温敏性可降解水凝胶缓释wisp-1基因的sirna技术在骨关节炎基因治疗中的研究

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1、—————————————————————温敏性可降解水凝胶缓释WISP-1基因的siRNA技术在骨关节炎基因治疗中的研究—————————————————————ControlledWISP-1siRNAdeliveryusingthermosensitivebiodegradablehydrogelinthetreatmentofosteoarthritis————————————作者姓名：宫宇宝专业名称：外科学研究方向：生物材料骨关节炎指导教师：刘建国教授学位类别：医学博士培养单位：白求恩第一医院论文答辩日期：2015年6月5日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委

2、员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位翁习生主任医师北京协和医院主席杨卫良教授哈尔滨医科大学第一医院郭卫教授北京大学人民医院委员陈学思教授长春应化所林剑浩教授北京大学人民医院陈立教授吉林大学基础医学院黎志宏教授中南大学湘雅二医院刘一教授吉林大学第一医院王莉莉副研究员中国医科大学谷贵山教授吉林大学第一医院中文摘要骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病，致残率高，危害大，发病机制目前尚不完全明确，没有特效的早期预防及治疗方法。最新的研究表明：WISP-1(Wnt-inducedsignalingprotein-1,WISP-1)作为一个Wn

3、t信号通路中的下游调控因子，在动物试验中证实与OA的发病机制有关，并具有很高的特异性，是理想的治疗靶点。本研究采用人骨关节炎滑膜细胞，使用RNAi（RNAinterference，RNAi）技术，特异性的抑制细胞内WISP-1的表达，从而达到治疗OA的目的。三嵌段温敏性聚合物（Poly(D,Lacticacid-co-glycolacid)-b-poly[ethyleneglycol]-b-Poly(D,Lacticacid-co-glycolacid)，PLGA-PEG-PLGA）是一种性质优良的基因缓释载体，装载shRNA质粒DNA后，在体温下保持长时间稳定降解及释放

4、，同时加入新型阳离子聚合物转染剂：星型聚谷氨酸苄酯聚合物（multi-armedpoly(L-glutamicacid)-graft-oligoethylenimine，MP-g-OEI），增加转染效率。将上述复合物作用于骨关节炎滑膜细胞，进行RNA干涉，观察疗效。从而证实WISP-1在骨关节炎发病机制中的作用，以及温敏性水凝胶复合物缓释基因的能力。为OA治疗开辟新道路。根据以上思路，首先制备三嵌段温敏性聚合物PLGA-PEG-PLGA。以乙交酯、丙交酯和聚乙二醇（1000）为单体，在辛酸亚锡催化下，通过开环聚合方法合成了三嵌段PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶，并对该

5、聚合物进行了全面、详细表征。三嵌段PLGA-PEG-PLGA聚合物在低温时可完全溶于水，而随着温度逐渐升高，PLGA-PEG-PLGA聚合物由于PLGA链的疏水作用而形成胶束。越来越多的胶束聚集通过PLGA链段间的疏水作用而完成凝胶转变。当温度继续升高时，PEG链段发生脱水作用，胶束间的疏水作用不断增强，导致体系发生凝胶-沉淀。通过动态流变学和试管导致法研究PLGA-PEG-PLGA聚合物溶液的凝胶转变过程。PLGA-PEG-PLGA具有适宜转变温度，在室温下呈液态，且粘度较小；体温时可转变为凝胶状态，局部稳定存在：适合作为可注射型植入生物材料。体内外PLGA-PEG-P

6、LGA温敏水凝胶降解实验表明水凝胶具有良好的可降解性。体外降解需要6周以上，而体内5周可完全降解。体I内降解加快，可能与体内环境有关，例如激活免疫应答，炎性因子、细胞增多有关。并且对周围组织无任何损伤，具有良好生物组织相容性。细胞毒性表明该聚合物具有良好细胞相容性。然后进行温敏性可降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA缓释WISP-1基因的RNAi技术在骨关节炎中的治疗作用的研究。首先研究PLGA-PEG-PLGA水凝胶包载质粒DNA的释放。此释放过程可分为3个阶段。第1个阶段：12小时早期爆发式释放；第二个阶段：持续释放期（12小时-3天）；第三个阶段：释放平台期（3天以

7、后）。质粒DNA释放机制，主要包括两种情况：早期爆发式释放，主要通过液体的弥散作用，另外随着水凝胶的降解出现释放的平台期。然后将三嵌段温敏性聚合物PLGA-PEG-PLGA携带MP-g-OEI/WISP-1-shRNA质粒，在体温下保持长时间稳定释放。将上述复合体在作用于人骨关节炎滑膜细胞，进行RNA干涉，观察疗效。结果发现无水凝胶对照组和实验组WISP-1表达量均逐步明显减少。并且随着时间的推移，实验组表现出良好的缓释作用，RNAi的效果明显高于对照组。另外，在抑制WISP-1基因的表达同时，还发现Wnt信号通路下游的MMP