChi基因全长1591bp，开放读码框(ORF)1443bp，编码480个氨基酸，预测的分子量大小为51．4kDa，等电点(pI)为5．08。氨基酸序列分析显示其具有3个区域组成的多功能区结构，分别为N．端的酶活性催化区(catalyticdomain)，C．端富含半胱氨酸的几丁质结合区(chitin-bind

5、ingdomain，CBD)及富含丝氨酸和苏氨酸的连接区(Linker)。利用PDB网站对HpChi蛋白的结构进行预测，表明HpChi蛋白具有几丁质酶第18家族(Family18)典型的“(fJ／Q)8圆桶型结构”。利用NCBI网站和MEGA软件构建系统发育树，结果显示暗黑鳃金龟几丁质酶HpChi与近缘种的华北大黑鳃金龟亲缘关系最近，其次与直翅目东亚飞蝗(Locustamigratoriam册ilensis)和鞘翅目赤拟谷盗(THbo矗umcastaneum)亲缘关系较近，与鞘翅目昆虫黄粉虫(Tenebriomolitor)、墨松天牛(Mono

6、chamus口，f绷口觚)、辣根猿叶甲(PhaedoncDchle口riae)统属一大类，与膜翅目和鳞翅目昆虫亲缘关系较远。构建原核重组表达载体pET30a—hpChi，转化大肠杆菌BL21。诱导表达并优化表达条件，经SDS．PAGE电泳和WesternBlot分析，成功表达分子量51．4kDa的几丁质酶蛋白，与预测结果相符。将以包涵体形式存在的外源蛋白HpChi超声破碎后，通过Ni+-NTA树脂亲和层析纯化蛋白，并制备多克隆抗体。构建重组酵母表达载体pPICK9K．hpChi，转化缺陷性毕赤酵母GSl15，经抗性筛选、表型和分子鉴定表明重组酵

7、母GSll5(pPICK9K．hpChi)构建成功。但甲醇诱导表达后，WesternBlot检测未能成功表达目的蛋白。构建真核(重组杆状病毒)表达载体pFast．@chi，转化大肠杆菌DHl0Bac，利用其载体自带质粒转座将目的基因插入Bacmid杆状病毒进一步构建得到Bacmid．@chi。转染昆虫细胞(草地贪夜蛾细胞系sf9)，分别获得P1、P2、P3病毒，取上清进行WesternBlot检测，证明HpChi在昆虫细胞sf9中获得成功表达。以几丁质为底物通过DNS比色检测还原糖的原理测定细胞表达的几丁质酶的酶活，结果显示其有几丁质酶的活性并

8、且在微酸环境下活性较强。本研究通过对暗黑鳃金龟幼虫(蛴螬)几丁质酶生物信息学分析和活性测万方数据定，为深入了解鞘翅目昆虫几丁质酶生物学功能提供理论依据