《犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病（ⅰ型）三联活疫苗的研制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：１０２２５学号：Ｂ１５１３４学位＾丈＾犬痘热、细小病毒病、腺病毒病（Ｉ型）Ｈ联活疫苗的研制刘大飞指导教师姓名：华育平教授东北林业大学申请学位级别；博击学科专业：野生动植物保护与利用论文提交日期；２０１５年９月论文答辩日期：２０１５年口月授予学位单位；东北林业大学授予学位日期：－答辩委员会主席：论文评阅人；《如丈争 学校代码：１０２２５学号；Ｂ１５１３４学佐冷文犬痘热Ｉ型）、细小病毒病、腺病毒病（Ｈ联活疫苗的研制刘大飞指导教师姓名：华育平教授东北林业大学申请学位级别；博±学科专业：野生动植物保护与利用论文提交日期；２０１５年１２月：２０１５年９月论文答辩日期授予学位单位；东北林业大学授予学位曰期；答辩委员会主席；论文评阅人：《从抑采乂争 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｄｅ：１０２２５ＣＲｅｇｉｓｔｅｒＣｏｄｅ：Ｂ１５１３４ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＤｏｃｔｏｒＳｔｕｄｉｅｓｏｎｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓｃａｎｉｎｅｐ，ａｒｖｏｖｉｒｕｓａｎｄｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＩｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｐｖａｃｃｉｎｅＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＬｉｕＤａｆｅｉＳｕｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆ．ＨｕａＹｕｉｎｇｐｐＡｓｓｏｃｉａ化Ｓｕｅｒｖｉｓｏｒ：ｐＡｃａｄｅｍｉｃＤｅｇｒｅｅＡｐｐｌｉｅｄｆｏｒ：ＤｏｃｔｏｒＳｐｅｃｉａｌｉｔｙ：Ｗｉｌｄｌｉ佐ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄ山ｉｌｉｚａｔｉｏｎＤａｔｅｏｆＯｒａｌＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１５，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｏｒｔｈｅ犯ｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＾摘要犬痘热（Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒ，ＣＤ）、犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＣＰＶ）病及犬腺病毒（Ｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＣＡＶ）病是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损失惨重。犬痘热病毒（Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓ，ＣＤＶ）可Ｗ感染包括大熊猫ｐ、小熊猫Ｗ及狮、虎、豹等食肉目所有８个科、灵长目的挪猴属、偶蹄目猪科和鐘足目海豹科等多种动物。ＣＰＶ可引起犬出血、ＰＶ还可性肠炎与屯肌炎，此外，Ｃ引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。ＣＡＶ不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和沒能等动物中。疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施。当前，广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用，但是还时有疫情发生的报道。同时，目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品，其使用的疫苗株与我国优势流行株之间抗原差异显著。因此，研制适合国内流行毒株的疫苗己迫在眉睫。鉴于此，开展Ｗ下研巧：ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ的分离鉴定：将发病犬的病料组织等经过处理后，分别接种鸡胚成纤维细胞（Ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＥＦ）、ＣＲＦＫ及ＭＤＣＫ细胞进行传代培养一，并进行病毒形态学、ＰＣＲ及动物回归试验鉴定等系列鉴定。ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ的细胞培养物上清电镜观察分别可见典型的副黏病毒粒子、细小病毒粒子和腺病毒粒子。动物回归试验显示，Ｈ种分离株分别可导致犬出现明显的相应的临床症状。ＰＣ艮和一序列分析进步确定分离株分别为ＣＤＶ－、ＣＰＶ和ＣＡＶ的野毒株，并分别命名为£０￥ＹＢ－－、ＣＰＶＹＮ和ＣＡＶＨ。ＣＤＶ－、ＣＰＶ及ＣＡＶ的致弱研究：ＣＤＶＹＢ株分别经ＣＥＦ、Ｖｅｒｏ和ＣＥＦ细胞连续传７０－ＹＮ和ＣＡＶ－、２０和１５代，ＣＰＶＨ分别经ＣＲＦＫ和ＭＤＣＫ细胞连续传至１１０代，６５６７＇５病毒滴度逐渐提島并分别稳定在１〇ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ、１０ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ和１０ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ左右。并且王种病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐降低。动物回归试验结果进一－－－步表明成功获得致弱毒株，分别命名为ＣＤＶＹＢＲ、ＣＰＶＹＮＲ和ＣＡＶＨＲ。ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ致弱毒株的免疫原效力评价：分别将Ｈ种致弱毒株免疫犬，并用亲本强毒株进行攻毒保护试验，结果表明三种致弱毒株均可诱导犬产生理想的中和抗体，并对同源强毒株的攻击提供完全保护。ＣＤ－－、ＣＰＶ病及ＣＡＶ病（Ｉ型）＾联活疫苗研制；将致弱毒株ＣＤＶＹＢＲ、ＣＰＶＹＮＲ和ＣＡＶ－ＨＲ按照比例混匀，加入稳定剂制备Ｈ联弱毒疫苗，并对其开展免疫学评价。结果表明：Ｈ联活疫苗具有良好的安全性和免疫性原性。与相应单苗相比，二者在免疫效力方面无明显差异一。与同类商品化五联活疫苗相比，两者在安全性基本致；本一筹研究中兰联苗在免疫效力方面略胜；在病毒含量和免疫持续期方面均优于商品化疫苗；此外对怀孕母犬进行免疫具有绝对的安全优势。目前一一，国内应用的弱毒联苗部分是国外疫苗的复制品，另部分疫苗种毒直接来自于国外，送与国内目前流行的野毒株在基因水平和抗原性等生物学特性方面存在显著－１－ 摘要差异，而且，目前商晶化疫苗均不适合于怀孕母犬的免疫。而本研究Ｈ联弱毒苗的疫苗巧均来源于国内优势流行株经致弱而成，有独立知识产权，且制各的疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并对怀孕母犬绝对安全。该Ｈ联苗己申报新兽药批号，目前处于复核。试验阶段本研究填补了我国犬类国产疫苗的空白，为我国犬的重要病毒病的防控提供。了物质基础和技术储备，并将产生良好的经济效益和社会效益关键词犬癌热病毒；犬细小病毒；犬腺病毒＾分离鉴定；致弱；－－ＩＩ ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓＣＰＶｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＣＡＶｐ（ＣＤ），ｐ（）（）ｄｉｓｅａｓｅ，ａｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｔａｇｉｏｕｓａｎｄｆａｔａｌｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｄｏｇｓａｎｄｏ化ｅｒ化ｒｒｅｓｔｒｉａｌｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ．ＣＤｃａｎｉｎｆｅｃｔｉａｎｔａｎｄａａｎｄａｔｉｅｒｌｉｏｎｔｈｅｓｍａｌｌｌｅｏａｒｄａｎｄｏｔｈｅｒｃａｒｎｉｖｏｒａａｌｌ８ｆａｍｉｌｉｅｓｇｐ，ｐ，ｇ，，ｐ，ｒｔｉｏｄａｃｔｌａｉｆａｍｉｌｒｉｍａｔｅｃａｌｌｅｄｍｏｎｋｅＰｉｎｎｉｅｄｉａＰｈｏｃｉｄａｅｗｉｔｈｉ打ｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅｏｆｙｐｇｙ，ｐｙ，ｐ，〇〇！００／〇ａｎｄｔｈｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅｏｆ８０／〇．ＩｔｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｄｏｃｕｍｅＷｅｄｔｈａｔＣＤＶｃａｕｓｅｓｓｅｖｅｒｅｙｉｍｍｕｎｏｓｕｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｎｆｅｃｔｔ化ｍ．Ｍｉｏｎｉ打也ｅｃｅｎｒａｌ打ｅｒｖｏｕｓｓｓｉ打ｄｏｓｏｒｅｏｖｅｒｐｐｐｙｇ，ｔｈｅｈｏｓｔｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＣＤＶｉｓｇｒａｄｕａｌｌｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＴｈｅｙｈａｖｅｂｅｅ打ｃａｕｓｉｎｇｔｒｅｍｅｎｄｏｕｓｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓｔｏｔｈｅｃａｎｉｎｅｆａｒｍｉｎｇｆａｒｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｗｉｌｄｌｉｆｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎｄｕｓｔｒ，ｙｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｔｈｅｗｏｒｌｄ．ＣＰＶｉｓｒｅｓｐｏ打ｓ化ｌｅｆｏｒｃａｎｉｎｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓａ打ｄｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ．Ｃａｎｉ打ｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｏｃｃｕｒｓｂｏｔｈｉ打Ｃｈｉｎａａｎｄａｒｏｕｎｄｔｈｅｗｏｒｌｄａｍｏｎｇｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄｄｏｓｆｏｘｅｓｇ，ａｎｄｗｉ１ｌｄｆｏｘｂｅａｒｃｏｏ：ｅａｎｄｒａｃｃｏｏｎｓ．，，ｙＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｏｃｉｅｔｙ，ａｓｃｏｍｐａｎｉｏｎａｎｉｍａｌｓ，ｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｉｍａｌｓ，ａｎｄｓｐｅｃｉａｌｄｏｇ，ｄｏｇｓｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｈｕｍａｎｌｉｆｅ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｉｍｐｅｒａｔｉｖｅＵ）ｓｉｒｅ打ｇｔｈｅｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍａｉｎｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｄｏｇｓ．ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｉｓＣＯ打ｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅ化ｅｍｏｓｔｄｉｒｅｃｔａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅａｓｕｒｅｓｏｆｐｒｅｖｅｎｔｉｏ打ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ．．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｕｎｉｖａｌｅ打ｔａｎｄｐｏｌｙｖａｌｅ打ｔａｔｅｎｕａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄａｒｏｕｎｄｔｈｅｗｏｒｌｄ．ＡｌｔｈｏｕｇｈｗｉｄｅｓｒｅａｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａａｉｎｓｔＣＤＶＣＰＶａｎｄＣＡＶｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｄｕｃｔｅｄｆｏｒｍａｎｄｅｃａｄｅｓｐｇ，ｙ，ｓｅｖｅｒａｌｏｕｔｂｒｅａｋｓｉｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｎｉｍａｌｓｈａｖｅｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ．Ｂｅｓｉｄｅｓｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆｍａｔｅｒｎａｌａｎｔｉｂｏｄｏｔｈｅｒｖｉｒｕｓｅｓｖａｃｃｉ打ｅｏｔｅｎｃａｎｄｉｍｒｏｅｒｕｓｅｏｆｖａｃｃｉｎｅｓＷｈｅｔｈｅｒｙ，，ｐｙｐｐ，ｔｈｅｅａｔｏｎｔｔｔｔｏｖｅｒｆ．Ａｔｔｔｔｉｄｅｍｉｃｖｉｍｓｖｒｉａｉｓｒａｉｎｃａｕｓｅｄｂｈｅｕｒｅｎｎｅｅｄｉｙｈｅｓａｍｅｉｍｅｍｏｓｐｙｇ，ｏｆｔｈｅｓｅｖａｃｃｉｎｅｓｃｕｒｒｅｎｔｌｕｓｅｄｆｏｒｃｏｆｏｒｅｉｎｖａｃｃｉｎｅｖｉｒｕｓｓｅｅｄｔｈｅｂａｃｋｒｏｕｎｄｉｓｕｎｃｌｅａｒｙｐｙｇ，ｇａｎｄｉｎｃｅｌｌｐａｓｓａｇｅｎｕｍｂｅｒｍｏｒｅ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｌｙａｎｄｓａｆｅｔｙａｒｅｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｂｅｇｕａｒａｎｔｅｅｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｏｍｅ巧ｉｃｓｔｒａｉ打ｓｉｎｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｈａｓｂｅｅｎｉｍｍｉｎｅｎｔ．ＳＵｉｄｉｅｓｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｔｅ打ｕａｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｙｏｆＣＤＶ，ＣＰＶａｎｄＣＡＶ．ＡＣＤ乂ＣＰＶａｎｄＣＡＶｓｔｒａｉｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｗ伽ＣＥＦｃｅｌｌｓ，ＣＲＦＫｃｅｌｌｓａｎｄＭＤＣＫｃｅｌｌｓ＂ｉｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｖｉｒｕｓｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏ打ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄａｎｉｍａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｓｏｏｎ．ＡＣＤＶｓｔｒａｉｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｗｉｔｈＣＥＦｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｆｒｏｍａｎａｆｅｃ化ｄｄｏｇｗｉｔｈ化ｅｓｙｐ化ｍｓｏｆｆｅｖｅｒｄｉａｒｒｅａａｎｄｃｏｕｈｈｅｖｉｍｓｗａｓｃｏｎｆｉｍｅｄｂｅｌｅｃ杠ｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｅｉｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏ．Ｔｒ．Ｗｄｏｆ，ｇｙｐｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒ－ｉｐｔｉｏｎｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏ化ｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄｄｅ化ｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ打ｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓｎ耗ｃｔｅｄａｎｄｖａｃｃｉｎａｔｅｄａ打ｉｍａｌｓａｎｄｅｘｔａｌｐｉｐｅｒｉｍｅｎ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌｓａｗｉｌｄＣＯＹｓｔｒａｉ打ｗａｓＣＯ打ｆｉｒｍｅｄ．Ｔｈｅｖｉｒｕｓｗａｓｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ过ｓＣＤＶＹＢ．，６５ｅｖｉｍｓｔｉ化ｒｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｒａｄｕａｌｔｏｌＴＩｅａｎｗｈｉｌｅ－Ｔｈｌ〇ＣＤｓｍＬｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＣＤＶｇｙｏ／．Ｍ，ｄｅｒａｄｅｄｒａｄｕａｌｌｄｅｓｉｎａｔｅｄ过ｓ－ＹＢ艮ＴｈｅｅｓｕｔｏｆＹＢＣＤＶｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｔｔｔｇｇｙ．ｒｌｉｎｄｉｃａｅｄｈａ，ｇｙ－ａｄｏｏｄＣＤＶＹＢ民ｈｇｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｏｕｌｄｒｏｖｉｄｅｄｏｇｓｓｔｒｏｎｇｒｏ１；ｅｃｔｉｏｎｔｏｒｅｓｉｓｔｐｐ－ｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｏｆｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｖｉｒｕｌｅｎｔＣＤＶＹＢｓｔｒａｉｎ．－－Ｉｌｌ ＡｂｓｔｒａｃｔＡｗｉｌｄＣＰＶｓｔｒａｉ打ｗａｓｃｏｎ打ｒｍｅｄｗｉｔｈｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌｓ．Ｔｈｅｖｐｉｒｕｓｗａｓ６－－ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＣＰＶＹＮ．ＴｈｅＣＰＶＹＮｖｉｒｕｓｌｉｔｅｒｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ化ｌ〇ＴＣＩＤ／ｍＬ５〇－ａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆ１．ｔｅＰＶＹＮＣＲＦＫｃｅｌｌｆｂｒ１０ａｓｓａｅｓＭｅａｎｗｈｉｌｅｈｅｖｉｒｕｌｅ打ｃｏｆＣｄｅｒａｄｅｄｐｇ，ｇ－－ｒａｄｕａｌｌｄｅｓｉ打ａｔｅｄａｓＣＰＶＹＮＲ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣＰＶＹＮ民ｇｙ，ｇｙ＊ｈａｄｇｏｏｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｏｕｌｄｒｏｖｉｄｅｄｏｇｓｓｔｒｏｎｇｐｒｏｔ；ｅｃｔｉｏ打ｔｏｉｅｓｉｓｔｔｉｉｅｐ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅｏｆｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｖｉｒｕｌｅｎｔＣＰＶＹＮｓｔｒａｉｎ．ＡＣＡＶｓｔｒａｉｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｗｉ化ＭＤＣＫｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｆｒｏｍａｎａｆｅｃｔｅｄｄｏｇｗｉｔｈｔｈｅｓｙｐｔｏｍｓ＂，，ｏｆｆｅｖｅｒａｎｄＢｅｅｅｖｓｓｔＡＶ－－Ｈｖｉｌｕｙｅｓ．ＴｈｉｍｓｗａｄｅｉｇｎａｅｄａｓＣＨ．ＴｈｅＣＡＶｒｕｓｔＵｅｒｗａｓ７５ｌ〇ＩＤｅｏｆ１１０ｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ化ＴＣｓｏ／ｍＬａｆｔｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎＭＤＣＫｃｅｌｌｆｏｒｐａｓｓａｇｅｓ．ＡＶ－ｓＡＶ－ＭｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＣＨｄｅｒａｄｅｄｒａｄｕａｌｌｄｅｉｎａｔｅｄａｓＣＨ民．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆ，ｇｇｙ，ｇｔｔ－ｔｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｙｉｎｄｉｃａｅｄ化ａＣＡＶＨ民ｈａｄｏｏｄｉｍｍｕｎｏｌｏｉｃａｌａｃｉｖｉｔａｎｄｃｏｕｌｄｒｏｖｉｄｅｇｇｙｐｔｒＡＶ－ｄｏｓｓｏｎｒｏ１ｔｏｎｔｏｔｏｓｔＨｔｇｇｐ：ｅｃｉｒｅｓｉｓｔｈｅｃｈａｌｌｅ打ｇｅｆｈｏｍｏｌｏｇｏｕｖｉｒｕｌｅｎＣｓｒａｉｎ．ｔｕｅｓｏｎＤＶ－－ＣＡＶｃｏｍｂ－－ＳｄｉＣＣＰＶｉｎｅｄｌｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ：化ｅｅ质ｃａｃｙｏｆ化ｅＣＤＶＣＰＶＣＡＶａｔｅ打ｕａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｒｅａｒｅｄｂｍｉｘｏｆｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｅｓｉ打ｆｅｃ１；ｅｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｕｅｒｎａｔａｎｔａｎｄｐｐｙｐｓｔａｂｉｌｉｚｅｒａｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｐｏｒｔｉｏｎｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙａｎｉｍａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｏｏｄｓａｆｅｔａｎｄｉｍｍｕ打ｉｔ．Ｆｉｒｓｔｌｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｎｅｈａｓｇｙｙｙ，ｉｓｉｍｉｌａｒｉｍｍｕｎｏｌｏｉｃａｌｅｆｉｃａｃａｓｔｈｅｍｏ打ｏｖａｌｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｅｃｏｎｄｌｉｔｗａｓｍｏｒｅｅｆｉｃｉｅｎｔｙ，ｇ；ｙ－ｍｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄｃａｎｉ打ｅ５ｉｘｅｄｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅｄｏｓｅｏｆｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎａｎｄｓａｆｅｔｙ－ｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉ打ｅａｒｅｓｕｅｒｉｏｒｔｏｔｈｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ５ｍｉｘｅｄｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｓｔｏｆｔ：ｈｅｐｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｓｎｏｔｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｈｅｐｒｅｎａｎｔｄｏｇｓｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｎｇ，，ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｉｍｍｉｍｉ之ｅｔｈｅｐｒｅｇｎａｎｔｄｏｇｓｓａｆｅｌｙ．Ａｓｓｏｍｅｏｆｔｈｅｖａｃｃｉ打ｅｓ０打ｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃｍａｒｋｅｔａｒｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄｗｉｔｈｓｅｅｄｖｉｒｕｓｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｉｍｏｒｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｓｔｒａｉｎｓｏｒｐｓｏａｔｅｄｏｍｆｏｒｅｉｎｃｏｕｎｔｒｉｅｓｔｈｅｖａｅｎｅｓａｎｄａｎｔｅｎｉｃｔａｒｅｓｎｉｆｉｃａｎｔｅｒｅｎｔｒｏｍｉｌｆｒｇ，ｋｌｇｉｇｉｙｉｇｌｙｄｉｆｆｔｈｅｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｅｅｄｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｌｉ打ｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｄａｎａｓ打ｏｍｒｅｖａｌｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｈｅｃｏｍｌｅｔｅｌｉｔｅｅｃｔｕａｌｔｔｅｉｍｌａｎｄｃｌｏｎｅｄｐ．Ｔｐｙｎｌｌｐｒｏｐｅｒｙ行１１ｈｇａｐｏｆｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃｃａｎｉｎｅｖａｃｃｉ打ｅｓ．Ｎｏｗｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｉｓｄｅｃｌａｒｉ打ａＣｈａｉ打，ｙｇＶｅ１ｔＬ．Ｔｔｔｈｔｔｔ：ｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｓｉｃｅｎｓｅｈｉｓｓｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓｅｉｍｐｏｒａｎｍａｅｒｉａｌｂａｓｉｓａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｒｅｓｅｒｖｅｓｆｏｒｔｒｅｖｅｎｔｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｏｆｖｉｒａｌｄｓｅａｓｅｏｆｔｈｅｓｉｎｈｉｎａａｎｄｌｈｅｐｉｌｉｄｏｇＣ，ｗｈｉｃｈｗｉｌｌｒｏｄｕｃｅｏｏｄｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｓｏｃｉａｌｂｅｎｅｆｉｔｓ．ｐｇＫｅｗｏｒｄｓＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓＣａｎｉｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＣａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｙ；；；ｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｔｅｎｕａｔｉｏｎ；－Ｖ－Ｉ 目录目录摘要ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｌｌ１绪论１１．１引胃１１．２ＣＤ概况２１．２．１ＣＤＶ２的基本结构和特征１．２．２ＣＤ的防控３１．３ＣＰＶ概况７１．３．１ＣＰＶ的基本结构和特征７１．３．２ＣＰＶ病的防控８．况１４ＣＡＶ概９１．４１９．ＣＡＶ的基本结构和特征１．４．２ＣＡＶ病的防控１０１．５１１本研巧的目的和意义２ＣＤＶＶ和ＣＡＶ－Ｉ、ＣＰ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究１２２．１实验材料与２实验仪器１２丄１实验样品１２２丄２实验试剂１２２．１．３实验仪器１３２．２实验方法１３２．２１３．１病毒分离２２１４．．２病毒鉴定２．２．３病毒致弱与免疫效力研究１５２．３实验结果１８２．３．１病毒分离结果１８２．３．２病毒鉴定结果８１２．３．３病毒致弱及免疫效力研究结果２２２．４職２７－３ＣＤ、ＣＰＶ巧和ＣＡＶＩ病Ｈ联弱巧巧苗制备３１３１．实验材料与实验仪器３１３．１．１病毒和疫苗３１３．１２．实验动物３１．１３１．３实验试剂３－Ｖ－ 目录３１４．．实验仪器３１３．２实验方法３１３２１－Ｈ种病毒与稳定剂配比的研究．．ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ３１３．２．２Ｈ联活疫苗安全性研究３２３２３Ｈ联．．活疫苗对怀孕母犬的安全性研巧３２３．２．４三联活疫苗最小免疫剂量研巧３２３．２．５Ｈ联活疫苗免疫持续期研巧３３３２６Ｈ．．联活疫苗与各单苗的免疫效力比较３３３．２．７Ｈ联活疫苗与同类商品苗的比较研究３３３３．实验结果３４－３．３．１ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩＨ种病毒与稳定剂配比的研究结果３４３３２Ｈ．．联活疫苗安全性研究结果３４３３３兰．．联活疫苗怀孕母犬的安全性研究结果３５３３４Ｈ联．．活疫苗最小免疫剂量研巧结果３７３．３．５兰联活疫苗免疫持续期研巧结果３９３．３．６Ｈ联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果４０３．３．７王联活疫苗与市场销售的同类商品苗的比较研巧结果４７３．４Ｗ论４９结论５２参考文献５２攻读学＾＾＾间发巧的学术论女６４致谢６６－Ｖ－Ｉ ＥｎｌｉｓｈＣａｔａｌｏｇｇＥｎｇｌｉｓｈＣａ化ｌｏｇＣｈｉｎｅｓｅＡｂｓｔｒａｃｔＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｌｌ１Ｐｒｅｆａｃｅ１１．１Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ１１ｏｆ．２ＳｕｍｍａｒｙＣＤ２１２．１ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＣＤＶ２．１．２．２ＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＤｉａｏｓｉｓｏｆｇ打ＣＤ３１．３ＳｕｍｍａｒｙｏｆＣＰＶｄｉｓｅａｓｅ７１．．ｔｒｔｔｅｒｔＰＶ７３１ＳｕｃｕｒｅａｎｄｃｈａｒａｃｉｓｉｃｓｏｆＣ１．３．２ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＣＰＶｄｉｓｅａｓｅ８．ｓｅａｓｅ１４ＳｕｍｍａｒｙｏｆＣＡＶｄｉ９１．４．１Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｓｔｉｃｓｏｆ９ｉＣＡＶ１．４．２Ｃｏ打ｔｒｏｌｏｆＣＡＶｄｉｓｅａｓｅ１０１．ｏｓｅａｎｄｎｃａｎｃｅｏｆｔｅｒｅｓｅａｒｃｈ５Ｐｕｒｐｓｉｇｉｆｉｈ１１２ｏａ－ＩｓｌｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｏｆＣＤＶ，ＣＰＶａｎｄＣＡＶＩｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｓ１２ｉｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙ２．１Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ１２２．１．１Ｓａｍｐｌｅｓ１２２．１．２Ｒｅａｇｅｎｔｓ１２２．１．３Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ１３２．２Ｍｅ１：ｈｏｄｓ１３２．ｏａｔｏ打ａｎｄｄｅｎｔｉｆｉｃａｏｎｏｆＣＤＶａｎｄＣＡＶ１３．２１ＩｓｌｉＩｔｉＣＰＶ，２．２ｔａｔｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｏｎｏｆＣＤＶＣ４．２ＩｄｅｎｉｆｉｃｉｉＣＰＶａｎｄＡＶ１，－Ａｔｅｎｕａｔｉｏｎｏｆ．．１５２．２ＣＤＶＣＰＶａｎｄＣＡＶＩｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃ．．．３，ｙ２．３民ｅｓｕｔｌｓ１８２．３．１Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｓｏｌａｔｉｏ打１８２．３ｔｔ．２Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｄｅｎｉｆｉｃａｉｏｎ１８．．ｔｔｔｔｔｓ２２２３３民ｅｓｕｌｓｏｆａｅ打ｕａｉｏ打ａｎｄｅｖａｌｕａｉｏ打ｏｆｉｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｙ２．４Ｄｓｃｕｓｓｉｏｎ２７ｉｔｔ－－３Ｐｒｅａｒａｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｉｏｎｏｆ．．１ｐｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＣＤＶＣＰＶＣＡＶｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅ３３．１ｓａｉｎｅ打ｔｓＭａｔｅｒｉａｌｎｄｉｎ巧ｍ３１３．１．１Ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ３１３．１．２Ｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｉｍａｌｓｐ３１－Ｖ化 ＥｎｌｉｓｈＣａｔａｌｏｇｇ３．１．３Ｒｅａｇｅｎｔｓ３１３１４ｎｓｔｒｕｍｅｎ３１．．Ｉｔｓ３，２Ｍｅｔｈｏｄｓ３１３２１ｅｒｅｎａｉｏｏｆＣＤＶＣＰＶＣＡＶｍｉｘｅｄｗｉｔｈｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ３１．．Ｄｉｆｔｒｔ，，ｔ３．２．２Ｓａｆｅｔｙｖａｌｕａｉｏｎｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｄｏｓ３２ｇ３２３Ｓａｆｅｅｖａｌｕａｉｏｎｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｒｅｎａｎｔｄｏｓ３２．．ｔｙｔｐｇｇ３．２．４Ｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｏｓｅｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｒｅｎａｎｔｄｏ３２ｇｓｐｇ３．２．５Ｉｍｍｕｎｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｄｏｇｓ３３３．２．６Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｙｂｅｔｗｅｅ打ｓｉｎｇａｌａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅ３３３２７Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｂｅｗｅｅｎｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅ．．ｐｙｔ３３３３Ｒｅｓｕｌ３４．ｔｓ３．３．１ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｏｆＣＤＶＣＰＶＣＡＶｍｉｘｅｄｗｉｔｈｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ３４，，３３２Ｒｅｓｕｌｏｆｓａｆｅｔｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｄｏｓ３４．．ｔｓｙｇ３．３．３Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓａｆｅｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｐｒｅｇｎａｎｔｄｏｇｓ３５３．３．４Ｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｍｍｉｍｉｉｍｄｏｓｅｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｒｅｎａｎｔｄｏｓ３７ｐｇｇ３．３．５Ｒｅｓｕｌｔｏｆｉｍｍｕｎｅｄｕｒａｔｉｏｎｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｔｏｄｏ３９ｏｇｓ３．３．６Ｒｅｓｕｌｔｏｆｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｂｅｔｗｅｅｎｓｉｎｇａｌａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅ４０３３．７Ｒｅｓｕｌｔｏｆｉｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｂｅｔｗｅｅｎｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅ．．．．．４７．ｙ３．４Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ４９Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ５２Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ５３ＰａｅｒｓｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｅｒｉｏｄｏｆＰｈ．Ｄ．ｅｄｕｃａｔｉｏｎ６４ｐｐｐＡｃｋｎｏｗｌｅｄｍｅｎｔ６６ｇ－ＶＩ化 １绪论１绪论１．１引言犬痘热（ＣＤ，Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｍｅｐｅｒ）、犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＣＰＶ）病及犬腺病毒（Ｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＣＡＶ）病是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。经常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损失慘重。犬痘热病毒（Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｍｓ，ＣＤＶ）可Ｍ染包括大熊猫、小熊猫削师、虎和豹等食肉目所有８ＷＷ个科、偶蹄目猪科、灵长目的縣猴属和罐足目海豹科等多种动物，发病率可达、１００％，病死率达８０％。ＣＰＶ可引起犬出血性肠炎与屯肌炎，此外，ＣＰＶ还可引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。ＣＡＶ不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐，而且广泛地流行于野生的狐中、熊、郊狼和窺熊等动物中。随着环境和人类生活饮食方式的改变，野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密一切，，因此増加了人类感染动物源性疾病的潜在风险。犬是人类重要的伴侣动物之与人类朝夕相伴，因此，加强对犬主要疾病的防控是当务之急。疫苗免疫被认为是犬病防Ｗ控的最直接有效措施。我国宠物产业市场目前正呈现快速发展的良好势头，２００４年底，我国家养宠物达８０００万只，其中Ｗ北京、上海等大城市的宠物市场最大。目前我国北京、上海、广州、重庆和武汉已并列成为五大宠物城市。其中，北京登记注册的宠物狗大概有５０万只，上海为７０多万只，而大城市中，给宠物登记上户的比例占３０％左右，因此计算出来北京拥有的宠物狗就在１００万只Ｗ上，而且还在不断增加，因而疫苗的市场需求将非常巨大，应用前景十分广阔。３０％－８０％对于毛皮动物，，ＣＤ感染可导致貂、狐狸等的病死率达雪貂高达Ｗ１００％。我国毛皮动物的养殖主要集中在山东、河北、江宁和黑龙江等地，养殖的动物品种主要有水貂（标准貂和彩貂）、絡（乌苏里亚种）、狐狸、懒兔等。８０年代初全国水貂存栏量己逾１０００万只。目前，我国狐狸的饲养量达１０００万只，水貂７００万只，骆２００１００万只，年产水貂皮６００万张、狐狸皮万张，其中狐狸皮占世界总产量３５％，水＾貂皮占世界总产量的１２％。对于野生动物，目００，，如大熊猫前全世界致生不足１６只其安全也越来越受到威胁。２００７年，国内首次出现ＣＤ临床感染报道。２０１４年９月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中也，接连出现４只大熊猫感染ＣＤ死ｔ。其他野生动物，如如恒河猴、食－蟹猴、东北虎等，１９８４年２００９年先后从我国上海、桂林、哈尔滨、郑州、长春和北京等地的虎、狮、果子狸和猴等动物体分内离获得病毒，经鉴定除果子狸源病毒为犬细小病毒，。虎和狮源病毒为细小病毒，猴源病毒为变异细小病毒近年来也屡有ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ临床感染的报道。这些报道在引起人们痛惜之余，也给野生额危保护动物防控敲响警钟。当前，广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积ｉｗｓｆｉ极作用，但是还时有疫情发生的报道。除去母源抗体和其它病毒干扰、疫苗效价及－－１ 东北林业大学博±学位论文使用不当外等原因外，疫情是否由病毒变异株出现引起亟需验证。同时，目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品，毒种背景不清レ义及在细胞上传代次数较多，免疫原性和安全性均难Ｗ得到保证。因此，研制适合国内流行毒株的疫苗己迫在眉睫。１．２ＣＤ概况一ＣＤ是种犬类等动物的急性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可呈慢性持续性感染，临诊Ｗ双相热型、黏膜卡他、中枢神经症状及足垫肿胀为主要恃征自被发现Ｗ来ＣＤ几乎呈世界性分布，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业一和野生动物保护业危害最大的疾病之，经常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损Ｐ＂３鸣及狮失惨重近年来，包括大熊猫、小熊猫、虎和豹等食肉目所有８个科、偶蹄目猪科、灵长目的赫猴属和錯足目海豹科等多种动物均有ＣＤ自然发病的报道，甚至有人感染ＣＤＶ的报道随着病毒的变异和适应性的増强，其自然感染的宿主范ｎｔｉ围呈现不断扩大的趋势，其危害也越来越大。１．２．１ＣＤＶ的基本结构和特征＊ＣＤＶ属于副黏病毒科（化，副黏病毒亚科（／ａｒａ／ｗ＞５￡：ｏｖｚ＞７＞ｊａｅ），麻’疹病毒属心如ｒＷＷｗｍｙ）。该属的成员除与其亲源关系最近的麻疹病毒（Ｍｅａｓｌｅｖｉｒｕｓ，ＭＶ）夕ｈ还包括牛痘病毒（艮ｉｎｄｅｒｐｅｓｔｖｉｒｕｓ，ＲＰＶ）、小反当兽疫病毒、海詢盧热ＰＳ１病毒和海豚痘热病毒。ＣＤＶ为有囊膜的单股、负链、不分节段的ＲＮＡ病毒，主要编码核衣壳蛋白（Ｎ）、憐蛋白（Ｐ）、基质膜蛋白（Ｍ）、融合蛋白（Ｆ）、血凝蛋白一Ｈ－（）和大蛋白（Ｌ）６个结构蛋白，见图１１。目前公认ＣＤＶ只有个血清型，但是由于Ｈ蛋白容易发生抗原漂移，其变异率在所有结构蛋白中最高，所Ｗ根据Ｈ基一因氨基酸序列同源性高于９５％的毒株可归为同基因型的原则，可将ＣＤＶ分为亚洲Ｉａ－Ｉ－型（Ａｓｉ）、亚洲ＩＩ型（ＡｓｉａＩＩ）、欧洲型（Ｅｕｒｏｐｅ）、美国型（ＵＳＡ或３４Ａｍ［］ｅｒｉｃａ）、北极型（Ａｒｃｔｉｃ）和疫苗型（Ｖａｃｃｉｎｅ或ＯｌｄＣＤＶｓ）６个不同基因型。ＮＰＭＦＨＬＨ＇＂■：＜Ｅ＇ｌｊ｝，非结构臺白＾Ｉ兩ＩＩＩｉｉｊ義双分子病毒勝蛋測溫白－图１１ＣＤＶ病毒模式（Ｓ．２图ｉｐｓｅｔａｌ００７）ＦｕＫ－１１ｃｈｅｍａｔｃａｒａｍｆＤＶｉｇＳｉｄｉｇｏＣ－２－ １绪论ＰｓｉＦ蛋白ＷＦＯ形式被合成，经信号化酶水解掉，形成ＦＩ和Ｆ２亚单位，两个单体断ＰＷ二裂后通过硫键相连，形成特异性族蛋白酶切位点。ＣＤＶ野毒株与疫苗株Ｆ蛋白的核巧酸同源性为９０％－９３％，编码后蛋白同源性在９７％Ｗ上一Ｆ蛋白介导细胞膜与病毒囊膜的融合过程，个强的疏水区在Ｆ１多肤的Ｎ端暴露，其保守性高，主要功能为与细胞膜作用后诱导囊膜与细胞膜融合，该区域称。因此为融合多狀。该序列在麻疹病毒属中是相当保守的，所Ｗ在解释同属间出现的交叉保护ＰＷ现象可能与此序列有关。Ｆ蛋白上存在着两个辅助性Ｔ淋己细胞表位，位点在Ｆ１与一一Ｆ２断裂位点附近，个位于Ｆ２片段的末端，另个存在于Ｎ的Ｎ端，该位点可能是Ｐ９１犬抗原提呈细胞最先识别并提成的，但麻疹病毒的Ｆ蛋白上不存在。Ｈ蛋白是ＣＤＶ表面典型的ＩＩ型糖蛋白，是构成囊膜纤突的重要组成部分。同其他一一－麻疹病毒属的病毒样，Ｈ蛋白在Ｎ端跨膜区还有个３５５５氨基酸残基的疏水区，而该区既是跨膜所必须的信号狀序列又是Ｈ蛋白的错定位点，其在病毒的感染过程中起着ｔｗｉ重要的作用。首先，病毒通过Ｈ蛋白识别细胞表面受体，开始病毒的感染过程，所蛋白决定了ＣＤＶ的组织嗜性和宿主特异性。同时，在Ｆ蛋白的协助下，ＣＤＶＷ病毒囊膜与宿主细胞膜发生膜融合后进入宿主细胞。ＶｏｎＭｅｓｓｉｎｇ等证实，毒株与宿主细胞融合的能力主要取决于Ｈ蛋白，而与Ｆ蛋白无关。Ｈ蛋白也具有诱导动物机体产生ｔｗ中和抗体的功能，因此在抵抗ＣＤＶ感染过程中也起着非常重要的作用，Ｈ蛋白的单４２ｆ３抗对试验小鼠的保护力要高于抗Ｆ蛋白的单抗。Ｎ蛋白是病毒结构蛋白中含量最多的。Ｎ蛋白可分为Ｎ末端的可变区、Ｃ末端的可３变区和中间的高度保守区Ｓ个区［４Ｌ在病毒的，中间保守区在结构和功能上有重要作用整个复制过程中起着重要的调控作用，同时对内部基因起着包裹和保护作用，并使得中ｆＷ一Ｎ２－１２８９枢神经持续感染。蛋白也是ＣＴＬ活性的主要範蛋白之，其８位氨基酸能诱发ＭＨＣＩ类抗原限制性ＣＴＬ反应尤其是当Ｈ和Ｆ蛋白的特异性抗体低于检测水ｔＷ，平时，Ｎ蛋白特异抗体仍可被检测出在免疫接种病毒她后，抗体即可检测到。，保守性最高。在病毒的装配过程中Ｍ蛋白在整个基因组含量最少，起着蛋白与病’毒本身ＲＮＡ结合的调节作用研究证明Ｍ蛋白的３非编码区与其病毒的毒力和病程相关。ＰｔＷ蛋白对蛋白水解作用非常敏感，因此研巧其分子量也存在差异。且不同地域与不同种属之间存在明显差异。这可能是由于ＣＤＶ的ＲＮＡ聚合酶活性的抗原选择性造成，因此在遗传演化上该基因也是特别值得关注，尤其在跨种间传播的机制中。一Ｌ蛋白分子量约为＂２４６ｋＤａ。ＣＤＶ大蛋白是副黏病毒科中最小的比麻疹病毒少２２个氨基酸。在整个病毒的起始与延伸、核糖核巧酸多聚化的终止，ｍＲＮＡ转录时加帽和ｐｏｌｙ（Ａ）尾及可能的憐蛋白特异憐酸化等过程中发挥重要作用１．２．２ＣＤ的防控１．２．２．１灭活疫苗１９２３年，Ｐｕｎｔｏｎｉ首次用ＣＤＶ感染犬的脑组织的制备灭活疫苗，该疫苗接种中和抗ＰＤ２０１体滴度较低（小于１：）的犬后，似乎可Ｗ抵抗强毒攻击。之后研究者用不同的方法制备ＣＤ灭活苗Ｍｏｎｉａｌｉ等制备制过了带赋形剂的灭活疫化通过接种小熊猫进－３－ 东北林业大学博±学位论文．行免疫学评价。结果显示，该疫苗对小熊猫所产生的保护性抗体的滴度非常低，而且免２－３疫保护期短次国产的灭活疫苗主要是单价苗，国内部，每年必须进行加强免疫分动物园使用该苗免疫接种大熊猫和小熊猫，也未出现，多年来未出现临床感染的病例疫苗的安全性问题夏咸柱等用高压灭活的方法对ＣＤＶ进行灭活，并加入蜂胶佐剂制备的ＣＤ高压灭活疫苗，安全、可靠，其诱导试验犬所产生的中和抗体的能力明显５６１高于该病毒的福尔马林灭活疫苗，临床应用证明该疫苗对犬的保护力这８９％１一些缺陷灭活疫苗存在着，（１）制造成本高（２）病毒未能完全灭活或灭活不当造成疾病传播的可能（３）病毒灭，；活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱而不能产生足够的保护水平，导致其免疫有效保护期短，需要进行反复加强免疫（４）免疫不；能产生细胞内源性蛋白，也就不能诱导ＣＴＬ免疫效应。鉴于此，弱毒疫苗得到广泛应削用。１２２．２．．弱毒疫苗弱毒疫苗具有免疫力强、免疫期持续期长等优点。目前主要使用的弱毒疫苗株包括Ｏｎｄｅｒｓｅｏｏｒｔ株、Ｂｕｓｓｅｌｌ株、Ｃｏｎｖａｃ株和Ｒｏｃｋｂｏｍ株等，活的弱毒疫苗可Ｗ引起体液ｐ一般认为犬的中和抗体滴度在和细胞免疫反应，１：９６Ｗ上者均能完全保护其不受ＣＤＶｗ’ｓｗｔ攻击。我国目前用于预防ＣＤ的疫苗有单价苗、Ｈ联苗、五联苗、六联苗和韦联苗，但其能诱导机体产生免疫抑制弱毒疫苗在ＣＤ的防控上效果显著，对某些免疫缺陷幼一犬和野生食肉动物，存在不安全性和疫苗变异引发散毒的危险；并且在定程度上损害ｗ’Ｗｔ中枢神经系统，引发接种后脑炎等。存在大量免疫弱毒疫苗失败的事实，许多国家１）２都出现过免疫群体暴发ＣＤ的报道。究其原因：（弱毒疫苗具有热不稳定性。（）母６５＇６８ｔ＾源抗体的干扰。（３）经五六十年来种内和种间传播、基因突变和病毒对流行环境相适应表现出的地域性差异，目前流行的野毒株与弱毒疫苗株在核昔酸及氨基酸水平、病毒抗原性等生物学特性方面存在严重差异。（４）弱毒疫苗可能存在毒力不稳定现象。如果毒株不纯，混有强毒力的病毒粒子，或者弱毒株通过突变与野生毒株发生重组而致病力増强，也可导致免疫失败甚至疫病的流行。１．２．２．３亚单位疫苗１９８６年，Ｎｏｒｒｂｙ等用纯化的ＣＤＶ的Ｈ蛋白和Ｆ蛋白作为抗原进行免疫接种犬，除使用Ｈ蛋白免疫犬个别出现轻微症状外，其他均能产生对致死量强毒攻击的良好保护６９［１，。１９８８年Ｖｉｒｉｅｓ等将ＣＤＶ的Ｈ蛋白和Ｆ蛋白与免疫刺激物皂角糖巧混合制备疫苗，，，免疫犬后，均可诱导犬体产生较高的中和抗体滴度鼻内接种致死量强毒后免疫ＰＷ犬均未发病。Ｎｏｒｒｂｙ等用纯化ＣＤＶ的Ｈ和Ｆ蛋白接种犬后用ＣＤＶ野毒进行攻击，免疫组犬在攻毒后体液免疫和细胞免疫水平显著提高，对野毒攻击具有很好的抵抗力；Ｐ１１而对照组中３只犬表现出典型的ＣＤ临床症状，其中２只最终死亡。１２４．．２．核酸疫苗ＤＶＨＶＩＶＩ－１９９８年，Ｓｉｘｔ等将Ｃ和Ｆ基因分别插入真核表达载体ｐＪ中，构建ｐＪ－Ｌ化ＣＤＶＨ和ｐＶＩＪＣＤＶＦ重组质粒，经转染鼠细胞验证表达后，免疫接种犬进行评价：。结果显示所有免疫犬在第二次免疫后有较低的中和抗体水平，第王次免疫后中和抗体水平略有上升，攻毒后中和抗体达到最高值１：２５６，２只非免疫犬在整个实验期，－４－ １绪论甚至攻毒后未能检测到中和抗体。采用致死剂量的神经毒性ＣＤＶ毒株攻击时均能得到Ｐ２１保护。２０００年，Ｃｈｅｒｐｉｌｌｏｄ等将ＣＤＶ强毒株Ａ７５／１７株的Ｆ、Ｈ和Ｎ基因克隆至ｐＣＩ载－－Ｎ、－体，构建ｐＣＩｐＣＩＦ和ｐＣＩＨ质粒。３种质粒混合免疫Ｂａｌｂ／ｃ鼠，免疫４次后鼠血清中可检测出抗Ｆ、Ｈ和Ｎ的ＥＬＩＳＡ抗体和中和抗体，中和抗体效价分别为１：６４和１：１６。３种质粒混合后免疫ＳＰＦ比格犬，Ｈ免后抗体滴度迅速升高，攻毒后达到峰值１：２５６，而对照组未能检测出中和抗体，且出现典型的ＣＤ症状。免疫组犬有３只表现轻微的卡它性炎症症状，如轻微的结膜炎或轻微的扁桃体炎外，没有其它任何ＣＤ的临床症状２００３年，Ｆｉｓｃｈｅｒ等将ＣＤＶＳｎｙｄｅｒＨｉｌｌ株Ｈ和Ｆ基因分别克隆入ｐＶＲｌＯ口载体，ＰＢ２２９ＰＢ２６－构建了表达质粒Ｐ和Ｐ１。将两种质粒混合后与阳离子脂质体ＤＭＲＩＥＤＯＰＥ１按体积／质量比为４：的比例制备ＤＮＡ疫苗。为评价表达质粒在自然宿主犬体内的体液免疫应答，将９只９ｗＳＰＦ比格犬，随机分为两组Ａ组（５只）和Ｂ组（４只），Ａ组肌ＩＥ－ＤＯＰＥ包裹两种海合质粒５０肉注射用阳离子脂质体ＤＭＲ，每种质粒＾ｉｇ，分别在Ｏｄ２８ｄ一Ｂ组一和各免疫次，为空白对照。第次免疫两种混合质粒后，检测不到血清抗体，二次免疫后Ａ组５只犬中有３只可检测有限的抗ＣＤＶ血清抗体，对照组在整个实一Ｖ血－验期没有检测到抗ＣＤ清抗体。为了进步评价ＤＭＲＩＥＤＯＰＥ包裹ＣＤＶＤＮＡ疫苗的免疫保护为，用ＣＤＶ强毒经烦内途径对所有的实验犬进行攻毒试验，攻毒后第７ｄ，所有对照组的犬均死于ＣＤ。与此相对应，免疫组可Ｗ看到明显的保护作用，５只犬中有１只具有明显的ＣＤ症状，并死亡，其余４只幸存犬无任何ＣＤ症状。结果表明ＤＭＲ－ＩＥＤＯＰＥ包裹ＣＤＶＤＮＡ疫苗可Ｗ诱导犬产生保护性免疫反应。攻毒前体内只检测到有限的中和抗体水平，但却达到如此高的保护力，这种现象可能是由于病毒激活了Ｍ机体的细胞免疫应答或是由于攻毒时激活了ｔｌ２００４Ｗ抗体为主的记忆免疫应答。，ＤＬ等实一ａｈ验证明Ｈ和Ｎ基因联合免疫效果超过单独个片段的免疫，能够产生强的保７５１护办。ｃＤ－Ａ－徐向明等用ＣＤＶ中国分离株构建重组真核载体ｐＮＡＨ和ｐｃＤＮＦ，免疫小鼠诱－发了较高水平的抗ＣＤＶ抗体，ＥＬＩＳＡ检测两种质粒混合免疫产生了１：３２１：１２８的抗ｔｗｉＣＤＶ中和抗体。免疫３次后，采用ＣＤＶ强毒攻击犬。对照组呈现出典型的ＣＤ症状，攻毒后３ｗ内，有２只犬衰竭死亡，１只犬症状明显，攻毒后第１８ｄ外周血淋己细Ｖ核酸一胞中病毒检出ＣＤ。而ＤＮＡ疫苗免疫组除出现过性的体温升高外，未出现典７７８Ｐ’１型ＣＤ症状。为了提高ＣＤ核酸疫苗的免疫效果，孙建涛等将具有蛋白转导功能的牛疮疹病毒Ｉ型ＶＰ２２基因和ＣＤＶ分离株的Ｆ基因克隆至能自我复制和高效表达外源蛋白的甲病毒复制－－－，１。研巧结果表明子载体ｐＳＣＡｌ中构建了真核表达质粒ｐＳＣＡｌＦ和ＰＳＣＡＶＰ２２Ｆ，－ＳＣＡＶ－－－Ｐ１Ｐ２２Ｆ二者均有良好的抗原性，能诱导转染细胞调亡。且ＰＳＣＡ１ＶＰ２２Ｆ转导７９ｌ［－和表达效率优于ｐＳＣＡｌＦ。近些年来一，些探索。徐向，为了提高核酸疫苗的免疫效率人们在多方面也进行了－－ｎｕｅｔ－明等合成４条ＣｐＧ寡脱氧核昔酸（邱Ｇｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｌｅｏｉｄｅｓ，邱ＧＯＤＮ），通过体外－５－ 东北林业大学博±学位论文－ＯＤＮ淋己细胞增殖试验确定１条刺激活性最湿著的ＣｐＧ。将３０只健康比格犬随机均分为２大组，每大组再分为５小组，分别Ｗ不同的剂量肌肉注射ＣＤＶ附着蛋白（巧重组质粒ＮＡ－－ＯＤＮｐｃＤＨ和选定的ＣｐＧ。在免疫后的第２ｗ、４ｗ和６ｗ分别测定各姐动物的抗ＣＤＶ中和抗体和Ｙ－－ＯＤＮ对提高抗ＣＤＶ中和抗体效干扰素水平。结果表明选定的ＣｐＧ一＜定作用，〇价和干扰素水平具有且与对照组差异显著（Ｐ．〇５）；但不同剂量的质粒－－－ｃＤＮＡＨ和ＧＯＤＮ的效果不同０／ＧＯＤＮ和／－ｐ邱，其中Ｗ３雌犬的Ｃｐ５０雌犬的ｐｃＤＮＡ－Ｈ的剂量组合效果最佳－。该剂量的邱ＧＯＤＮ和ｐｃＤＮＡＨ免疫５只比格犬，同时Ｗ质粒ｐｃＤＮＡ－Ｈ与生理盐水作为对照４ＤＶ；周后所有动物均接种Ｃ组织匀浆毒。结果发现试验组动物均未出现犬癌热临床症状，且攻毒后第３周ＣＤＶ检测为阴性，而ｃＤＮＡ－Ｈ对照组和生理盐水对照组动物的ＣＤＶ检测阳性率为４０％和１００％ｐ；这表明８０［１Ｇ能够明显促进重组质粒ｃＤＮＡ－Ｈ的免疫保护作用邱ｐ。１２２．５重组活．．载体疫苗Ｔａｙｌｏｒ等首次在痘苗病毒中表达了ＭＶ的Ｈ、Ｆ０、Ｆ１和Ｆ２基因。经实验证实，接－－－ｒＶＶＭＶＨ或ｒＶＶ－Ｆ＋Ｈ后能诱导产生较高的ＭＶ中和抗体种ＭＶ，虽未能产生可检测的抗ＣＤＶ中和抗体，然而ＣＤＶ攻毒后，除少数动物呈现轻微的ＣＤＶ症状外，全部实ＩＷ验犬均能存活。１９％年，Ｗｉｌｄ等分别构建表达ＭＶ的Ｈ、Ｍ、Ｆ、Ｎ及ＣＤＶ的Ｆ蛋白的重组疫－－，免疫小鼠结果表明ＭＶＨ外均能对小鼠产生部分抗ＣＤＶ的保护作，苗，除了ｒＶＶ用而接－ＭＶ－Ｆ的小鼠得到ｒＶＶ完全保护１９９７年ＪｏｎｅｓＲＰＶ－ＲＰＶ，构建了痘苗病毒表达的ＨＡ和Ｆ抗原的重组疫苗（ＶＶＨＦ），无ＣＤＶ母源抗体的幼貂免疫接种该疫苗产生后，即可产生抵抗致死剂量ＣＤＶ强毒攻击６０％的保护力。这种疫苗对貂是极为安全的，且不存在ＣＤＶ母源抗体的干扰作ｔＷ用。同年，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｒｓ将ＣＤＶ的Ｈ和Ｆ基因分别插入痘苗病毒弱毒株ＮＹＶＡＣ和金丝雀痘病毒弱毒株ＡＬＶＡＣ株构建重组疫苗，疫苗２次免疫雪貂后可产生中和抗体并能８４ｔｌ耐受强毒攻击。Ｃｈａｐｐ山Ｓ等构建了金丝雀痘病毒重组ＣＤ基因苗，此疫苗间隔３ｗ加强免疫犬４７只（１０ＰＦＵ／犬），并于二免后２ｗ攻击ＣＤＶ强毒，结果４只免疫犬全部获得保护，并能产生抗体反应，７只对照组７只犬中，有５只出现典型的ＣＤ感染症状而，其中死ｔ８６的］３只。Ｗｅｌｔｅｒ等构建了同时表达ＣＤＶＨ和Ｆ基因的痘苗病毒重组疫苗ＮＹＶＡＣ－ＨＦ经鼻内二一和十指肠途径免疫接种雪貂，对照组接种相同剂量的用同载体表达的狂犬病毒Ｇ蛋白基因，免疫间隔期４ｗ，两次免疫接种后，用致死量ＣＤＶ强毒进行攻击。结果显示：ＮＹＶＡＣ－册重姐ＣＤ临床Ｖ核酸鼻内接种病毒的犬未出现发病症状，也未检测出ＣＤ；Ｄ临而对照组呈现出典型Ｃ床症状，表明痘病毒重组疫苗经过鼻黏膜免疫能够取得有效的保护气－Ｆ－ＩＩｉｓｃｈｅｒ等ＷＣＡＶ载体为基础，分别构建了表达ＣＤＶＨ和Ｆ基因的重组载体一－－－－ＣＡＶＩＩＦ和ＣＡＶＩＩＨＣＤＶ抗体阴，这两种重组病毒混合后经鼻内接种性的幼犬，次免疫就可激发较高水平的抗体并可对犬体提供保护，初步证实了复制性腺病毒重组疫苗－６－ １绪论一熟膜免疫的价值。将该重组ＣＤ疫苗皮下注射接种同批次的幼犬时，在追加免疫后仍激发了显著的血清抗体转化现象，并对强毒攻击提供了坚强的保护力。结果表明皮下注射复制性重组ＣＡＶ疫苗能够克服对腺病毒载体的主动和被动免疫带来的影响，从而成一８８［］为对具有母源抗体的幼犬免疫的种有效的免疫接种途径。１．２．２．６反向遗传操作用于ＣＤ疫苗的构建２００１年，ｖｏｎＭｅｓｓｌｉｎｇ将ＣＤＶ和ＭＶ的囊膜糖蛋白Ｈ基因进行替换，救获了嵌合体重组病毒一，为给我们提供了种新的ＣＤ疫苗构建思路。对于犬和其它经济动物而－言，ｒ，在没有致病力的前提下ＭＶＣＤＶＨ可激发产生针对同源Ｈ蛋白的中和抗体，送，此外样就弥补了常规ＭＶ活疫苗免疫犬不能产生抗ＣＤＶ中和抗体的缺陷，该重组疫苗同样可Ｗ不受ＣＤＶ母源抗体的干扰，给处于母源抗体临界点的幼畜提供保护，也避ｔｗｊ免了ＣＤ活疫苗对其它易感群体带来的感染和致死的危险。１．３ＣＰＶ概况ＰＷＣＰＶ可Ｗ引、１起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性屯肌炎，于９７８年在美国首次被９１［９２’９３［］１１发现。我国于９８２年证实存在ＣＰＶ感染，病犬Ｗ呕吐、出血性肠炎、白细胞减ＰＷ２－少为主要恃征。主要危害幼犬，特别是６月龄犬。该病发病急，病程短，死ｔ率５０％－－高，１００％１０％５０％。，传染性强发病率为，病死率为ＣＰＶ属于细小病毒科、细小病毒属、猫细小病毒亚群，为自主复制的单股负链Ｐｓ’ＭｌＤＮＡ病毒，基因组全长约Ｓ．Ｏｋｂ。最初认为ＣＰＶ主要感染犬科动物，但由于ＣＰＶＰＶＣＰＶ－２ａＰＶ－化－２ｃＰＶ－２ｃ４变异速度快，目前已证实Ｃ有、Ｃ、ＣＰＶ（ａ）及Ｃ（ｂ）个亚型Ｐ７３通过不断的抗原漂移产生新的突变株最早的ＣＰＶ－２在出现后短短几年时，并ｉｆＷ－，、宿主范围和血凝性方面均发生了变化ＰＶ间发生抗原漂移在抗原性，Ｃ２基本在ｅ犬群中消失。Ｓｔｉｎｅｌ等在对多种野生动物猫泛白细胞减少症病毒基因型调查中，已证实ＣＰＶ－２ａ／２ｂ在自然条件下也能感染猫科和軸科等多种肉含兽ｃＰＶ－２ａ／２ｂ与原始型ＣＰＶ－２２５个氨基酸的差异－Ｖ－２ｂＶＰ２蛋白的４在ＶＰ蛋白上有，ＣＰＶ２ａ与ＣＰ仅在２６位一ＡＡ２２６有个ｓｎ＾ｓｐ的氨基酸突变，ＶＰ的４位氨基酸位于ＣＰＶ衣壳蛋白的主要抗原决－－２－定簇位点。ＣＰＶ，Ｖ２ａＰＶ２ｂ但不感染猫科动物，只感染犬；ＣＰ和Ｃ不仅能感染犬而－２ａ／２ｂ且还能感染猫科动物。在抗原突变株ＣＰＶ出现后，又出现了ＶＰ２蛋白氨基酸位点发生突变的病毒株－４２６突－２Ｃ，ＣＰＶ还在不断的进化和变异。ＶＰ２创Ｕ变株（ＣＰＶ）自意－－大利出现后，很快在欧洲、亚洲和美洲也都己经被检测到。在我国ＣＰＶ２ａ和ＣＰＶ２ｂ－－－广泛并存，但１９８２１９９６年我国ＣＰＶ２ａ为主，１９９７年后渐渐ＣＰＶ２ｂ占优势地位ｉＤ８［］ＰＶ－２ｂ－。Ｊ南非和己西ＷＣ为主，欧洲和日本ＵｌＣＰＶ２ａ为主１．３．１ＣＰＶ的基本结构和特征ＣＰＶ基因为线性单股负链ＤＮＡ，３ｂ，无囊膜基因组全长５３２ｐ，是ＤＮＡ病毒中分’子量最小的病毒含有２个开放阅读框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），５端ＯＲＦ编码ｉ’ＶＰｔＷＵＷ１和ＶＰ２两种结构蛋白，其中ＶＰ２序列完全包含在ＶＰ１序列中，３端ＯＲＦ－２编码ＮＳ１和ＮＳ２两种非结构蛋白（图１）。ＶＰ２蛋白是ＣＰＶ的免疫原性蛋白，可诱Ｗ５胃Ｖ导机体产生中和抗体Ｐ２上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性－－７ 东北林业大学博±学位论文ＵＷ和宿主范围。１－２ＣＰＶ（Ｔｓａ１９９１）图病毒模式圓ｏＪｅｔａｌ．＇Ｆｕ－ｉｅ１２ｃｈｅｍａｃａｒａｉｇＳｔｉｄｉｇｍｏｆＣＰＶ１．３．２ＣＰＶ病的防控１．义２．１灭活苗ｕＶｆｗ１９８０，Ｅｕｓｔｅｒ。之后年ｇ最早使用的是经福尔马林的灭活的ＣＰ疫苗，Ｓｍｉ化等研究结果显示：ＣＰＶ灭活苗不能完全控制免疫犬排毒。１９８２年，Ｐｏｌｉｏ化和Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ将ＣＰＶ强毒株的细胞培养物浓缩后，分别用０．２５％的福尔马林和０．５％丙内醋灭活制备疫苗。犬体免疫接种结果显示：丙内醋灭活疫苗免疫效果优于福尔马林灭活疫苗。Ｊａｍｅｓ等研究发现，ＣＰＶ与猫泛白细胞减少症病毒及貂肠炎病毒分别有６７％的同源基因，说明Ｈ者之间亲缘关系密切，存在抗原交叉反应，最早把猫泛白细胞减少症病毒灭活苗用于ＣＰＶ的防控。国内，研究者制备细胞培养铅胶灭活苗和红细胞吸附提毒的铅胶灭活苗。实验证明：ＣＰＶ灭活苗效果较猫泛白细胞减少症病毒和貂肠炎病毒异源苗要好。１．３．２．２弱毒苗１９８２年，Ｃｈａｌｉｆｏｕｒ用猫泛白细胞减少症弱毒苗经皮下或肌肉注射免疫９ｗ左右的幼一ｄ－犬，直，，，每３４ｄ重复免疫次到１６Ｗ首次接种用２个剂量Ｗ后用Ｉ个剂量首次免，５８ｗ－－疫接种仅有％的犬达到保护性抗体滴度，３４ｗ后加强免疫，８０％９０％的犬可达到保－。１．护性抗体的滴度９８３年，Ｐｏｌｌｏｃｋ用商品化的猫泛白细胞减少症弱毒商品苗对８Ｗ２０Ｗ的１１４只犬进行免疫接种，结果有１０５只（９２．１％）产生ＨＩｄ：１０的免疫应答。Ｌ３．２．３新型基因疫苗Ｌａｎｇｅｖｅｌｄ将位于ＶＰ２氨基端２１个氨基酸合成后免疫犬，能产生免疫保护作用ｉｉｔＷ。Ｐａｒｒｉｓｈ等用含ＣＰＶＶＰ１基因的真核表达质粒免疫犬，攻毒保护试验证明基因疫ｉｎｆｉ苗能够保护犬不被ＣＰＶ感染。Ｊｉａｎｇ等构建了表达ＣＰＶＶＰ１蛋白的ＰＧＴ３６ＶＰ１质粒，５只９月龄的犬免疫接种结果显示：免疫Ｉｗ后，血清中可检测到ＩｇＧ抗体，２ｗ左，，所有免疫ＧＴ３６ＶＰ右达到峰值约１４ｗ后抗体消失Ｐ１疫苗的犬均能抵抗ＣＰＶ强毒的ｕｕｉ攻击，表明该核酸疫苗能够诱导机体产生抗ＣＰＶ的特异性免疫反应。邱薇等构建真核表达载体ｐＩＲＥＳＶＰｌ，免疫９月龄犬后，用致死量ＣＰＶ强毒攻击，免疫组姐未表现ＣＰＶ感染的临床发病特征，而对照组犬则表现出体温升高、腹泻等临床－８－ １绪论ｉＭｔ特征，表明该重组质粒能抵抗ＣＰＶ强毒的攻击ｌ为了提高核酸疫苗的免疫效力，研究者开展细胞因子与核酸疫苗联合免疫的研究。２（正－２－－２王滞构建了表达犬白细胞介素）的真核表达质粒Ｃ正２。将Ｃ正和之前构建的２ｃＤＮＡ－ＣＤ５ｓ－ＶＰ２共免疫小鼠进行评价表达ＣＰＶＶＰ基因的质粒ｐｐ。结果显示：免疫后３５ｄ血清中ＶＰ２的抗体水平达到１：５１２０，明显高于ＶＰ２表达载体单免疫组（ＰＯ．Ｏｌ）。淋己细胞增殖实验表明，且免疫组小鼠的淋己细胞刺激指数均明显高于阴．Ｏｌ）＜０．性对照组（ＰＯ，共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组（Ｐ０５）。共免疫小鼠ｔｕｓｉ淋己细胞丫干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组（ＰＯ．Ｏｌ）。孙岩构－－－７Ａ－－建表达犬白细胞介素７（忙７）的真核表达质粒Ｃ正。将ｃＥＬ７和ｐｃＤＮＣＤ５ｓｐＶＰ２共免疫小鼠进行评价。结果思示：共同免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别＜０极显著和显著高于ＶＰ２单免疫组（Ｐ．０１Ｐ＜０５和．０）且小鼠淋巴细胞刺激指数和Ｙ干；ｆｉｓｗ－扰素表达水平也显著高于ＶＰ２单免疫组（Ｐ＜０．０５）。贾启恒构建犬的粒细胞巨隆细胞集落刺激因子－ｃＤＮＡ－ｃ－ｃ－（ＧＭＣＳＦ）的真核表达载体ｐＧＭＣＳＦ。将其和ｐＤＮＡＣＤ５Ｓ－ＶＰ２共免疫小鼠进行评价Ｐ。结果显示：共免疫组抗体的水平显著高于ＶＰ２基因单免疫组（ＰＯ．Ｏｌ）小鼠淋己细胞的刺激指数和干扰素丫的表达水平高于单免疫组；１２７［］（ＰＯ－－．０５）。陈慧慧利用真核表达质粒Ｃ圧２、Ｃ正７与ＶＰ２联合免疫进行鼠体评ＶＰ２＋ｃｍ－－７价。免疫结果表明，２／ｃｌ巧免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价均－－－－显著高于ＶＰ２＋Ｃ２和ＶＰ２＋ｃＫ＾７共。Ｃ２Ｃ正免疫组（ＰＯ．０５）ＶＰ２＋正／正７共免疫组小鼠的淋己细胞刺激指数比其它免疫组略有升髙但尚未达到显著水平，然而Ｙ干扰素的表达＜－－水平显著高于其它免疫组（Ｐ０．０５）。综上所述，Ｃ正２和ｃ＾７基因对ＤＮＡ疫苗免疫原性的増强作用具有明显的协同效应１．４ＣＡＶ巧况＇’腺病毒科（心ｅｎｏｗ＞７流！ｅ）分为四个属：哺乳动物腺病毒属（Ｍｗｔｏ成ｎｃｍｍｓ）、禽腺病毒属（成）、腺胸腺病毒属（处ａ成ｎｏｖｚＶｗ）和唾液腺病毒属ｗｆｉ一（况ａ施。ＣＡＶ是哺乳动物腺病毒属中感染范围最广、致病性最强的种ｗ’病毒与人腺病毒具有相似的基因结构ｔ根据其血凝和中和试验等特性不ｉ２３ｔｌ－Ｉ型。ＣＡＶＩ与ＣＡＶ－同可将ＣＡＶ分为Ｉ型和ＩＩＩ之间纤突蛋白的核酸同源性约为＾３４１８０％－。ＣＡＶＩ于１９２５年首次被发现。１９８４年，在我国首次分离到该病毒，证实了ｕｙｉＷｔｆ－我国犬中存在ＣＡＶ－Ｉ的感染。ＣＡＶ、Ｉ在临床上可导致犬传染性肝炎狐狸和熊脑－ｗｗ１？ｔ［ｉ炎的发生。该病死亡率高达４０％，因而可给养殖业造成巨大的经济损失。通过对马、兔子、松鼠、刺猎和黑猩猩的血清学调查研究发现，它们也是ＣＡＶ的敏感动Ｕ４２＾物。有研究对邸龙自然保护区的大熊猫进行了ＣＡＶ抗体调查显示，ＣＡＶ也能感染大熊鄕１４３＾１．４．１ＣＡＶ的基本结构和特征ＣＡＶ属腺－，Ｉ病毒科，哺乳动物腺病毒属为双股线状ＤＮＡ病毒。ＣＡＶ的基因组长ｉＷ［－￣－约引ｋｂ，见图１５。基因组包含Ｅ１Ｅ４基因和Ｌ１Ｌ５基因。分别编码五邻体、六邻－９－ 东北林业大学博±学位论文１－３）ＡＶ的体、纤丝和衣壳等结构蛋白（图。六邻体是Ｃ主要抗原蛋白，含有型特异性ｗ，ｗｔ］抗原表位和中和抗原表位，能刺激机体产生中和抗体Ｗ及组和型特异性抗体。六一１４７［］ｌ邻体蛋白有个五面体的基底和Ｈ角形的塔尖，塔区由Ｌｏｏｐ、Ｌｏｏｐ２、Ｌｏｏｐｓ和ｗＵｔｉＬｏｏｐ４组成气目前研究表明，Ｌｏｏｐｌ和Ｌｏｏｐ２是较好的中和抗原决定簇。Ｅ３区为病毒复制的非必需区，可用于外原基因的插入。１．４．２ＣＡＶ病的防控１．４．２．１灭活苗Ｒｕｂａｒｔｈ和Ｇｒｅｅｎ等最早用发病犬的脏器制成的ＣＡＶ－Ｉ福尔马林灭活苗进行免疫试一验ａｓｓｏＡＶ－Ｉ，取得了定的效果。Ｃ化首次在体外应用犬肾原代细胞增殖Ｃ获得成功－＞ＶＩ后，生产出１＾１细胞培养毒代替感染动物组织的灭活苗。张汇东等人１＾南京分离的ＣＡ－ＡＶ－（ＩＣＨＶＧＮ１）经ＭＤＣＫ细胞增殖制备的ＣＩ灭活疫苗并进行了免疫试验，试验结果表明，该灭活苗对预防犬传染性肝炎有良好的免疫效果，免疫效力至少能维持６个月１５０［］０；＊＊ｎａｌ？－ｓｔｒａｆＭＪｃｄＤＲＡＣＢ气ｔｏｔｒｏｉｉＩｅｘｏｎ－图１３腺病毒模式图＊Ｆ－ｉｕｉｅ１３ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｒａｍｏｆＡＶｇｇＣ１４２２．．．减毒活疫苗－ＦｉｅｌｄｓｔｅｅｌｅＡＶＩ在犬肾细胞上连续传代同时伴随着毒力的减弱和Ｅｍ巧发现Ｃ，他ａｓｓｏ５－们将Ｃａｂ分离的病毒株在犬肾细胞上连续１代后获得了ＣＡＶＩ弱毒疫苗，此疫苗ｉｆＷ可Ｗ检测到病毒核酸。接种犬后虽能产生持久而有效的免疫力，但免疫犬的尿液中Ｐｅｐｅｖｎａｋ等发现将经过犬肾细胞驯化的弱毒株再接种猪肾传代细胞系经多次传代后即可克服毒力返强现象。将经犬腎细胞中连续传代的毒株继续接种猪肾细胞连续传１５代，ＡＶ－后又接种到雪貂肾细胞中，从而得到保留了ＣＩ抗原性稳定的病毒株，用此病毒株免疫犬并取得了很好的免疫效力１９％年，周向阳等用弱毒细胞苗对７３９条犬（包括警犬和民间犬，年龄从二月龄至八岁老龄犬，还包括孕犬）进行免疫研究，结果保护率１５３［１达到了１００％。１．４．２．３核酸疫苗ＶＡＸ－－张开霞等构建了ｌＣｐＧＬｏｏ重组质粒，小鼠免疫实验结果显示该疫苗能诱导ｐｐ出特异性体液免疫和细胞免疫，产生具有杀伤表达病毒抗原鞭细胞的ＣＴＬ细胞效应，显示出良好的免疫原性比格犬免疫攻毒试验结果显示ＶＡＸｌ－ＣＧ－Ｌｏｏｐ免疫效果良好；ｐｐ－－１０ １绪论１５４［］〇Ｖ－Ｆ邱薇等成功构建犬腺病毒纤突质粒ｐＴＣＡ，免疫ＣＡＶ抗体阴性犬，每隔８ｗ加一次－Ｆ疫苗的犬攻毒强免疫，３免后４ｗ对全部犬进行强毒攻击。结果显示接种ｐＴＣＡＶ后除１只发病外，其余均不发病，而对照犬则全部发病，说明所构建的核酸疫苗能对犬ｆｉＭｌ产生较好的免疫保护。１．５本研究的目的和意义随着社会的发展，无论是作为伴侣动物，还是特种用犬（搜救和缉毒等）的犬类在人类生活中扮演着重要角色，；而随着人类对皮毛制品需量的不断提高毛皮动物在国内的养殖规模也逐年扩大；对于珍稀额危野生动物，随着人类活动范围的不断扩大，其与人类的接触也越来越频繁，。因此加强对其主要疾病防控是当务之急。本项目从国内发病的犬体分离到ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ野毒株，通过对病毒基因组序列测定和序列分析一，从分子水平上探究该病毒的来源，为进步系统地研巧病毒抗原变异和遗传与演化积累实验数据。野毒株经过筛选和驯化，培育出了有良好免疫原性的致弱Ｄ－毒株、ＣＰＶＶＩ。在此基础上开展Ｃ病和ＣＡ病Ｈ联活疫苗的研究。在开放的市场条件下，特别是在我国加入ＷＴＯ后，要使我国的畜牧业能够健康发展，必须尽快开发、生产具有自主知识产权，适合现代畜牧业发展要求的新疫苗。这是保障公共安全和社会安定的重要举措。本研究紧密结合我国畜禽疫病防制和兽用生物制一－品生产的实际，将为ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病的免疫预防接种提供有效的疫苗；另方面也可通过动物疫苗的接种，减少由于病毒的同源重组而产生新病毒的可能，对犬的健康、毛皮动物的养殖及瀬危野生动物的保护具有重大意义。同时还可Ｗ促进我国生物制品行业产品的更新和面对越来越多的国际竞争和挑战。－－１１ 东北林业大学博±学位论文２ＣＤＶＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ的分、离、鉴定、致弱及免疫效力研巧２．１实验材料与实验仪器２■＂实验祥品发病犬的内脏组织采集自发病养殖场（发病犬详细信息如下；ＣＤＶ感染病犬；８月龄，雌性，拉布拉多犬。临床症状：精神沉郁、食欲减退两眼出现眼移，流黄色黏；稠肢涕。伴随有神经症状，如阵发性抽搶、口吐白沫、呕；腹湾、排稀便或酱油样水便吐等。解剖可见胃肠出血，脑膜出血。ＣＰＶ感染病犬：５月龄，雄性，中华田园犬。临床症状表现为呕吐、腹泻和脱水番茄酱样的腥臭粪便。解剖可见胃肠出血，肠套；排叠。ＣＡＶ感染病犬：１０月龄，雄性，金毛犬。临床症状表现为结膜发炎，鼻流清涕；精神沉郁一、畏寒，騰缩隅；呕吐、腹泻，化便。剖检可见肝脏肿大，有出血点，胃肠）－出血。；１月龄比格犬（ＣＤ／ＣＰＶ病／ＣＡＶＩ血清中和抗体效价不高于１：２）购自广州医药研巧总院有限公司实验动物研究开发中也；ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株，为商品化疫苗株，购自Ｉｎｔｅｒｖｅｔ；鸡胚成纤维（Ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＥＦ）细胞由本实验室制－９４）和ＭＤＣＫ细胞－－备；ＣＲＦＫ细胞（ＣＣＸ（ＣＣＬ３４）购自ＡＴＣＣ。ＣＡＶＩ型阳性毒株－由哈尔滨兽医研究所刘长明研究员惠赠；ＣＡＶＩＩ阳性毒株为商品化的疫苗株，购自辉瑞公司。２．１．２实验试剂表２－１实验试剂Ｔ－ａｂｌｅ２１ＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅａｇｅｎｔｓｐ序号试剂名称Ｗ１ｄＮＴＰＴａＫａＲａ２乙醇天津百世化工有限公司３－ＭＬＶＩ打ｖＭｉｔｒｏｇｅ打４ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＩ打ｖｉｔｒｏｅ打ｇ５Ｎｕｃ－ｌｅａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒＰｒｏｍｅｇａ６扔ｇＤＮＡ聚合酶ＴａＫａＲａ７ＴＡＥ缓冲液伊世达生物公司８琼脂糖ＢｉｏｗｅｓｔＡｇａｒｏｓｅ９ＥＢ（ＥｎｔｈｉｏｒｅＢｒｏｍｉｄｅ）伊世达生物公司１０６ＸｌｏａｄｉｎｂｕｆｆｅｒＴａＫａＲａｇ１１ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（２０００ｂｐ）ＴａＫａＲａ１２ＤＥＰＣＳｉｇｍａ１３ＭＥＭＧｉｂｃｏ－－１２ ＤＶ－２Ｃ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究１４胎牛血清Ｇｉｂｃｏ１５１ＸＰＢＳＨｙｃｌｏｎｅ１６．２５ｃｏｎｅ０％膊酶Ｈｙｌ１７民ＮＡ提取试剂盒巧ａｅｎｇ１８胶回收试剂盒Ｏｍ巧ａ１９ＤＮＡ提取试剂盒Ｏｍａｅｇ２．１．３实验仪器表２－２实验仪器Ｔａｂ２－２ＥｘｒｎＩｎｌｅｐｅｉｍｅｔａｌｓｔｒｕｍｅ打ｔｓ序号仪器名称品牌型号１ＰＣＲ仪ＡＢＩ２７００／ＡＢＩ９７００／ＴａＫａＲａＴ民６００２生物安全柜Ｔｈｅｒｍｏ３超净工作台哈尔滨市东联公司ＦＬＣ－３‘４－８６Ｃ超低温冰箱ＳＡＮＹＯ‘５－２０Ｃ冰箱ＬＧ６低温高速离心、机ＨＥＲＭＬＥＺ２３２Ｋ７微量移液器Ｅｐｐｅｎｄｏｆ８电热恒温水浴锅北京金北德工贸有限公司一９琼脂糖凝胶电泳仪北京市六仪器厂ＤＹＹ－ＩＩＩ－８Ｂ１０电子天平梅特勒－脱利多仪器上海有限公司１１微波炉格兰仕１２凝胶成像分析系统ＡＬＰＨＡＩＮＮＯＴＥＣＨ１３紫外分光光度计ＢＩＯＣＨＲＯＭＵｌｔｒｏｓｐｅｃ１１００ｐｒｏ１４二氧化碳培养箱ＨｅａｌＦｏｒｃｅ－１５超纯水器ＭＨｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｉＱＴｒＭ１０１６酸度计ｈｅｍｏｏｄｅｌ４１７高压灭菌器上海申安医疗器械厂２．２实验方法２．２．１病巧分离ＣＤ°１０％ＣＥＦ３３将冻存处理的病料按培养量的接种单层，Ｃ吸附化，加入维持液继续培养，逐日观察ＣＰＥ情况。°处理的ＣＰＶ病料样品按培养液体积同步接种ＣＲＦＫ细胞，３７Ｃ培养，同时设正常细胞对照－。每天观察细胞贴壁生长情况和细胞病变，若无ＣＰＥ，则于培养的第４ｄ５ｄ收取上清－，细胞继续按常规传代培养，至第５代仍无病变视为阴性，出现细胞病变的经°２３－２０（ＴＣ冻融次后收毒Ｃ下保存。，置°ＡＶ－Ｉ病料样品按照３７Ｃ吸附处理好的Ｃ１０％的比例接种生长良好的ＭＤＣＫ细胞，－－１３ 东北林业大学博±学位论文°３０ｍ－ｉｎ后，加维持液继续于３７Ｃ４ｄ５ｄ，，静置培养每天观察有无葡萄串样ＣＰＥ。至－第５代仍无病变视为分离阴性，３出现细胞病变的反复冻融次收毒，置２（ＴＣ条件下保存待鉴定。２．２．２病毒鉴定２１ｘ〇．２．２．６电镜鉴定将第代ＣＤＹ细胞培养物经５０００离也ｌＯｍｉｎ取上清．５，ｇ，用０／〇的磯鹤酸负染后电镜观察５－Ｉ。取第代ＣＰＶ和ＣＡＶ细胞培养液作负染色。，电镜观察病毒形态２２２２ＲＴ－ＰＣＲ．．．／ＰＣＲ鉴定－ＤＮＡ按照试剂盒说明书提取ＣＤＶ的ＲＮＡ，ＣＰＶ和ＣＡＶＩ的。一引物的设计与合成：根据ＣＤＶ的Ｈ基因同源性分析对引物，设计和筛选出了，，’’－ｉ５－－：ＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＧ３２：５ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧｐ；ｐＧＴＴＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＡ－３根据ＣＤＶ野毒株与疫苗株Ｈ基因核昔酸位点差；－２１－异，见图，设计针对ＣＤＶ野毒株的特异性ＬＡＭＰ引物３，见表２。一’－根据ＣＰＶ的ＶＰ２基因同源性分析ＶＰ２－，设计和筛选出了对引物，ｌ；５’’－－ＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧ－３ＶＰ２２；５ＡＡＴＡＡＡＧＣ；’ＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＡＧ－３。－Ｖ－根据ＣＡＶＩ和ＣＡＩＩＥ３基因的序列差异上下游，设计引物，最终可Ｗ根据生成’－－－－的产物大小来区分ＣＡＶＩ和ＣＡＶＩＩ。ＣＡＶ－Ｉ：上游引物５ＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＡＴ’’’－，－－３５－，下游引物ＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＴＴＧＡＣ３ＩＩ，ＣＡＶ：的引物为上游引物５，’－－ＣＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＡＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣ３－，下游弓｜物为５ＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＴＧ’３。引物由宝生物（大连）有限公司合成。■？王０６０１０８０１王００？王１２０？？广Ｉ王王４０Ｃｈｉ．ＡＰ１７００；％？＊：１１５５Ｃｈｉ．ＡＹ３９０３：ｔＣ１５ＳｈＣｉ．９２２６ＩＤ０ｔ；ｌａｓｓＣｈｉ．ＥＦ０４２Ｂ？？ＸＩＳＳＣｈｉ．＂４４５０：ｔ；ａ１１５５：ｈｉ．ＳＯ：ＣＥＦ＂．．ｇ．．．．ｔ：１１５５Ｃｈｉ．ＥＦ４４５０：Ｃ．，．ｇ王ＩＳ占Ｃｈ：ｉ．ＥＵ３乙占７：？．玉１Ｓ５Ｃｈｉ．ＥＵ３２Ｓ７：．ｔ；；：：：：：：：：：：：：：ｉＩＩＳＳＣｈｉ．ＢＵ３２Ｓ７！＼ｌａｓｓ＂Ｃｈｉ７．ＥＵ３２Ｓ：．？ｌａｓｓＣｈｉ．Ｅ口３２５７：：；ｕｓｓＣｈｉ．Ｅ口３２５７：Ｃ．．．ｇ１１５占，ｈｘ３２５７Ｃ？ＥＵｓ？■龜■■■■■？？？？？？■■■■？■龜■■■■？？１１Ｓ５Ｃｈｉ．ＥＵ３２５７：．．．．．．．ｃ．．ｔ，，．ｇ．？１１５５？Ｃｈｉ．Ｅ？３２占７！；１１５５ｈｉ．３２Ｓ７．ＣＥＵ５１１５５Ｃｈｉ．ＢＵ３ＳＳ７：：：：ｉｉＳＳ＂：ｉＣｈｉ．Ｂ口３２Ｓ７：．？．．■王１占５Ｃｈｉ．３７９Ｓ：．ＥＵ？１王５５Ｃｈｌ．ＥＵ占３２６ｓ：Ｘ王Ｓ５Ｃｈｉ．ＥＵＳｆｔ＂！：；１１Ｓ５Ｃｈｉ．ＥＵＳ６４８占Ｓｓ：ｈｉ．ＦＪ４０９？！ｔｊ占５ＨＬＪｌ－０６１：１Ｓｔ５—０７：？■■■■ＩＸＳＳｇｉ５１７２４２：Ｉ１ＴＴ．ＣＣＣＣ．．．ＣＡ．．ＡＧＧＴ．Ａ：：．：：：：Ａ：：：：：：ｔＩＩＳＳｇｉ１１０９２９０２：！Ｔ．ＣＣＣＣ．．．Ｃ．．，Ａ．．ＡＧＧＴ．＜ＳＡＡｓＩＩＳＳ１２６２０２１；ＴＴ．ＣＣＣＣ．．．．．ＩＩＣＡＡＧＧＴＡＡＩＳＳ．ｉＩＴ．ｇＴＣＣＣＣ．．．ＣＡ．．ＡＣＯＡＩＴＡＩＳＳｃｎｄ＊ｒ＊ｔ？ｏｘｔ．ｃ．．．ｐ：ｃｃｃｃ■ｇｇｔ？ＩＩＳＳ，图２－１ＦＩＰ中巧３端差异位点’Ｆ２－１ＦＩＰｄｉｇｕ巧ｓｉｔｅｉｓｃｒｅｐａｎｃｙｏｆＦ２３ｅｎｄ表２－３ＣＤＶ野毒株ＬＡＭＰ引物序列Ｔａｂ－３Ｓｅｌｅ２ｕｅｎｃｅｓｏｆｒｉｍｅｒｓｏｆＣＤＶｓｉｏｌａｔｅｓｑｐＰｒｉｍｅｒＳｅｕｅｎｃｅｓｑＦＩＰ－ＨＴＧＣＡＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＢＩＰ－ＨＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＴＧＣＦ３－ＨＧＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧ－ＨＣＴＣＣＧＢ３ＴＴＣＡＧＴＡＴＡＡＣＣＧＧ－－１４ ２ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－、、１的分离鉴定致弱及免疫效力研巧ｃＤＮＡ－合成：按照Ｍ，２０ＲＮＡ７、ＭＬＶ的说明书进行操作采用阵反应体系：咕°－ＩｘＲＴ－Ｂｕ瓶ｒ４、ｄＮＴＰ６、ｉ、ＭｉＬ、ＲＮａｓｅｉｎｈ化ｉｔｏｒ咕ｐ叫ＬＭＬＶｌ，４２Ｃ水阵｜叫Ｌ浴°°－Ｉｈ，７０Ｃｌ０ｍｉｎ，置２０Ｃ备用。ＰＣＲ２５ＤＶＡ２１ｘＰＣ民ｂｕｆ．５Ｌ、扩増：反应体系为。分别加入ＣｃＤＮ阵、０ｅｒ２ｌ阵＾ｄＮＴＰ２ｊＬ、ｉ２１０ｍｏｌ／Ｌ各ｌｘＬ．和，ＤＮＡ聚合酶０２５ｉＬ，用去离子水补至２５ｊＬ，于｜ｐｐｐ｜｜｜°°ＰＣＲ仪上进行反应。ＰＣＲ程序为９４Ｃ预变性３０ｓ，５３．５Ｃ退火４５ｓ，７２Ｃ延伸２ｍｉｎ，３５°个循环７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ，，；反应结束后取产物进行１％琼脂糖凝胶电泳鉴定同时设ＣＤＶ（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株）阳性对照。ｘＮＴＰ－－分别加入ＣＰＹＤＮＡ板２阵，ｌＯＰＣＲＢｕｆｅｒ２．５ｉＬ，ｄ２、ＶＰ２１和ＶＰ２模＾咕２ｌＯｐｍｏｌ／Ｌ各叫Ｌ，ＤＮＡ聚合酶０．２５｜＿ｉＬ，用去离子水补至２５的于ＰＣ反仪上进行反°°°°应。ＰＣ民程序为９４Ｃ预变性３０ｓ，５３．５Ｃ退火４５ｓ，７２Ｃ延伸２ｍｉｎ，３５个循环；７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ，反应结束后取产物进行１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。ＡＶ－ＮＡｘｅｒ５ＡＶ２分别加入ＣＩＤ２咕、ｌＯＰＣ艮ｂｕｆ２．曲、ｄＮＴＰ２阵、ＣＡＶ１和ＣｌＯｐｍｏｌ／Ｌ各１阵，化Ｔａｑ化２５阵，用去离子水补至２５阵，于ＰＣＲ仪上进行反应。ＰＣ民°°‘°程序为：９４Ｃ预变性５ｓ；９４Ｃ变性５ｓ，５５Ｃ退火Ｉｍｉｎ，７２Ｃ延伸４５ｓ，３０个循环；‘７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ，反应结束后取产物进行１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。－２．２．２．３ＲＴＬＡＭＰ鉴定反应体系为２５：１〇ｈＭ弓．，阵Ｉ物巧和Ｂ３各０５阵柳Ｍ引物ＦＩＰ和ＢＩＰ各４曲，ｌＯｍＭｄＮＴＰｓ１咕，２５ｍＭＭｇＣｂ５曲，５ＭＢｅｔａｉｎｅ２．５咕，ｌＯｘＴｈｅｒｍｏＢｕｆｅｒ２．５阵，ＢｓｔＤＮＡ聚合酶１６Ｕ，ＣＤＶｃＤＮＡ模板２阵，用ｄｄＨｚＯ补足°°２５。Ｃ水４０ｍｎＣ２ｍｉｎ。反应条件为：６５ｉ８０阵浴；－２．２．２．４，将其克隆入ＰＭＤ１８Ｔ载体中序列测定分析目的片段经回收后，经ＰＣＲ鉴定后交由宝生物工程有限公司测序，基因序列分别与ＧｅｎＢａｎｋ中其它ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ序列进行比较分析－４。。ＣＤＶ参考毒株序列见表２分离到的病毒分别命名为－－ＣＤＶ－ＹＢＹＮ和Ｖ、ＣＰＶＣＡＨ。２．２．２．Ｓ动物回巧试验鉴定－ＣＤＶＹＢ细胞培养上清经犬颈部皮下，两后肢大腿内侧皮下Ｈ点接种２只试验犬，４０１ＯＴＣＩＤｓ〇／犬，对照组接种细胞培养液ＩｍＬ，连续观察２１ｄ，记录试验犬的临床表现及体温情况。组２只－将６只１月龄犬随机分成２组，试验组４只，试验组动物皮下接种ＣＰＶ，对照ＹＮ４０１细胞培养上清，〇ＴＣＩＤ／犬，，５〇，对照组接种细胞培养液ＩｍＬ每日观察每日测体温２１４次，观察山并对观察剖检变化。６只犬随机分成２组－，对照组２只，试验组４只，试验组动物皮下接种ＣＡＶＨ细胞３＇０培养上清１ＯＴＣＩＤ／犬，对照组接种细胞培养液ＩｍＬ，５〇，每天观察临床表现每天测体温２次，并对死亡犬进行剖检。，观察１４ｄ２．２．３病毒致弱与免疫效力研究２－７０ｅｒｏ．２．３．１弱ＹＢ株在ＣＥＦ细胞传代至代毒株的培育将ＣＤＶ，之后在Ｖ细胞上再传２０代－，之后在ＣＥＦ细胞传至１０５代。将保存的ＣＰＶＹＮ按照培养液体积的３％同步°Ｃ培１１０－接种ＣＲＦＫ细胞，３７养，Ｗ此方法连续传至代。通过ＭＤＣＫ细胞传代ＣＡＶＨ．－１５ 东北林业大学博±学位论文株至１１０代。２－４Ｖ表ＣＤＨ基因遗传演化分析所用的参考毒株Ｔ－ａｂｌｅ２４ＣＤＶｓｔａｉｎｓｕｓｅｄｉｎａｎａｌｓｉｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｅｎｅｙｇ毒株ＧｅｎＢａｎｋ登陆号分离地域基因登录时间ＹＢ中国２０１２ＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔＥＵ１４３７３７美国２００７ＣＤＶ３ＤＱ７７８９４１中国２００８ＣｏｎｖａｃＺ３Ｗ９３丹麦１９９４ＬｅｄｅｒｌｅＥＦ４１８７８２中国２００７Ａ７５／１７ＡＦ１６４９６７瑞±１９９９５８０４ＡＦ３８６３１５美国２０的５８０４ＰＡＹ３８６３１６美国２００３９８－２６４５ＡＹ４４５０７７美国２００４－ＡＹ４９８２６５４６６０１１美国２００４Ｗ－２６４６ＡＹ５４２３１２美国２００４０－２６１８９ＡＹ６４９４４６美国２００４０－ＡＹ１２６４１５２６４９６美国２００４０－ＡＹ２００４１２６７６４９８６９２美国１４ＧＱ３３２５３０中国２０口２０１６ＧＱ３３２５３１中国口１７ＧＱ３３２５３２中国２０１２２０ＧＱ３３２５３３中国２０１２２４ＧＱ３３２巧５中国２０１２Ｒ６ＦＪ８６８１７１韩国２００９Ｒ８ＦＪ８６８１７３韩国２００９Ｒ９ＦＪ８６８１７４韩国２００９Ｒ１０ＦＪ８６８１７５韩国２００９Ｒ１１ＦＪ８６８１７６韩国２００９２６ＤＡＢ０４０７６６日本２００２９８－０的ＡＢ０２５２７０日本２００２ＨＭ－３ＡＢ０４０７６７日本２００２ＧｉａｎｔａｎｄａＡＦ１７８０２８中国１９９９ｐＧｒｅｅｎｌａｎｄｉｃＺ４７７６０丹麦１９９７－０６Ｈ５４０２９３中２０ＨＬＪｌＱ国１１ＨＬＪ２－０７ＥＵ５９３８９４中国２００８ＨＬＪ３－０８ＦＪ４０９４６４中国２００８ＴＮＡＹ３９０３４７＾＾－ｘ２．２３．２弱奉株的形态学观察将收获的ＣＤＶＹＢ第１０５代病毒细胞培养物５０００，ｇ离也３０ｍ－ｉｎ，取上清磯鹤酸负染电镜观察。将收获的ＣＰＶＹＮ株第１１０代次病毒细胞培养－化－ Ｖ－２ＣＤ、ＣＰＶ和ＣＡＶ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研充１°ｘｘ、５０００离也３０ｍ，４物，ｇｉｎ，取上清经１００，０００ｇ超速离屯Ｃ离也２ｈ，沉淀用适量的ＰＢＳ（Ｈ７－。ｐ．０）悬浮，磯鹤酸负染电镜观察将收获的ＣＡＶＨ株第１１０代次病毒细胞培养物上清经稱鹤酸负染电镜观察。－２．２．３．３病毒含量测定取ＣＤＶＹＢ株的第６、１０、２０、３０、５０、７０、９０、１００、１０５代－－培养物，ＣＰＶＹＮ株和ＣＡＶＨ株的第５、１０、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、１０５、－１１０代培养物，按照ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算ＴＣＩＤｓｏ。２．２．３．４不同代次病毒序列测定对不同代次病毒的Ｈ基因（ＣＤＶ）、ＶＰ２基因（ＣＰＶ）－和巧ｂｒｅ基因（ＣＡＶＩ）序列进行测定，并对测序结果进行了比对分析。２．２．３．Ｓ不同代次的ＣＢＶ致弱评价试验－组－取５０只１月龄犬随机分成１０，每组５只，１９组犬分别用ＣＤＶＹＢ的第６、＾１０、２０、３０、５０、７０、９０、１００、１０５代次毒接种，ＩＯＴＣＩＤｓｏ／只，同时设第１０组为对照犬组，接种相同剂量的灭菌生理盐水，观察２１ｄ，记录临床发病数，并合理处理试验犬。－－６０只１月龄犬随机分成１２组，每组５只，１１１组犬分别用ＣＰＶＹＮ的第５、１０、５５２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０代次毒接种，１〇ｔＣＩＤ５〇／只。设对照５只犬，观察２１ｄ，记录临床症状、发病数和死亡数，，并接种相同剂量的灭菌生理盐水之后将所有试验犬均捕杀并无害化处理。取４５只－８－１月齡犬随机分成９组，每组５只，１组犬分别用ＣＡＶＨ株病毒的第５５５、１０、２０、３０、５０、７０、９０、１１０代次毒接种，１０ＴＣＩＤ５０／犬，观察２１山记录临床发病数，５只犬，接种相同剂量灭菌生理盐水设对照。２．２．３．６不同代次的犬ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ免疫原性试验取１５只１月龄犬，随机分成Ａ、Ｂ、ＣＨ组，Ａ、Ｂ组各５只，为试验组，Ｃ组５４＇０Ｂ姐Ｖ－ＹＢ１只作为对照，Ａ组、犬用ＣＤ株的第９００５〇、１代次毒接种，接种剂量为ＴＣＩＤｓｏ／犬，Ｃ组接种灭菌生理盐水ＩｍＬ。２１ｄ后，Ａ、Ｂ、Ｃ组犬分别皮下多点注射和４＇－＾Ｃ日服ＣＤＶＹＢ株病毒１０ＩＤｍ／２１ｄ）犬，逐日观察试验犬临床症状和发病数，后剖杀全部试验犬，并观察病理变化。２０只１月齡犬随机分成Ａ组、Ｂ组、Ｃ组和Ｄ组，Ａ组、Ｂ组和Ｃ姐均５只，ＤＡ－组５只作为对照、Ｂ、ＣＶＹＮ的第９０、１０５、１１０，接，组犬分别用ＣＰ代次毒接种种４０２－剂量为１〇ＴＣＩＤＷ犬，Ｄ组接种灭菌生理盐水ＩｍＬ。１ｄ后，４组犬均皮下攻击ＣＰＶ４ＤＹＮ株第５代毒，攻毒剂量为皮下接种１０ｔＣＩＤ５〇／犬。攻毒后观察２１ｄ，记录临床保护数。取１月龄犬２０只，随机平均分成４组：Ａ组、Ｂ组、Ｃ组、Ｄ组，Ａ、Ｂ、Ｃ组各５Ａ－、Ｂ、Ｃ组犬分别用ＣＡＶＨ株病毒的第、、只为试验组，Ｄ组５只作为对照，７０９０３＇０１１０，代次毒接种，接种剂量为１〇ＴＣＩＤ５〇／犬，Ｄ组接种灭菌生理盐水ＩｍＬ。２１ｄ后３＇０Ａ－Ｈ株第５代Ｔ、Ｂ、Ｃ组犬和Ｄ组对照犬均皮下攻击ＣＡＶ毒，剂量为１〇ＣＩＤｓｏＺ犬。攻毒后观察２１ｄ，记录临床保护数。－１７－ 东北林业大学博±学位论文２．３实验结果２．３．１病毒分离结果－６３ｄ应用ＣＥＦ培养ＣＤＶＹＢ至第代在接种后时可见细胞圆缩，第４ｄ时可见细胞融合性变化，胞浆空泡化，部分细胞坏死脱落，再继续传３代后出现规律性细胞融合病变－ＹＮ至第７２ｈ。ＣＲＦＫ盲传ＣＰＶ５代时，于左右开始出现肿胀、圆缩、凝聚成团的病－－Ｈ接种ＭＤＣＫ单。，变，见图２２ＣＡＶ层后第２代细胞３化即开始肿大、变圆，逐渐ＰＥ－，４８ｈ７２ｈ可收获形成葡萄串状Ｃ。２．３．２病毒鉴定结果－上可见纤突样结构２．３．２．１电镜结果成熟的ＣＤＶＹＢ病毒粒子可见囊膜。电镜，囊膜负染观察病毒形态２－３Ａ。，可见典型的副黏病毒特征病毒粒子，见图在培养７２ｈ的ＣＰＶ－ＹＮ培养物负染电镜标本中，可见到多数为空芯，少数为实芯、直径为２０ｎｍ、呈２－Ｂ。电镜结果可２０面体圆形的细小病毒粒子，见图３见到典型腺病毒粒子，病毒呈对－Ｃ称结构，直径７０ｎｍ左右，表面无囊膜，在衣壳的顶端有时可看到纤维突，图２３。图２－２ＣＰＶ－ＹＮ第５代细胞病变结果Ｆ２－２ＰＥｏＰＶ（Ｐ５ｉｇｕｒｅＣｆＣａｓｓａｇｅ）Ａ：病毒感染细胞；Ｂ：正常细胞对照＇ＢＣ１．１端Ｗ議＾？扇ｗ—ｉＩ＾图２－２＾培养物电镜结果Ｆ２－２Ｔｈｅｒｒｕｓ化ｅｒｒｅｉｇｕｒｅｍｏｐｈｏｌｏｇｙｏｆ化ｅｖｉｂｙｅｌｅｃｔｏ打ｍｉｃｏｓｃｏｐＡ－ＹＢ－－：ＣＤＶＢ：ＣＰＶＹＮ；Ｈ；；ＣＣＡＶ－－－－２２２／Ｐ－ＬＡＭＰ鉴４．３．．ＲＴＰＣＲＣＲ及ＲＴ定结果扩增得至（目的片段，图２。Ｊ图２７２２－．３．．３ＣＤＶＹＢ株Ｈ基因遗传演化分析结果显示序列测定及遗传演化分析结果，该－－－分离株的基因亚型为ＡｓｉａＩ型２８。ＹＮＣＰＶ－，图遗传演化分析结果显示，ＣＰＶ株属于２ａ亚型２－９。，图２．３．２．４动物回归试验结果ＣＤＶ－ＹＢ接种的犬均发病，主要表现为体温升高，精神沉郁、食欲减退、消瘦，并出现结膜炎－。、腹湾及神经症状，详细表２５－－１８ ２ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研巧２Ｗ０ｂＰ２－０００ｂｐＳ‘—‘：一｜｜＾＾＾聯．；ｗｏｏｂｐ１０００＞：＿如ＭＷＷ養；；ｍ｜５｜’－通働厂韻巧ｐＩ驟辭倒２５０ｂｐ２５０ｂ－ｐ，：＾＾＾＾＾ｇｌｏｏｂ＇ｐｓ１００ｂ广Ｌ，－．！遙井ｍｕ图２－４ＲＴ－ＰＣＲ鉴定结果图２－５ＲＴ－ＬＡＭＰ鉴定结果Ｆｉｕｒｅ２－４ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＤＶＲＴ－ＰＣ民Ｆ－－ｂｙ２５ｎｔｉｆｉｃａｏｎｏｆＣＤＶ民ＴＬＡＭＰｇｉｇｕｒｅＩｄｅｔｉｂｙ１２：ｎｄｅｒｏｏ：分离株Ｏｓｒｔ株阳性对照；２０００ｒｋ，３：４：；仰１ＤＬＭａｅｒ；２阴性对照；组织３４：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ６６９：阴性对照；５：代培养物；第病料；第；代培养物１２３＇＇－－－２０００ｂｐＱＢ１２０００ｂｐ＾＾＾｜ｌｉｐ％！——ｌＯＯＯｂｐｍｉｌｌｌｌｌｌｌｌＯＯＯｂｐｌＯＱＯｂｐ働—５００ｂｐ５００ｂｐ－２５Ｇｂ２５Ｇｂｐｐ２５０ｂｐ瓣Ｊ｜＾＾＾藝ｊ￣辛靈。。ｌＯＯｂｔｌＰ＊細１屯．．Ｉ－２６ＶＰＣ民扩－Ｃ民图ＣＰ增鉴定结果图２７Ｐ扩增的电泳鉴定－Ｆ－ｉｕｒｅ２６ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＰＶｂＰＣ民ＦｉｉｆｉｃａｉＣＡＶＰＣ民ｇｙｇｕｒｅ２７Ｉｄｅｎｔｔｏｎｏｆｂｙｌ，ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋ巧２，阴性对照；Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：阳性对照；２和４；，．３ＣＰＶ－ＣＡＶ－，扩增结果ＣＡＶＩ分离株３：阴性对照５；ＩＩ对照；；表２－５动物回归试验结果Ｔａ２－５Ａｎｍａｃｈａ－ｂｌｎｘｎｆＹＢｌｅｉｌｌｅｇｅｅｐｅｒｉｍｅｔｏＣＤＶ犬号体湿升高精神沉郁食欲结膜炎腹泻脱水神经症状＋＋＋＋＋—１号犬＋２＋＋＋—＋＋＋号犬一注，：＋代表出现临床症状代表不出现临床症状ＣＰＶ－ＹＮ攻毒后犬出现精神不振、食欲减退、呕吐，发热，发病幼犬精神高度沉郁，食欲废绝，剧烈呕吐、腹泻，排出暗红色、有强烈腥臭味的粪便，严重脱水，体温７ｄ有２－稍高，第１只发病犬死亡，表６。剖检病死幼犬发现呼吸道卡他性病变、肠道粘、，屯脏肿大及脾脏病变膜出血、脱落，其他器官无特征性变化。对照组２只幼犬临床上－。无任何异常，表２７－９．１ 东北林业大学巧±学位论文，—２０ＧＱ３３２６３３１００１ＷＩ２４００３３２５３５｜？－ｉＩＨＵ１０６ＨＱ５４０２９３｜ＥＪＩ－ｐＨＵ３０８ＦＪ４０９４６＊巧１ＨＵ２－０７ＥＵＳ９３８Ｍｔ４ＧＯ３３２５３０巧＂Ｉｌ．５ＴＮＡＹ３ａ〇３４７＞．＾Ａｓ化－Ｉ＾？ＹＢｓｏ＊Ｈａｍｉ４ｃｖｎａＵｉ０８８７５ＩＴａｎｕｆｉ６ＡＢ０１６７７６－＾１１７ＧＱ３３２５３２ｊ—Ｉ９＆－００２ＡＢ０２５２７０ＩａｎｄａＧｉａｎｔＡＦ１７８０２８ｊｐ＞巧巧０６ＬＡＢ汾５４０６ＩＩ２６ＯＡＢ０４０７６０ｉＳＳｊｉＨＭ＜３Ａ百０４０７６７，〇〇Ｒ９ｆＪ８〇ｅｉ７４＞＇ＩＷ０ＦＪＭ８１巧Ａｓｉａ－口ＩｆＲ８ＦＪ８６８１７３９５￣Ｉ—Ｒ６ＦＪ８６８１＂ｓａｌｉ１６２ＲＩＩＦｊａｏａｉＴＯＪ５８０４ＡＦ３８６３１ＳｔｏｏＩ１扣ＩｉＳ８０４Ｐ１６ＡＹ３８６３Ｘ．？ｔｔ￣￣Ａｍｅｒｉｃａ－ｎＪＩＩ０１－２８４，ＡＹＳ３６４９６＾、Ａ７５／１７ＡＦｉＭｏｅｒＩ巧ＩＭ１１６？４０７１ＥＵ７ｉａ３３７「－ｂＵｒＯｅＴＯ０１２６８９ＡＹ６４？４４６ｐｊＩ１－－１０００１２６７６ＡＹ４０Ｍ９２ＩＧｒａｏｎｌａｎｄｉｃＺ４７７８０＼．？ＸＣ－ｌＣｌｅＣｏｍａｅ３５４，ＡｔｌｋＺ６３Ｉ？ｒｓｌ？Ｏｏ１Ｅ４３７３７ＯｉＫｌｐｉＵ１９６－２６Ｓ４４５ＡＹ４４９０７７１－，００１Ｉ０８２０５４１１叫ＡＹ４？ｅ〇Ｉ９８－２６４９＞ＡＹＳ４２３１２ＶａＣＣＵｉｅＳ巧ＬｅｃＭＫｔｏＥＦ４１８７８２Ｉｎ１６ＧＱ３３２５３１ＹｊＩＣＤＶ３４１００７７８９Ｉ＊ＣＯＶ３９７ＥＵ７２ｅ２６８２－８－图ＣＤＶＹＢ株Ｈ基因遗传演化分析结果Ｆｉ－８－ｇｕｒｅ２ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＨｅｎｅｏｆＣＤＶＹＢｓｔｒａｉｎｇ表２－６ＣＰＶ－ＹＮ株动物回归试验临床观察结果Ｔａｂ－ｍ－ｌｅ２６ＣｌｉｎｉｃａｌｓｙｐｔｏｍｓｏｆａｎｉｍａｌｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｂｙＰＶＹＮＣ犬号精神沉郁食欲不佳体湿升商呕吐腹湾脱水１＋＋＋＋＋＋２＋＋＋＋＋＋３＋＋＋＋＋＋４＋＋＋＋＋＋对照－—－＿——１对照２——————＋代表一注：出现临床症化代表不出现临床症状ＣＡＶ－Ｈ感染犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻流液、呕吐、排血便、呈双相热等临－。床症状，详见表２８剖检显示：呼吸道卡他性，并且在第７天１号和４号发病犬死亡病变、肠道粘膜出血、脱落，也脏肿大及脾脏病变，其他器官无特征性变化。对照姐２－只幼犬临床上无任何异常，详见表２９。－２０－ ２ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究巧￣—ＣＰＶ－４—ＣＰＶ邑Ｇ—ＣＰＶ－己ＱＩＬ＿＿．＿ＣＰＶ－ＨＳ广Ｉ－ＣＰＶ１０＾—ＣＰＶ－ＩＩ１２？—ＣＰＶＬＢＬＤ２ＣＰＶ－６「—￣ＩＣＰＶＳＩ－ＩＣＰＶ－７ＣＰＶ－１３厂Ｌ—￣Ｉ＇ＣＰＶ－ＹＮ—ＣＰＶＫ．０２６－ＣＰＶ２ＩＩ＇ＣＰＶＪＱ４？ＣＰＶＣＰＶ切巧点（１＇－ＣＰＶｄ２（）Ｉ９—ＱＥＪｉＩｉＥｔｓｅｒ■－ＣＰＶ１５ＣＰＶ－０８０５「Ｉ＇－ＶＬＣＰＶ１３０ＣＰＶ０６－０２２（Ｉ＇Ｖ－０ＣＰ７０６ＩｌＬＣＰＶＶ２０年ＶＰＳｌＩＩ－ＣＰＶＱＡ０９０９ＩＩ＇ＣＲＶｃａｔＳＯＣＭＧ＊－ＧＰＶ０５０１Ｉｊ＇ＣＰＶＲＤＰＶ一－＾ＣＰＶＤＨ３２６ＩＣＰＶ－ＳＣ－ＪＭ１。，０ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（Ｘ□）９诏２－９Ｖ－ＹＮ２图ＣＰ株ＶＰ基因遗传演化分析结果Ｆｕ－－ｒｅｅｎｅＶＰ２ｏＰＶｎｉｇ２９Ｐｈｙｌｏｇｔｉｃｔｒｅｅｏｆｅｎｅｆ〔ＹＮｓｔｒａｉｇ表２－７ＣＰＶ－ＹＮ株的动物回归试验剖检结果－Ｔａｂ２ＲＰＶ－ＹＮｌｅ７ｅｓ山ｔｓｏｆａｎａｔｏｍｙｃｈａｌｌｅｎｅｂｇｙＣ犬号屯、脏病变肠道出血肝脏病变脾脏病变呼吸道病变—＋—＿—１２＋＋—＋＋—＋——＋３４＋卡—＋＋对照—————１———对照２－三注一：＋代表出现临床症状，代表不出现临床症状表２－８ＣＡＶ－Ｈ株的动物回归试验临床症状结果－化ｍｓｃｈ－Ｔａｂｌｅ２８ＣｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｏｆａｎｉｍａｌｓａｌｌｅｎｅｂｙＡＶＨｐｇＣ犬号精神沉郁食欲不佳双相热呕吐腹泻眼鼻流液＋＋＋＋＋＋１２＋＋＋－＋＋＋＋＋＋＋—３＋＋＋＋＋＋４—————对照—Ｉ对照２－－－－－－＋一注：代表出现临床症状，代表不出现临床症状－２－１ 东北林业大学博±学位论文表２－９ＣＡＶ－Ｈ株的动物感染试验剖检变化Ｔ２－民ｌ－ａｂｌｅＨｌｅ９ｅｓｕｌｔｓｏｆａｎａｔｏｍｙｃｈａｎｅｂＣＡＶｇｙ犬号也脏病变肠道出血巧脏病变脾脏病变呼吸道病变———一１＋２＋＋—＋＋—＋—一＋３４＋＋—＋＋一一———对照１对照２—￣——二注一：＋代表出现临床症状，代表不出现临床症状２．３．３病毒致弱及免疫效力研究结果２．３．３．１弱毒株的培育及形态学观察ＣＤＶ第１０５代毒电境观察可见到典型副黏病毒粒－－－，直径为１００３００ｎｍ．．０ｎｍ，子，表面有厚约７５８的双层轮廓的囊膜内部由直径约１５－Ａ－１７ｎｍ拉链状核衣壳螺旋体构成。图２１０。ＣＰＶＹＮ第９０代毒负染电镜标本中，可见到多数为空芯，少数为实忘、直径为２０ｎｍ、呈圆形的病毒颗粒，未观察到其它病毒的－－存在，图２１０Ｂ。ＣＡＶＨ第１１０代毒株负染电镜标本中，可见到典型腺病毒粒子团，单个病毒呈２０面体对称结构，直径７０ｎｍ左右，表面无囊膜，但有整齐排列的壳粒，见２－图１０Ｃ。＾＇＾－１，碱ＡＩ广？ＪＪＰ禱議細—Ｉ扔吊ｒ＇ａＨ——＇＿—图２－１０病毒粒子电镜结果图－Ｆｌｉｕｒｅ２１０Ｔｈｅｍｏｒｈｏｏｏｆｈｅｖｉｒｕｓｅｇｐｇｙｔｓ－－－Ｈ株第Ａ：ＣＰＶＹＢ第１０５代目：ＣＰＶＹＮ９０：ＣＡＶ１；第代；Ｃ１０代２－．Ｓ．３．２病毒含量测定结果随着传代次数的增加ＣＤＶＹＢ株的第６、１０、２０、３０、５０、７０、１、１上升趋势２－１。、９００００５代次毒的病毒含量基本呈，表０随着传代次数的増Ｖ－ＹＮ的第５力口，ＣＰ、１０、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、１０５、１１０代次毒的病毒含－１１－量基本呈上升趋势，表２。随着传代次数增加，ＣＡＶＨ越来越适应ＭＤＣＫ细胞，第－５、１０、２０、３０、５０、７０、９０、１１０代次毒的病毒含量也逐渐升高，表２１２。２－表１０病毒含量测定结果ｂ－－２０ＶｉｉｅＴａｌｅ１ｒｕｓｔｔｒｏｆＣＤＶＹＢ－２０３０５０７０９０ＣＤＶＹＢ代次６１０１００１０５＾°＾＾＾＾＾＾Ｓ＇？＾＾Ｓ？Ｓ？ｓ＊ＴＣＩＤ／Ｏ．１０ＩＱＩＱｉ〇ｓｏｌｍＬ１０１０１０１０ｉｑ－２２－ －、鉴定２ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ的分离、致弱及免疫效力研巧表２－Ｈ病毒含量测定结果Ｔａｂｌ２－ＨＶＶ－ｅｉｒｕｓ化ｅｒｏｆＣＰＹＮ代次５１０２０３０５０７０８０９０１００１０５１１０＾＾＾＾＾＾＾°。＇］＾＾＾＾６ｓｓ＾°６７＇＇ＴＣＩＤｏ／Ｏ．ｌｍＬ１０１０１０１０ｌＯ１０１０ｌ〇ｉｃｆｌ〇ｌ〇ｓ２－表１２病毒含量测定结果－ｍｓ－Ｔａｂｌｅ２１２Ｖｉ化ｅｒｏｆＣＡＶＨ－５ＣＡＶＨ代次１０２０３０５０７０９０１１０＾°：＇］＾＾＂＾°＾＾＾°，＇。ＴＣＩＤｓｏ／Ｏ．ｌｍＬ１０ｌＯ１０ｌＯ１０１０１０ｌＯ２Ｖ．３．３．３不同代次病毒序列测定对ＣＤ第６、８９、９０和１０５代次病毒的Ｈ基因，对ＣＰＶ第５５０ＶＰ２基因ＡＶ－Ｉ、４９、和１１０代和Ｃ的第５、６９、７０和１１０代Ｆ化ｒｅ基因序－－－，２２列进行测定并对推导氨基酸序列进行了比对分析，图１１２１２１３。，和？２０＊４０＊６０＊８０ＤＶ－ＹＢ６：ＱＣ＿ＣＤＶ－ＹＢ８９：Ｑ＿ＤＶ－ＹＢ９０：Ｃ—ＤＶ－ＹＢ〇５；Ｃ＿］？００＊２０＊０＊？１１１４１６０ＤＶ－ＹＢ６：ＳＣ＿ＤＶ－ＹＢ８９：Ｃ＿Ｓ－ＣＤＶＹＢ９０：Ｅ＿－ＣＤＶＹＢ１０５；Ｅ＿８０＊２朋＊２２０＊２？２如１４０－ＣＤＶＹＢ６：Ｙ＿－ＤＶＹＢ８９：ＹＣ—－ＣＤＶＹＢ９０：Ｔ＿ＣＤＶ－ＹＢＯＳＪ：Ｔ？２如＊３００＊３２０＊３０４ＣＤＶ－ＹＢ６：ＴＳ＿－ＤＶＹＢ８９：ＴＳＣ＿ＣＤＶ－ＹＢ９０：＿ＤＶ－ＹＢ１０５：Ｃ＿？３６０？３８０＊４００＊２０＊４ＣＤＶ－ＹＢ６：ＶＲＰ＿－ＤＶＹＢ８９：ＣＶＲＰ—ＣＤＶ－ＹＢ９０：＿ＣＤＶ－ＹＢ１０５：＿４４０＊４６０＊４如＊５００＊５２０－ＣＤＶＹＢ６：Ｓ＿ＣＤＶ－ＹＢ８９：Ｓ＿－ＣＤＶＹＢ９０：Ｓ＿ＳＤＶ－ＹＢ１０５：ＳＳＣ－＊５４０＊５如＊５８０＊６００ＣＤＶ－ＹＢ６－：Ｓ＿ＤＶ－ＹＢ８９－ＣＳ—：－－ＣＤＶＹＢ９０Ｓ．＿：Ｎ－－ＶＹＢ０５：．ＣＤ＿１ＳＮ２－ＣＤＶ－ＹＢ６８９留Ｈ第、９０１化、和代巧巧基货差异－－Ｆ．１ｅｒｅｎｃｅｏｆｅｂｅｅ州ｓｓａｇｅ６ｎ－ｉｇ２１ＤｉｆｆＨｇ州ｔｗ阳，８９，９０ａｄ１０５ｏｆＣＤＶＹＢ－２３－ 东北林业大学博±学位论文２－？义义４不同ＣＤＶＹＢ株从６代到７０代对犬仍有致代次毒株致弱评价结果第第病力，但从第１０代开始死亡率降为０，从第９０代开始对犬的致病力和发病率均为０，因此将－ＣＤＶＹＢ株的９０ＣＤＶ－ＹＢ民２－３－。ＣＰＶ第代毒确定为致弱候选毒株，命名为犬株，表１ＹＮ株经ＣＲＦＫ传代后对犬的致病力逐渐减弱。在传至第５０代时，试验犬无发病和死－－亡２１４。ＣＡＶＨＭＤＣＫ传代后对。Ｃ－，表毒株经犬的致病力逐渐减弱ＡＶＨ第５代到第５０代次毒对犬的致病力由１００％降到２０％，死亡率由４０％降至０，发病犬出现体湿升°４１Ｃ左右－、呕吐、腹泻ＣＡＶＨ从２０代高，平均在等临床症状；次Ｗ后的代次致病力下－降，在７０代到１１０代对犬的致病力和死亡率均为０，对照犬均正常，表２１５。＊２０幸４０＊６０？如ＣＰＶ－ＹＮ５：Ｔ＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：Ｔ＿ＣＰＶ－ＹＮ５０：＿ＣＰＶ－ＹＮ０：＿１１＊１００＊１２０＊１４０？１６０ＣＰＶ－ＹＮ５：Ｔ＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：Ｔ＿ＣＰＶ－ＹＮ５０：＿ＣＰＶ－ＹＮＩ０：＿１＊１８０＊２００＊２２０？２４０ＣＰＶ－ＹＮ５；＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：＿ＣＰＶ－ＹＮ：．．．．Ｙ－５０－ｃｐｖＹＮｎｏ；．．．ｙ＿＊＊＊＊２６０２８０３００３２０ＣＰＶ－ＹＮ５：Ｇ．．．．Ｙ＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：Ｇ．．．．Ｙ＿Ｃ－ＰＶＹＮ５０：Ｓ—－ＣＰＶＹＮＵ０：Ｓ＿＊３４０＊说０＊３８０＊４００ＣＰＶ－ＹＮ５：＿－：ＣＰＶＹＮ４９＿－ＣＰＶＹＮ５０．．．：Ｙ＿－ＣＰＶＹＮ１．．１０：Ｙ＿＊＊＊？４２０４４０４６０４８０ＣＰＶ－ＹＮ５：＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：＿ＣＰＶ－ＹＮ５０：＿ＣＰＶ－ＹＮ１１０：＿＊＊＊５００５２０５４０？５６０ＣＰＶ－ＹＮ５：＿ＣＰＶ－ＹＮ４９：—ＣＰＶ－ＹＮ５０：－ＣＰＶ－ＹＮＵＯＪ：＊５８０—ＣＰＶ－ＹＮ５：－ＣＰＶ－ＹＮ４９－：—ＣＰＶ－ＹＮ５０－：—ＣＰＶ－ＹＮｏ－：—ｎ２－－困１２ＣＰＶＹＮ第５、４９、如和ｎｏ代毒巧基巧差算Ｆ－ｅｏｆ件２ｇｅｎｅｂｅｔｗｅ州ｐａｓｓａｇｅ５－ｉｇ．２口Ｄ如加．ｉｆｆｅｒｅｎｃ，４９？ｄ１１０ｏｆＣＰＶＹＮ－２４－ ２ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ的分离、致弱及免疫效力研巧、鉴定表２－１３ＣＤＶ－ＹＢＲ株致弱评价试验＇Ｔａｂｅ２－１３ＡｎｕａｅｄｅｖａｕａｎＤＶ－ＹＢｌｔｔｅｔｌｔｉｏｏｆＣ组别代次接种剂量发病率（％）死亡率（％）＾＾１６ｌＯＴＣＩＤｓｏ６０（３／５）２０（１作）＂２１０１０ＴＣＩＤｍ）６０（３作）０（（Ｖ５）＂３２０１０ＴＣＩＤ５０４０（２／５）０（０／５）＂４３０１０ＴＣ瓜５０４０（２作）０（（Ｖ５）＂５５０１０ＴＣＩＤｍ）２０（１巧）０（（Ｖ５）５５６７０１〇了０瓜扣２０ａ巧）０（（Ｖ５）５５７９０１〇ｔＣＩＤ５〇０（０／５）０（０／５）５５８１００１〇ｔＣＩＤｍ）０（０／５）０（０／５）５５９１０５１〇ｔＣＩＤ０（０／５０（０５）５〇）／－Ｌ理盐水１０（对照）Ｉｍ生０Ｗ５）０（０／５）２－－表１４不同代次ＣＰＶＹＮ株毒力试验Ｔ－－ａｂｌｅ２１４ＶｉｒｕｌｅｎｃｅｏｆＣＰＶＹＮｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｓｓａｅｐｇ沮别代次接种剂量发病率（％）死亡率（％）＾＾５ｌＯ１１ＴＣＩＤｓｏ００Ｗ５）４０（２／５）＂２１０１０ＴＣＩＤ５０１００Ｗ５）４０（２店）＾３２０ｌＯＴＣＩＤｓ。８０（４巧）２０（１Ａ５）＂４３０１０ＴＣ阻５０６０（３／５）２０（１作）＾＾５５０ｌＯＴＣＩＤ０（０／５）０（（Ｖ５）ｓｏ＾６７０ｌＯＴＣＩＤｓｏ０（０／５）０（（Ｖ５）＾＾７８０ｌＯＴＣＩＤｓｏ０（０／５）０（（Ｖ５）５５＇８９０１〇ｔＣＩＤ０（０／５）０（０／５）５〇＂９１００１０ＴＣ阻０（０／５）０（（Ｖ５）５０＾１０１０５ｌＯＴＣＩＤ０（０／５）０（０／５）ｓｏ＂１１１１０１０ＴＣＩＤ０（０／５）０（０／５）５０１２（对照）ＩｍＬ生理盐水０（０／５）０（０／５）２．３．３．Ｓ不同代次弱毒株免疫效力结果ＣＤＶ－ＹＢ艮株免疫组（Ａ和Ｂ组）犬在接种后２１ｄ，皮下攻同源强毒，观察２１日无发病现象，也无死亡发生。而对照组（Ｃ组）犬则有１００％发病，死亡率为６０％。发病°Ｃ－犬表现为体温升高可达到４１、结膜炎、腹湾、抽搖等临床症状，详见表２１６。－ＣＰＶＹＮ株免疫组犬在接种后２１山皮下攻击同源强毒，观察２ｄ无发病现象，也无１死亡发生。而对照组犬则有１００％发病，死亡率为４０％。发病犬表现为体温升高、呕－吐、排番茄汁样便等临床症状，见表２１７。－－（Ａ、、ＡＶＣＡＶＨ株免疫组ＢＣ组）犬在接种后２１日，Ｈ株第５代毒皮下攻Ｃ，观察２１日无发病现象，也无死亡发生。而对照组（Ｄ组）犬则有１００％发病，死亡率为－２５－ 东北林业大学博±学位论文４０％－。发病犬表现为体温升高、鼻流清液和排稀便等临床症状，表２１８。？２０＋４０＊６０＊如ＣＡＶ－Ｈ５：Ｆ－ＣＡＶ－Ｈ６９：Ｆ—－ＣＡＶＨ７０：Ｎ—ＣＡＶ－Ｈ１１０：Ｎ－丰１００＊１２０？１４０？１６０ＣＡＶ—５Ｈ：—－ＣＡＶＨ：－６９ＣＡＶ－Ｈ７０：—ＣＡＶ－Ｈ１１０：＿？１８０＊２００＊２２０＊２４０ＣＡＶ－５Ｈ：Ｇ＿－６９ＣＡＶＨ：Ｇ＿ＣＡＶ－７０Ｈ：＿ＣＡＶ－ｌ〇Ｈ：＿ｌ？２６０？２８０＊３００＋３２０－５：ＣＡＶＨ＿－ＣＡＶＨ６９：＿－ＣＡＶＨ７０：－－ｏＣＡＶＨｎ：—？３４０＊３６０？３８０＊４００－ＣＡＶＨ５：－－ＣＡＶＨ６９：＿－：ＣＡＶＨ７０＿—：ＣＡＶＨｌｌＯ－？４２０＊４４０？４６０幸４抓ＣＡＶ－Ｈ５：－－ＣＡＶＨ６９：＿－ＣＡＶＨ７０；＿－ＣＡＶＨ１：１０＿？５００？５２０＊５４０—ＣＡＶＨ５；—－ＣＡＶＨ６９：＿ＣＡＶ－Ｈ７０：－－ＣＡＶＨｌｌＯ：－图２－－１３ＣＡＶＨ第５、６９、７０和１１０代巧纤突基因安基酸差异－－Ｆ．ｅｒｅｎｃｅｏｆＦ化ｒｅｎｅｅｅｎ朗ｎ．ｉｇ２１３Ｄｉｆｆｇｅｂｅｔｗｐａｓｓａｇｅ５７０ａｄ１１０ｏｆＣＡＶＨ，，２－－表１６ＣＤＶＹＢＲ株免疫效力试验Ｔａｂ－－ｌｅ２１６ＩｍｍｕｎｅｅｆｉｃａｃｙｏｆＣＤＶＹＢＲ组别接种剂量攻毒剂量发病率（％）死亡率（％）４０＂Ａ组（９０代）１０ｔＣＩＤ５０／犬１０了（：瓜５〇／犬０（（Ｖ５）０（０／５）４°４°Ｂ组（１０５代）１０ＴＣＩＤ５０／犬１０ＴＣＩＤ５０／犬００／５００／５（）（）Ｃ（对照组）ＩｍＬ生理盐水ＩｍＬ／犬１００５店６０３巧（）（）－２６－ ＤＶ－２Ｃ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究－表２－１５不同代次ＣＡＶＨ株的致弱结果Ｔ２－－ａｂ１５ＶｒｏＣＡＶＨｎｅｒｅｎａｓａｅｌｅｉｕｌｅｎｃｅｆｉｄｉｆｆｔｐｓｇ组别代次接种剂量发病率（％）死亡率（％）５．５１５１〇了仁１〇１００（５／５）４０（２／５）５〇＾＾２１０ｌＯＴＣＩＤｓｏ１００Ｗ５）４０（２＂）＾＾３２０ｌＯＴＣＩＤ４０（２２０（１）ｓｏ／５）伯＾＾４３０ｌＯＴＣＩＤ４０（２／５）０（０／５）ｓｏ５＇５５５０１〇ｔＣ瓜２０（１／５）０（０／５）５０５＇５６７０１〇ｔＣＩＤ５〇０（０／５）０（０／５）Ｓ＇Ｓ７ＩＱｔＣＩＤ（）（／５９０ｓｏ００／５００）５－５８１１０１〇ｔＣＩＤ〇０（（Ｖ５）０（０巧）ｓ一盐水９（对照）ＩｍＬ生理０（０／５）０（０／５）－表２－１７ＣＰＶＹＮ株免疫效力试验－Ｔａｂｅ２－１７Ｉｍｍｕｌｎｅｅ街ｃａｃｙｏｆＣＰＶＹＮ组别接种剂量攻毒剂量发病率（％）死亡率（％）４４°Ａ组９０代次１〇叶ＣＩＤ／１０ＴＣ阻００／５０（Ｖ５ｓｏ犬５０（）（）４０４°Ｂ组１０５代次１０ｔＣ瓜／１０ＴＣ阳０（Ｖ５０（Ｖ５５〇犬５０（）（）４４°Ｃ组１１０代次１〇叶ＣＩＤｍ）／犬１〇ＴＣＩＤｓ〇０（（Ｖ５）０（Ｖ５（）４＊＊Ｄ（对照组）ＩｍＬ生理盐水１０ＴＣＩＤ１００Ｗ５）４０（２／５）／犬ｍ）表２－１８不同代次ＣＡＶ－Ｈ株的免疫效力试验结果Ｔａｂ－－ｌｅ２１８ＩｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＣＡＶＨ姐别接种剂量攻毒剂量发病率（％）死亡率（％）４０３０Ａ（９０代）１０ｔＣＩＤ５０／犬１０ｔＣＩＤ５００（０／５）０（０／５）４°３Ｂ（１００代）１０ＴＣＩＤ／１〇叶ＣＩＤ０（０／５）０（０／５）５０犬ｓｏ４３°Ｃ（１１０）１〇叶ＣＩＤ／１０ＴＣ瓜０（０／５）０（０／５）代ｓｏ犬５０３＇０Ｄ（对照组）ＩｍＬ生理盐水／犬１０ｔＣＩＤ５０１００（５／５）４０（；２／５）２．４讨论ＣＤ、ＣＰＶ病及ＣＡＶ病是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。经常引起大批动物发病死亡，经济损失惨重。包括大熊猫、小熊猫Ｗ及狮、虎和豹等食肉目所有８个科、偶蹄目猪科、灵长目的縣猴属和錯足目海豹科等多种动物均有感染ＣＤ的报道，发病率可达１００％，病死率达８０％。对于大熊猫，目前全世界野生不足１６００只，其安全也越来越受到威胁。２００７年，国内首次出现ＣＤ临床感染报道。２０１４年９月，陕、西省珍稀野生动物抢救饲养研究中屯，接连出现４只大熊猫感染ＣＤ死亡。ＣＰＶ病可引－起犬出血性肠炎与也肌炎。１９８４年２００９年先后从我国上海、桂林、哈尔滨、郑州、长春和北京等地的虎、狮、果子狸和猴等动物体分内离获得病毒，经鉴定除果子狸源病毒－２７－ 东北林业大学博±学位论文，虎，猴源病毒为变异细小病毒为犬细小病毒和狮源病毒为细小病毒。ＣＡＶ病不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和镜熊等动物中。截至２００４年底，我国家养宠物达８０００万只，而且还在不断增加。我国毛皮动物的养殖主要集中在山东１０００万、河北、迂宁和黑龙江等地。目前，我国狐狸的饲养量达只，水貂７００万只，絡１００万只，年产水貂皮６００万张、狐狸皮２００万张，其中狐狸皮占世界总产量３５％，水貂皮占世界总产量的１２％。因而疫苗的市场需求将非常巨大，应用前景十分广阔随着野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密切，因此増加了人类感染动物源性，加强对犬疾病的潜在风险。因此、毛皮动物和野生动物主要疾病的防控是当务之急。疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施。当前，广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用，但是还时有疫情发生的报道。除去母源抗体和其它病毒干扰、疫苗效价及使用，疫情是否由病毒变异株出现引起亟需验证不当外等原因外。同时，目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品，，毒种背景不清Ｗ及在细胞上传代次数较多免疫原性，研制适合国内流行毒株的疫苗己迫在眉睫和安全性均难得到保证。因此。ＣＤＶ对环境光和热都敏感，因此野毒株很难分离成功。目前用于ＣＤＶ分离的的主要包括原代细胞和传代细胞系：。原代细胞主要包括犬和貂的肺巨唆细胞、外周血淋巴细胞、肾细胞、鸡成纤维细胞。其中＾＞鸡成纤维细胞最为常用。传代细胞系主要包括：ｅｒｏ－ＭＤＧＫ、Ｖ、Ｂ９５ａ、ＨＥＰ２、祀、Ｈｅｌａ和ＲＫ１３等。有用动物的肺巨喧细胞成功分离ｉｓｆｗＣＤＶ的报道，又有研究报道Ｖｅｒｏ细胞是分离ＣＤＶ的敏感细胞系我们采用ＣＥＦ细胞，在３３Ｃ低温条件下成功分离ＣＤＶ。ＲＴ－ＰＣ民鉴定结ＤＶＴ－形态学鉴定和果证实分离毒毒株为Ｃ，经过ＲＬＡＭＰ和动物回一归试验等进步鉴定，确认分离株为ＣＤＶ野毒株。对Ｈ基因全长序列分析显示：该毒株与目前广泛应用的商品化疫苗株Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株、Ｌｅｄｅｒｌｅ株、ＣＤＶ３株和Ｃｏｎｖａｃ株－，９１４％处于不同分支且核巧酸序列同源性在９０．２％．之间。ＤＶ－ＹＢ连ＣＥＦ７０代，ｅｒｏ２０分离的Ｃ续接种传至后在Ｖ细胞上传代，么后继续在１－ＣＥＦ连续传代至０５代，我们通过对病毒的形态进行了鉴定发现，分离的ＣＤＶＹＢ株传代稳定，病毒的形态未发现改变和异常。对传代的病毒进行的病毒含量测定试验我们发现，病毒的滴度整体上呈上升趋势，说明毒株较适应细胞。致弱评价试验结果中ＣＤＶ－ＹＢ株从第６代到第７０代毒对犬的发病率和死亡率呈明显的下降趋势，发病率从第６代的６０％到第９０代开始发病率降为０；接种犬的死亡率从第６代的２０％到第１０代ＤＶ－ＹＢ株第９０代和第５降为０。Ｃ１０代的免疫效力试验中，两代毒均对强毒的攻击提供－了良好的保护效果。通过１＾上试验数据充分说明了ＣＤＶＹＢ株已经致弱，可Ｗ作为疫苗株使用。研巧表明，ＣＰＶ在ＦＫ８１细胞中增殖后可引起圆缩、脱落等，而在ＭＤＣＫ、［＂８］ＢＨＫ２１、Ｖｅｒｏ细胞及ＣＥＦ细胞中生长时不能观察到明显的ＣＰＥ。本研究曾选用ＭＤＣＫ细胞和Ｖｅｒｏ细胞进行病毒分离，但效果不理想，后选用ＣＲＦＫ细胞分离，则可一见明显的细胞病变，与之前的研究结果致究其原因可能是因为ＣＰＶ对不同细胞－２８－ ２Ｃ－ＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ的分离、鉴定、致弱及免疫效力研充系的敏感性不同造成的。ＣＰＶ完全依赖宿主细胞ＤＮＡ的复制机制进行复制，病毒的接ｔｗｗ。－种最好采用同步接种方式本研究将ＣＰＶＹＮ株同步接种ＣＲＦＫ，ＣＰＥ出现比较规律，即接毒后７２ｈ，细胞开始圆缩、凝集成団。有研究发现接毒的猫皆细胞培养物与兔抗ＣＰＶ高免血清，按５化１的比例混合，容易观察到凝集的免疫复合体。如果不加高免血清而单纯负染观察，只能观察到单个粒子一－３个粒起，，或２子集在，并且很难找到。即使找到病毒粒子也很难确认。可Ｗ肯定血清猫肾细胞培养中含有大量的ＣＰＶ粒子，兔抗ＣＰＶ高免５０倍稀释为宜，这给其ＵＷ它血清学检测方法提供了参考依据。形态学鉴定、ＰＣＲ鉴定和动物回归试验等鉴定，确认分离株为ＣＰＶ野毒株。测得ＶＰ２基因全长部分序列，与ＧｅｎＢａｎｋ参考序列比－－，该毒株ＣＰＶＹＮ株与ＣＰＶ２ａ亚型中国野毒株核昔酸同源关系较近对发现，可达到９９．５％ｔＵ上，而与商品化疫苗株（Ｍｅｒｉａｌ株和Ｐｆｉｚｅｒ株）核巧酸同源性在９８．５％左右。ＣＰＶ２ａ、化和２ｃ亚型的分型主要依据ＶＰ２基因佔６位氨基酸位点，即４２６位为Ａｓｎ即为２ａ亚型Ａｓ２ｂ亚型Ｇ２ｃ－ｌｕ即为亚型。本研究的ＣＰＶＹＮ株ＶＰ２基因为；ｐ即为；Ａｓｎ，显示该毒株为ＣＰＶ２ａ亚型。－ＹＮ株接种ＣＲＦＫ将ＣＰＶ０代，细胞连续传代至１１，在传代过程中病毒的滴度逐渐６提高到ｌ〇ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ。同时，ＣＰＶ对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表明，ＣＰＶ－ＹＮＲ可对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用，可作为理想的疫苗候选毒＾＾株。目前，细胞培养法分离和增殖腺病毒，比较容易常见。而细胞培养过程中，用水解，或在培养液中加入适量膜酶蛋白酶或膜蛋白酶处理病毒样品，则更有利于病毒在细胞ｉｗｔｉ单层上适应和增殖。我们应用同步接毒方法，并在吹打膜酶消化细胞块时对残留膜，并获成功酶不作彻底洗涂。微量膀酶残留，是否是病毒分离成功的主要因素，有待进１６３一［］步试验化明。－－ＣＡＶＩ和ＣＡＶＩＩ在Ｅ３区的开放阅读框架分别编码１９５个氨基酸和４２５个氨基酸的ＵＷ－－多肢，在Ｅ３区ＣＡＶＩＩ比ＣＡＶＩ多５００ｂｐ左右，据此我们设计用于亚型鉴定的扩增引物。形态学鉴定、ＰＣＲ鉴定和动物回归试验等鉴定，确认分离株为ＣＡＶ野毒株。－将ＣＡＶＨ株接种ＭＤＣＫ细胞连续传代至１１０代，，在传代过程中病毒的滴度逐渐７＇５提高到１０ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ。同时，ＣＡＶ对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表明，－ＣＡＶＨＲ可Ｗ对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用，可作为理想的疫苗候选毒株。４－ＣＤＶ攻毒剂量确定，：ＣＤＶＹＢ株１０ＴＣＩＤ５０攻击犬即可Ｗ使犬１０００％发病因此我４们将攻毒剂量定为１〇ＴＣＩＤｓ〇的第５代次种毒。ＣＰＶ攻毒剂量确定－：ＣＰＶＹＮ株的第３代和第５代毒的不同接种剂量，接种试验犬的４结果可ｙＸ看出，接种１０ＴＣＩＤ５０的剂量就可使犬８０％发病，依据试验结果，我们将攻４毒剂量定为１０ＴＣＩＤ５０的第５代次种毒。－ＣＡＶ攻毒剂量确定，：ＣＡＶＨ株的第５代和第８代毒的不同接种剂量接种试验犬的结果可３Ｗ看出，接种１０ＴＣＩＤ５０的剂量就可Ｗ使犬１００％发病，因此将攻毒剂量定为３１０ＴＣ瓜５０的第８代次种毒－我们对ＣＤＶＹＢ株第６、８９、９０和１０５代病毒的Ｈ基因进行测序，并推导其氨基酸序列，，比对结果表明：与第６代和８９代相比９０代病毒有１６处氨基酸发生变异，分别－２９－ 东北林业大学博±学位论文位于编码框的第３０、１５５、１６２、２２３、２３８、２７７、３０９、％７、４０１、４１５、４６７、４８７、５１７、５３０、５５０和６０６位，该变异稳定遗传至１０５代，由此可Ｗ推断，这些位点对病毒的致弱具有重要的贡献。ＣＰＶ－ＹＮ株，与第５代和４９代相比，１１０代病毒在致弱前后ＶＰ２氨基酸序列有７个位点发生变异，分别位于第４４、１０１、１６５、２９７、３００、３０５和３２４位，该变异可能导致。毒株的分子生物学特性发生改变，进而导致病毒毒为减弱ＣＡＶ－Ｈ株第７０和１１０代毒的氨基酸序列，我们发现，第５代和第的代核巧酸序列与第７０代和第１１０代纤突基因氨基酸序列在第１２、３２和２２８位发生变异。由此可能引起毒株的分子生物学特性发生改变，进而导致病毒毒力减弱。本研究中对Ｈ种病毒的部分基因片段进行了遗传分析，发现了致弱毒株与亲本野毒株在氨基酸位点上具有一些能够稳定遗传的变异，但这些位点对病毒致弱的贡献仍有一待进步深入研究。－３０－ ＣＤ－３、ＣＰＶ病和ＣＡＶ病吉联弱毒疫苗制备１３ＣＤＣＰＶ病和ＣＡＶ－Ｉ、病Ｈ联弱毒疫苗制备３．１实验材料与实验仪器３．１．１病巧和疫苗ＣＤＶ－ＹＢＲ株－－－－、ＣＰＶＹＮ反株和ＣＡＶＨ民株和效检用ＣＤＶＹＢ株、ＣＰＶＹＮ株和ＣＡＶ－Ｈ株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。ＣＲＦＫ细胞和ＭＤＣＫ细胞购自ＡＴＣＣＣＥＦ细胞有本实验室制备－；。ＣＤ、ＣＰＶ病、ＣＡＶＩ病Ｈ联活疫苗，批号分别为２０１２０５０１、２０１２０５０２、２０１２０５０３、２０１２０５０４和２０１２０５０５。ＣＤＶ单苗批号为２０１２０５０２５７５＇８（病毒含量为：１〇ｔＣＩＤｓ〇／头份）、ＣＰＶ单苗批号为２０１２０５０３（病毒含量为：１〇５＇８ＴＣＩＤｓｏ／头份）和ＣＡＶ单苗批号为２０１２０５０３（病毒含量为：１０ＴＣＩＤｓ〇／头份），均由本实验室制备。五联活疫苗：批号２０１２０７０２。３．１．２实验动物－１月龄健康比格犬（ＣＤ、ＣＡＶＩ病和ＣＰＶ病血清中和抗体均不高于１：２）购自广州医药研究总院有限公司实验动物研究开发中也。怀孕母犬购自广州医药研巧总院有限公司实验动物研究开发中屯、。３．１．３实验试剂ＭＥＭ，胎牛血清购自访ｂｃｏ公司；明胶购自Ｓｉｇｍａ公司：薦糖购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司。３．１．４实验仪器－抗生素玻璃加塞灌装机ＫＧＳ，冻干机，，八头单刀压盖机贴标机ＫＫＫ９１６等由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存提供。３．２实验方法３－．２．１ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ兰种病巧与稳定剂醒比的研究３．２丄１不同配比对病毒含量的影响５５ＴＣ一将ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ（均为１０ＩＤｓｏ／ｍＬ）等量混合与同灭菌容器内，然后分别按病毒液：稳定剂为７：１、８：１、９：１和１０：１的比例加入稳定剂（８％明胶和４０％庶糖），充分摇匀后，５头份规格分装。，冻干将按照不同配比的冻干疫苗取样，分别测定Ｈ种病毒的病毒含量－Ｍｕｅｎｃｈ法分别计算。疫苗用维持液做１０倍系列稀释，按ＲｅｅｄＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ的ＴＣＩＤｓｏ。３．２丄２不同配比的疫苗效力检验将７５只比格犬平均分为５组，每组１５只，其中４组为试验组，１组为对照组。将４批冻干后的疫苗分别肌肉接种１组试验犬，每犬１头份，试验组犬接种灭菌生理盐４０－－水，接种后２１ｄ（１ＴＣＩＤ／，免疫组连同对照组同时皮下攻击ＣＤＶＹＢ株Ｏ５〇犬）、ＣＰＶ４＇３＇０＾Ｃ－ＹＮ株（１０ＩＤ５／犬）和ＣＡＶＨ株（１ＯＴＣＩＤ／犬），连续观察２１ｄ，统计各组的发（５〇－３－１ 东北林业大学博±学位论文病及死ｔ情况。＝３．２．２联活巧苗安全性研究义２．２．１单剂量安全性试验３０只犬分成６组，每组５只，其中的５组为试验组，１组为对照组，免疫組每只犬接种１头份疫苗，对照犬肌肉注射相同剂量的生理盐水，各犬观察１４ｄ。Ｓ．２．２．２单剂量重复安全性试验在单剂量试验的基础上进巧单剂量的重复试验，即单剂量试验犬观察１４ｄ后，进行相同剂量第二次免疫接种，再观察１４ｄ。３．２．２．３大剂量安全性试验３０只犬分成６组，每组５只，其中５组为试验组，１组为对照组，免疫组每只犬接种１０头份，对照犬肌肉注射相同剂量的生理盐水，各犬观察２１ｄ。＝３．２．３联活疫苗对怀孕母犬的安全性研究义２．３．１单剂量安全性试验３０只怀孕母犬，分成６组，每组５只，其中５组为试验组，１组为对照组，免疫组每只犬接种１头份，对照犬肌肉注射生理盐水ＩｍＬ／犬，各组犬隔离观察２１ｄ。义２．义２单剂量重复安全性试验３０只怀孕母犬，分成６组，每组５只，其中５组为试验组，１细为对照组，免疫组每只犬接种１头份，对照犬肌肉注射生理盐水ＩｍＬ／犬，各细犬隔离观察１４天后，进行二。相同剂量第次免疫接种，再观察２１ｄ义２？义３大剂量安全性试验３０只怀孕母犬，分成６组，每组５只，其中５组为试验组，１组为对照组，免疫组每只犬接种１０头份，，对照犬抓肉注射相生理盐水ＩｍＬ／犬每组犬隔离观察２１ｄ。３．２．４兰联活疫苗《小免疫巧《研究．４义２．１样品的稀释５’０４＇０取２０１２０５０１批疫苗、细小病毒和腺病毒分别按照１〇ＴＣＩＤｍＬ、１〇，将ＣＤＶｓｏ／３＇〇ＴＣＩＤ／ｍＬ和１〇ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ进行稀释备用。ｓｏ义２．４．２动物分组６０只犬分为Ａ、Ｂ两个大组，Ａ组为试验组，Ｂ组为对照组，Ａ组４５只犬平均分为９组，每组５只，其中１、２、３组为ＣＤＶ不同接种剂量试验组；４、５、６组为ＣＰＶ不同接种剂量试验组；７、８、９为ＣＡＶ不同接种剂量试验组。Ｂ组１５只犬，平均分为３组，每组５只犬５０４０３０ＴＣ将稀释好的ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ分别１〇ＩＤｓｏ／ｍＬ、１〇ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ和１〇ＴＣＩＤＷｍＬ剂量肌肉接种１月龄犬，ＩｍＬ／犬，每个剂量接种５只幼犬，同时每组设对照犬５只，肌肉注射生理盐水ＩｍＬ。４０日服ＣＤＶ－ＹＢ犬免疫后２１ｄ后，ＣＤＶ组皮下多点和株，１ＯＴＣＩＤ５〇／犬；ＣＰＶ４０３＇Ｄ组＾１〇－了（：阻５〇／犬的剂量接种ＣＰＶＹＮ株强毒ＣＡＶ组＾ｎ０了（：圧）／犬的剂量接种；ｌ５〇ＣＡＶ－Ｈ株强毒。－３２－ ３ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶ－Ｉ病Ｈ联弱韋疫苗制备３．２．５Ｈ联活疫苗免疫持续期研究３．２．５．１动物分组与免疫４一组为试验组一９０只犬，平均分为两组５，，组为对照组姐和对，每组只，试验照组的４５只犬在免疫后平均分为３组，每组１５只。将试验组幼犬分别肌肉接种疫苗１头份，对照组幼犬注射生理盐水ＩｍＬ／犬。３．２．５．２攻毒实验试验组和对照组犬分别在免疫后第５、６、７月进行ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ的强毒攻４＇ｇ４＇ｇ３＇〇击，攻毒剂量分别为ｃｄｖｉ〇ｔｃｉｄ５〇／犬；ｃｆｖｉ〇ｔｃｉｄ５〇／犬；ｃａｖｉ〇ｔｃｉｄ５〇／犬，１。各组犬均隔离饲养，观察２ｄ，记录各组犬的发病及死ｔ情况３．２．６Ｈ联活疫苗与各单苗的免疫效力比较３．２．６．１ＣＤＶ效力对比试验免疫接种：将１５只随化分为３组，每组５只，分别为单苗组（ＣＤＶ单苗，１头份／Ｉ犬）、联苗组（Ｈ联苗，１头份／犬）和对照组（生理盐水ｍＬ／犬。，）４Ｄ－ＹＢＣＤＶ攻毒：犬免疫后２１ｄ，皮下攻击ＣＤＶ株（１０ｔＣＩＤ５〇／犬）。抗体监测：在免疫前、免疫后第３、６、９、１２、１５、１８和２１ｄ和攻毒后第５、１０、１５和２１ｄ，分别采血，分离血清，测定血清抗体效价。３．２．６．２ＣＰＶ效为对比试验免疫接种：同３．２．６．１，其中单苗组替换为ＣＰＶ单苗，１头份／犬。４＇ＤＣＰＶ攻毒－：犬免疫后２１ｄ，皮下攻击ＣＰＶＹＮ株（１０ｔＣＩＤ５〇／犬）。抗体监测：同３．２．６．１。Ｂ．２．６．３ＣＡＶ效力对比试验免疫接种：同３．２．６．１，其中单苗组替换为ＣＡＶ单苗，１头份／犬。＾－ＨＣＡＶ攻毒：犬免疫后２１ｄ下攻击ＣＡＶＩＯｔＣＩＤ。，皮株（ｓｏ／犬）抗体监测：同３．２．６．１。３．２．７Ｈ联活疫苗与同类商品苗的比较研究３．２．７．１安全性比较试验１０只犬，平均分成２组，每组５只。分别接种Ｈ联活疫苗和五联活疫苗，１０头份／犬。免疫接种后观察２１ｄ，记录试验犬的临床表现和发病及死ｔ情况。３．２．７．２免疫效力比较试验ＣＤＶ－ＰＢＳ、ＣＰＶ和ＣＡＶＩ含量测定：疫苗按说明书用稀释至使用浓度后，接种相ｅｅｄ－ｅｎｃｈ法计算ＴＣ应的敏感细胞，按ＲＭｕＩＤｓｏ。攻毒保护比较试验：４５只犬随机分成３组，每组１５只，其中２组为试验组，１组为对照组。２组试验组分别接种王联苗和五联苗（１头份／犬），对照组接种生理盐水１７－丫８－－〇１１１犬）。免疫２１天后，攻击£〇￥、£？￥＾株和０乂心１１［株。观察２１山记录各组犬的发病及死亡情况。３．２．７．３免疫持续期比较试验１３５只犬３组组４５只，２组为试验组１组为对照组。将２沮试验，平均分为，每，幼犬分别肌肉接种Ｈ联活疫苗和五联活疫苗１头份／犬，对照姐注射生理盐水ＩｍＬ／犬。－３３－ 东北林业大学博±学位论文试验组和对照组幼犬分别在免疫后第５、６、７个月后各取１５只犬，再将１５只犬平均分为３小组，进行ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ的强毒攻击试验，观察２１ｄ，记录各组犬的发病及死亡情况。３．２．７．４保存期比较试验‘Ｈ联活疫苗和五联活疫苗在－２０Ｃ下保存２４个月保存的第１２个月和第１８，分别在Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算各沮分的病毒含量。个月取样，按３．３实验结果３－．３１ＩＨ．ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ种病巧与稳定剂配比的研究结果３．３丄１不同配比对病毒含量的影响结果不同比例配比结果表明，配比按照９：１的比例冻干效果最好，病毒损耗最小，见表３－１。－表３１不同配比冻干前后病毒含量的测定结果Ｔａｂ－ｕｖｌｅ３１Ｖｉｒｓｔｉｔｅｒｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｌｉｅｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｉｆｅｗｎｔｒａｔｉｏ不同比例ＣＤＶ－ＹＢＲＣＰＶ－ＹＮＲＣＡＶ－ＨＲ＾＾＂＂ｌ化冻干前ＯＴＣＩＤｓｏ／Ｏ．ｌｍＬ１０ＴＣ瓜ＩｍＬ…ＴＣＩＤＷＯ．ＩｍＬ如４＇３４４４６ｌ〇ＴＣＩＤｓｏ／头份ｌ〇ＴＣ瓜５〇／头份ｌ〇ＴＣＩＤｓｑ／头份冻、＂４ｓ＊＆１８１０ＴＣＩＤ／〇ＴＣＩＤ１ＯＴＣＩＤ／：５０头份１ｓｐ／头份ｓｐ头份ｆ＂５＇＞５ｔｃ＊１９：１ｉｏｉｄ５〇／头份ｉ〇了（：圧）５〇／头份ｉ〇ｔｃ瓜５〇／头份＂４６４７１０１０ＴＣ阻ｓｏ／头份１〇ＴＣＩＤｓｏ／头份１〇ＴＣ瓜５〇／头份＾３．３．１．２不同巧化的疫苗效力检验结果研究结果表明，４批疫苗的免疫效力均符合质量标准要求，免疫组均未发病，对照３－２组全部发病，表。表３－２不同配比冻干的疫苗免疫效力测定结果ａｂ－ｍｍｕｎＴｌｅ３２Ｉｅｅｆｉｃａｃｒｏｆｃｏｉ打ｅｄｌｉｖｅｃｃｉｎｅｉｎｄｉｆｅｔｒａｔｉｏｙｍｂｖａｒｅｎ不同配比免疫数量发病数死亡数保护率７：１５０／５０／５１００％８：１５０／５０巧１００％９：１５０／５０／５１００％１０／：１５０５０／５１００％对照组５ｍ－屯３．３．２兰联活疫苗安全性研究结巧３．３．２．１单剂呈：安全性试验结果３－３免疫犬未见体湿升高、呕吐、腹泻和局部热反应等症状，见表。－３４－ ３－兰联弱毒疫苗制备ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病表３－３Ｈ联活疫苗剂单剂量安全试验ｂ－Ｔａｌｅ３３Ｓａｆｅｔｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｌｄｙｓｎｅｏｓｅｇ接种接种局部全身疫苗体温＋Ｄ批号呕吐腹毎减食犬数剂量反应反应吸收升高２０１２０５０１１５只头份无无良好无无无无２０１１２０５０２５只头份无无良好无无无无２０１２０５０３５只１头份无无良好无无无无２０１２０５０４５只１头份无无良好无无无无２０１２０５０５５只１头份无无良好无无无无对照５只１ｍｌ生理盐水无无良好无无无无￣￣３．３．２．２单剂量重复安全性试验结果３－４免疫犬未见体温升高，。、呕吐、腹湾和局部热反应等症状见表表３－４Ｈ联活疫苗单剂量重复安全试验Ｔａｂ－４ａｆｅｅｖａｕａｏｎｏｆｒｅｅａｍｎｓｒａｏｎｌｅ３Ｓｔｙｌｔｉｐｔａｄｉｉｔｔｉ接种接种局部全身疫苗体温－＊批号呕ｎｉ吐腹泻减食，，似＿＾犬数，齐０量反应反应吸收升局２０１２０５０１５只２头份（２ｍＬ）无无良好无无无无２０１２０５０２５只２头份（２ｍＬ）无无良好无无无无２０１２０５０３５只２头份（２ｍＬ）无无良好无无无无２０１２０５０４５只２头份（２ｍＬ）无无良好无无无无２０１２０５０５５只２头份（２ｍＬ）无无良好无无无无对照５只２ｍＬ生理盐水无无良好无无无无３．３．２．３大剂量安全性试验结果３－５免疫犬未见体温升島、呕吐、腹泻和局部热反应等症状，见表。表３－５Ｈ联活疫苗大剂量安全试验Ｔａｂ３－５Ｓａｆｅｌｅｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｈｉｈｄｏｓｅｇ疫苗接种接种全身疫苗局部体温収灶腹泻减食批号犬数齐。量反应吸收反应升高２０１２０５０１５只１０头份无良好无无无无无２０１２０５０２５只１０头份无良好无无无无无２０１２０５０３５只１０头份无良好无无无无无２０２０５０４０１５只１头份无良好无无无无无２０１２０５０５５只１０头份无良好无无无无无对照５只ｌＯｍＬ生理盐水无良好无无无无无３．３．３互联活疫苗怀孕母犬的安全性研究结果３．３．３．１单剂量安全性试验结果－３５． 东北林业大学博±学位论文－－、９只且均健活。免疫犬未见呕吐腹復等症状，平均产仔数在６，见表３６３－６表Ｈ联活疫苗怀孕母犬单剂量安全试验Ｔｌ３－６Ｓａｆｔｌｔｉｏａｂｅｅｙｅｖａｕａｎｏｆｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｈｉｒｅｔｄｏｇｓｐｇｎａｎ疫苗局部体温碱平均健？＆知社心化一，且接种犬数剂量呕吐腹泻批号反应升嵩食＾一产仔ｈ比例２０１２０如Ｉ５只７７／７１头份无无无无无２０１２０５０２５只１头份无无无无无８８／８２０１２０５０３５只１头份无无无无无６６／６２０１２０５０４５只１头份无无无无无６６／６２０１２０５０５５只１头份无无无无无９９／９对照５只ＩｍＬ生理盐水无无８８／８专至至３３３．２单剂量重复安全性试验结果免疫犬未见呕吐、腹湾、局部反应等症状，其中有１只犬巧在刚出生２天后因挤压－７窒息死亡，剖检无病理变化。对照犬均正常。见表３。表３－７Ｈ联活疫苗怀孕母犬单剂量重复安全试验ａｂ－Ｔｌｅ３７Ｓａｆｅｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｒｅｅａｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｒｅｎａｎｔｄｏｓｐｐｇｇ疫苗接种接种局部体温？Ｉ平均健活呕吐腹湾减食批号犬数剂量反应升高产仔比例２０１２０５０１５只共２头份无无无无无９９／９２０１２０５０２５只共２头份无无无无无８８／８２０１２０５０３５只共２头份无无无无无９９／９２０１２０５０４５只共２头份无无无无无７７／７＊２０１２０５０５５只共２头份无无无无无１０９／１０对照５只２ｍＬ生理盐水８８／８幸考幸幸幸＊１只幼犬因挤皮室息死亡，剖检无病理变化。３．３３．３大剂量安全性试验结果－１１免疫犬未见呕吐、腹泻、局部热反应等症状，每组母犬的平均产仔率在６只，且均无弱胎和死胎发生３－８。，对照母犬幼仔均正常，见表表３－８Ｈ联活疫苗怀孕母大剂量安全试验Ｔａｂ－ｌｅ３８Ｓａｆｅｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｈｉｈｄｏｓｅｉｎｒｅｎａｎｔｄｏｓｇｐｇｇ疫苗接种接种局部体温热平均健活呕吐腹湾减食批号犬数剂量反应升髙反应产仔比例２０１２０５０１５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５０／５８８／８２０１２０５０２５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５０／５８８／８２０１２０５０３５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５０／５１１１１／１１２０１２０５０４５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５０／５７７／７２０１２０５０５５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５０／５８８／８对照５只１０ｍｌ生理盐水０／５０／５０／５０／５０／５０／５６６／６－３６－ Ｄ－３Ｃ、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病Ｈ联弱毒疫苗制备３．３．４Ｈ联活巧苗最小免疫剂量研究结果３．３．４．１ＣＤＶ组攻毒保护结果４＇０４＇°２－犬免疫后１ｄ后，１〇了（：１〇５〇／犬多点皮下和口服ＣＤＶＹＢ株强毒攻击，１〇５Ｇ４＇Ｇ３＇０ＴＣＩＤｍ／犬，１０ＴＣＩＤ０ＴＣＩＤＷ犬的剂量免疫犬的保护率均为１００％１〇及１，而）ｓｏＴＣＩＤｓｏ／犬的剂量免疫犬的保护率仅为６０％，对照组１００％发病。发病犬的临床表现为：°呈双相热型体温升离至４０ＣＷ上，；两眼出现眼移、结膜炎；排稀便甚至是水便，对照－－组１只犬在攻毒后７ｄ死亡，９。，剖检发现肺脏及肠道有出血病变见表３和表３１０３．３．４．２ＣＰＶ组攻毒保护结果４＇０５＇０ＴＣ－犬免疫后２１ｄ后，Ｗ１〇ＩＤＷ犬剂量的ＣＰＶＹＮ株强毒进行攻击，１〇ＴＣＩＤｓｏ／４＇０了犬及１〇１０〇／犬的剂量免疫犬的保护率均为１００％，而（：１〇／犬的剂量免疫犬５〇５〇的保护率仅为６０％，对照组１００％发病。发病犬的临床表现为：厌食、呕吐、腹泻，严２－－１３重者则排番茄酱样的腥臭粪便，３１，其中对照组有只犬出现脱水症状见表和表１２。３．５．４．３ＣＡＶ组攻毒保护结果５＇°４＇°３＇°３°１Ｔ１ＩＴ２１ｄＴＩＤ１月龄犬〇ＣＩＤｓｏ、〇ＴＣＤｓｏ、１〇ＣＩＤｓｏ犬免疫后，Ｗ１〇Ｃ／ｓｏ５＇０４＇０ＣＡＶ－ＨＴＣＩＤ及ＴＣＩＤ犬剂量的株强毒进行攻击，１Ｏ５〇／犬１〇ｓｏ／犬的剂量免疫犬的保３０护率均为１００％，而１〇ＴＣＩＤｓｏ／犬的剂量免疫犬有１只发病，对照组１００％发病，并有１只病犬死亡。其中发病的犬主要临床表现为；精神沉郁、消瘦、少食、饮水量增加、呕吐、腹海，；高热稽留，呈明显的双相热型死亡犬经剖检发现肠道出血严重，从试４＇０验结果来看，该疫苗最小免疫剂量定为１〇ＴＣＩＤ５〇时，才能给犬起到很好的保护，见－－表３１３和表３１４。３－９ＤＶ组攻毒保护结果表ＣＴａｂ３－ＩｒａａｎＶｌｅ９ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｏ化ｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓｉｓｔＣＤｐｇｇ免疫剂量免疫数量发病数死ｔ：数保护率３＇１〇叶ＣＩＤ５２／５０／５如％ｓｏ４＇０１０１０ｔＣＩＤ５（Ｖ５０／５０％５０５＇〇〇！１〇ＴＣＩＤ５（Ｖ５（Ｖ５００／〇ｓ。对照１ｍｌ盐水５０＾＾表３－１０ＣＤＶ组攻毒保护试验各犬的临床症状Ｔ－ｍｍｎｍａ－ａｂ１０Ｃｎｃａｌｌｅ３ｌｉｉｌｓｙｐ化ｓｏｆａｉｌｓｃｈａｌｅｎｇｅｂｙＣＤＶＹＢ免疫剂量犬号精神消瘦食欲饮水结膜炎呕吐腹浩双相热脱水Ｄ－－一＿＿＿＿１正常正常Ｄ２＋＋不佳増多＋＋＋＋＋＾°一一＋＋＋１０ＴＣＩＤＤ３＋＋不佳增ｓｏ多Ｄ４——正常正常—＿一一—Ｄ５—正常正常————————————ＴＣＩＤｓｏＤ６正常正常Ｄ７－—正常正常￣－－－－－３７－ 东北林业大学博±学位论文——一—＿——Ｄ８正常正常Ｄ９——正常正常—————Ｄ０———————１正常正常Ｄ——正常正常一一一＿—１１＿—一－———Ｄ２正常正常１５０＇＿——＿—＿—１０ｔＣＩＤ巧０１３正常正常Ｄ——一一一一＿１４正常正常——一＿———Ｄ５１正常正聋１＋＋不隹增多＋＋＋＋＋２＋＋不佳增多一＋＋＋＋对照组３＋＋不佳正常＋＋＋＋＋４＋＋不佳增多＋＋—＋＋５＋＋不佳増多一＋＋＋＋＋一：：代表不正常或出现症状：注！代表正常或无症状３－表１１ＣＰＶ姐攻毒保护结果Ｔａｂ－ｎｌｅ３１１ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣＰＶｐｇｇ免疫剂量免疫数量发病数死亡数保护率３〇／５／５１〇ＴＣＩＤ５２０６０％５〇４０Ｉ０ｔＣＩＤ５０５０／５０／５１００％５〇１〇ＴＣＩＤ５〇５０／５０／５１００％对照１ｍｌ盛水５ＳＳ００Ｊ＾－表３１２ＣＰＶ组攻毒保护试验各犬的临床症状－Ｔａｂ－ｌｅ３１２ＣｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆａｎｉｍａｌｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｂｙＰＶＹＮＣ免疫剂量犬号精神消瘦食欲饮水呕比腹泻双相热脱水Ｐ＋＋＋－＋—１不佳増多Ｐ２—－正常正常一一－－３°一１０ＴＣＩＤ５０Ｐ３＋＋不佳増多＋＋＋Ｐ４—一正常正常一－——Ｐ＿－一－－－５正常正常Ｐ６——正常正常————Ｐ７—－正常正常一一一＿＇°４—－一－—＿１０ＴＣＩＤ５０Ｐ８正常正常——一——＿Ｐ９正常正常Ｐ——＿＿＿—１０正常正常５０—－一＿＿Ｐ＿Ｉ０ｔＣＩＤ５０１１正常正常一一一—Ｐ口正常正常－—一Ｐ—一正常正常－－—１３—Ｐ—————１４正常正常－＿３８ ３ＣＤ－、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病兰联弱毒疫苗制备Ｐ——————１５正常正常一＋＋＋１＋＋不佳正常２＋—不佳增多＋＋＋＋对照组３＋＋不佳増多＋＋—＋４＋＋不佳增多一＋＋＋５＋＋不佳增多＋＋＋＋注一：＋：代表不正常或出现症状：；代表正常或无症状３－表１３ＣＡＶ姐攻毒保护结果Ｔａｂ－ｌｅ３１３ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣＡＶｐｇｇ免疫剂量免疫数量发病数死ｔ：数保护率３＇〇１〇ＴＣＩＤ５Ｗ０／５８０％ｓ。＾°ＴＣ〇ＩＤ０１０５〇５０巧巧！００／〇５０瓜〇１〇了（：５０／５０巧！００／〇５〇１ｍ对照ｌ盐水５０＾＾－表３１４ＣＡＶ组攻毒保护试验各犬的临床症状Ｔａｂ－－ｌｅ３１４ＣｌｉｎｉｃａｌｈａｌｌｅｎｅｂｌｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆａｎｉｍａｓｃｇｙＣＡＶＨ＾是剂量犬号精神消瘦食欲饮水［＾吐腹泻双相热脱水Ａ——一＿＿＿１正常正常—－一—－Ａ２正常正常－＾°—１０ＴＣＩＤ—————ｓｏＡ３正常正常——Ａ４—正常ＩＥ———常Ａ５＋牛不佳增多－＋＋＋Ａ６——正常正常一＿＿＿——一－Ａ７正常正常—－－－一－－－１（ＴｔＣ【Ｄ５〇Ａ８正常正常Ａ９—－正常正常一—－－Ａ———１０正常正常———Ａ——一一一一ｌｌ正常正常Ａ—－一—－－１２正常正常５°＇————＿－１０ＴＣＩＤ扣Ａ１３正常正常—Ａ——＿＿—１４正常正常Ａ■————１５正常正常——二——＋＋示甚＋＋＋＋１南多２＋＋不佳增多＋＋＋＋＋＋不一＋—＋对照组３佳增多—＋＋＋＋４＋不佳增多５＋＋不佳正常＋＋＋＋一：＋；：注代表不正常或出现症状；代表正常或无症状３．３．５Ｈ联活疫苗免疫持续期研究结果３．３．５．１ＣＤＶ组攻毒保护结果免疫后第５、６个月时保护率均为１００％，对照组均全部发病，其中对照组在第６个－１月时有只死亡；７个月时保护率为８０％３１５。，对照组全部发病，见表－３９－ 东北林业大学博±学位论文表３－Ｃ１５ＤＶ攻毒保护结果Ｔ－ａｂｌｅ３１５Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉ打ＳｔＣＤＶｐｇｇ月份組别犬数发病数死亡数保护率试验组５０／５０／５１００％５５－对照组５／５０／５试验组５０／５０／５１００％６对照組５５－／５１／５试验组５＼１５１／５８０％７对照组５０－屯＾义３．５．２ＣＰＶ攻奉保护结果免疫后第５、６和７个月时保护率均为１００％，对照组均１００％发病，其中对照组在５－１６第个月的发病犬中有１只死亡，见表３。３－１６表ＣＰＶ攻毒保护结果－Ｔａｂｌｅｓ１６ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣＰＶａｐｇｇ月份组别犬数发病数死ｔ数保护率试验沮５０／５０／５１００％５－对照姐５５／５Ｖ５试验组５０／５０／５１００％６５／５０－对照组５／５试验组５０／５０／５１００％７对照组５０屯＾二３．３．Ｓ．３ＣＡＶ组攻毒保护结果免疫后第５－、６、７个月时保护率均为１００％，对照组均全部发病，见表３１７。３－表１７ＣＡＶ攻毒保护结果Ｔａｂ－ＡＶｌｅ３１７ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣｐｇｇ月份组别犬数发病数死亡数保护率试验姐５０／５０／５１００％５－对照沮５５／５０／５试验组５０／５０／５１００％６５５－对照组／５０／５试验组５０／５０／５１００％７对照组５０－坚＾３．３．６兰联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果３．３瓜１ＣＤＶ效力对比试验结果ＣＤＶ－：ＣＤ单苗和Ｈ联苗均能对犬提供１００％保护。攻毒保护结果，表３１８３－ＣＤ抗体监测结果：随着免疫天数的增加，其中和抗体价呈上升趋势，表１９。－４０－ ＤＡＶ－ミ联弱毒疫苗制备３Ｃ、ＣＰＶ病和Ｃｌ病３－表１８ＣＤ单苗组和联苗组的攻毒保护结果Ｔａ３－１ＩｍｍｕｎａｎｒＤＶｂｌｅ８ｉｚａｔｉｏｎｄｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣｐｇｇ犬号双相热消瘦食欲呕吐腹泻脱水保护率—＿————５１５２————一一—＿＿一—一Ｈ组Ｓ３１００％联苗５４—＿＿———５５———？一—＿Ｃ＿————１一Ｃ２一一一一一ＣＤＶ单苗组——————Ｃ３１００％—Ｃ４＿＿————Ｃ５———一一１＋＋＋卡＋＋２一＿＿一一＿对照３—＋＋—＋＋—４＋—＋＋＋＋５＋＋＋＋＋＋－４－１ ＯＯＮＩＩＩＩＩ的ＩＮ０ＯＩＩＩ々＾——ＩＮＯＯｗＩＮＩ—ＩＩＩＮＯＯＮＮＩ或——ＩＩ—Ｎ堅Ｏ－ＩＩＩ长一Ｎ——ＩＮ＂ＳＳ野８９０１Ｓ＂－－『＞．．ＳＳＳＯｏｚｅ９９护ＮｎｎＮＮ私ＮＮ与ＮＮＮＳｓＳｓＳＳｓＬｒ＂ｒ？一ＳＯｚ，９钟２ＰＳ２ｓＮｎＮＮＮｎＮＮｎＮ踩城ｓ￡ＳＳＳ５ｒＳ巧巧．．．ｒ耗壽Ｉ一Ｚ£９９＂ＳＳＳ５ＮｎＮｎＮＮＮｎＮ听Ｎ驾运教ｓＳ＂巧巧Ｓ５巧．．耸Ｏ一Ｚ￡＂ｓｘＳＰ户ＧＮｎＮｚＮｎ２ＮＮ２候？畏ｓＳｓ舊Ｓ巧巧Ｓ巧片．辑．巧边ＯｏＺ和ＣＳ９ａ户３２若剪ＧＮｎＮＮＮＮｎＮＺｎ靴街嚮中据坤？狸Ｓ％ｓｓ％５Ｎ巧Ａ广￡ｌ巧ａ一．．．ｖ々７玲Ｏ一Ｃｅ９ｓｌ，３抑。０ＮｎＮＮ如ｎｎ＾２ｙ３ｌ或马巧括坤请Ｓ戰￡芯６．ｌｓｎ．ｒ城ａＳ一￡ｅ２９ｇＳｋｕ护Ｎｎ中ｎＮ知２ｎ＆ＮＮｎ展或ｓ％５Ｓ＂口巧ＳｘＳ＂．怔一Ｓｅｅ９ｓＰｐＯ９ｙＳＳＮｎＮＮＮＮＺｎＺＮｎ幾６ｉ－ＳＳｓ％ＺＳ口ｅ＂．．．ｒ谷ｚ－寸一ＳＣＳｓ户Ｏ５９９龄ＳＮｎＮＮＮＮＺＮｎｙｎｓｓＳＳ口ｒ．－一￡ＳＳＳｓｉｐ２ｓ旨ｎＮＮＮｚＮＮｚＮ毋ｓｓｓＳＳｓＳＳ－－ｒｒｒ＂ｒＩ一£￡ｅｓｓＳｓ跋ＳＳｓＮｎＮＮＮＮＮＮＮＮＮ巧巧Ｓ幾ｓｓ５Ｓ￡ＳＳ＂ｒ．Ｓ一Ｏｅ￡ＳＳ受２Ｓｓ川ｓＮｎＮＮＮＮＮＮＮ３Ｎｎ田田口口口口口搞口阻口口口Ｎ的》Ｉ０Ｓ￡Ｋ０ｉ也Ａｌ一一Ｎ的１Ｉｓ桓昭嗔秘跋雕據巧场 ３ＣＤＣ－Ｈ联弱奉疫苗制备、ＰＶ病和ＣＡＶＩ病义义６．２ＣＰＶ攻毒和抗体监测结果ＣＰＶ攻毒保护结果－；ＣＰＶ病单苗和；联苗均可对犬提供１００％保护，表３２０。３－２０表ＣＰＶ病单亩组和联苗组的攻毒保护结果Ｔａｂ－ｌｅ３２０ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣＰＶｐｇｇ犬号发热消瘦食欲呕吐腹褐脱水保护率５——————１５２一——————－－－－－王联苗纽Ｓ３１００％５４一＂―＿——＿５———＿——５＾■■■■■＾２ＣＰＶ单苗组Ｐ－－－－－－％３１００Ｐ一一＿—＿＿５牛一＋＋＋—１２＋＋＋—＋＋对照—＋＋—＋＋—３４＋—＋＋＋＋５＋＋＋—＋＋－ＣＰＶ抗体监测结果；随着免疫天数的增加。，中和抗体价呈上升趋势，表３２１－４３－ ＩＯ的ＩＮＩＩＩＩＩＮＯＯＩ寸ＮＩＩＩＩＩＮＯＯＩ＾ＮＩＩＩＩＩＮＯＯＩＩＩ１ＩＩＮＮＩＮｆ整ＯＯ一ＮＩＩＩＩＮ每ＩＩ９ｕｊ３〇Ｂ巧資ａ々ｅ９导．－．．巧ＡＳＳｅＳ９９ＳＸｉＮＮ护ＮＮ知ＮＮｓＮＮ＞ｄ３ｓｓ５ｓＳ￡一ＳｓｉｚＳ．只。．。Ｏ－Ｚｅ２５９Ｓｋ３ｄＮＮＮＮ种ｎｎ＾ＮＮｎ眯ｕ號ｐｏＳｓｂｓｒ＂。巧巧－壽＞ＩｉＳｅｅｓｓ９ＳＳＳＮＺＮＮＮｎｎ２ＮＮＮ｛２绅＞ａ务ｕ｛ｑＳｓｓ５ＳＳＳ。ｚｓ核．．／ｒ。ｉ￡ＩＺ３ｅｓ。ＰＳＳｓＯｃ耸０ｄＮＮＮ心ＮＮＮ＂ＮＮＮＮ３提ｉ剪ｐｉｓＳＳｓ展ｆ巧巧巧ＺｉＭ．．．＿￡２９９Ｓ５ＫＯＳｐ却岂ＮＮＮＮｎＮ３ＮｎＮｓ楚ｗ繫濕ｕＡＳ５ｓＳ巧巧ｓ巧户ｓｐｄ．．．ｓｓ诘ｏＯ￡３ｓ９９２Ｐ＾ｄＤＥＮｎ知ＮｎＮ３ｎｎｎＮｆｔ唉Ａ＇ｉ５剪ｓｏ—ｓ巧ｄＳｓ＞巧ｓ１ｇｓ．ｒ．．坤ｉ２ｅＳｓ９ｇｘｐｐＳｄＺｓ和０：ｎＮ２ＮＮＮｎｎｎＮ繫３３ｓ＞ｄ巧３巧Ｓ￡ｓ民口巧ｓ．玄ＳＯｉＳＸ５Ｓ３２ｓｋ展》ＳＮＺＮＮＮＮ＾ｎｎｎｎ：或如Ｂ巧ｓｊ證公ｓｓＳｓｚ巧Ｎｓ，。．．ｒ．ｋ々ＯＩｅ々ｓＳ９ｓ５５ｘｓＮＮＮＮＮＮＮｎｎｎｎ一ｐｏｑ古術ＵＢｓＳｓｓＳ巧口＂巧＂．Ｚｒ．￡Ｏｉｓｃｅ５Ｓ９ａ￡ｓ．７３ＳＮＺｎＮＮＮＮｎｎｚｎＮ臣一ＳｓＳＳ％Ｓ或ｓＺ．Ｚ＂ｓｒ．．．ｘ进ＺＯＩｗＸｅＳ２９ｉｓＳ鶴ＳＮＮｎＮＮＮＮｎＮ軒ｎＮｑＢ巧Ｈ巧Ｓｓ證ＳＺｓＳ巧＾巧巧．ｒ巧．７７０ＺＸ￡Ｓ９９Ｘ．．ｗｓ＾ＮＮＮＮｎｎＮＮＮ口口口田口口口類口田口口阻的》１０的一＾０折。分Ｈ一一２＾１ＩＮ極呜鸣敏蛾雕巧振扬 ３－ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病Ｈ联弱毒疫苗制备３．义６．３ＣＡＶ攻毒和抗体监测结果ＣＡＶ攻毒保护结果；ＣＡＶ病单苗和Ｈ联苗均能对犬提供１００％保护，表－３２２。表３－２２姐和联苗组攻毒保护结果ＣＡＶ病单苗Ｔ－ａｂｌｅ３２２ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓａａｉｎｓｔＣＡＶｐｇｇ犬号发热消瘦食欲呕吐腹泻脱水保护率———————５１——————５２—————－王联苗组Ｓ３１００％＿———＿—５４—————５５—Ａ——————１Ａ２—一一一＿—ＣＡＶ单苗组－———－—Ａ３１００％—＾—■■■■——＾―＾＾４Ａ一—————５＋—＋＋＋＋１２＋＋＋—＋＋对照３＋＋＋＋＋＋—４＋＋＋—＋＋５—＋＋＋牛一ＣＡＶ抗体监测结果；随着免疫天数的增加，中和抗体价呈上升趋势，表３－２３。－４５－ ＯＯＩＩＩＩＩ听ＮＩＮＯＯ——ＩＩ々ＮＩ—ＮＯＯｉＩＮＮＩＩＩＩ—：Ｏｑ—ＩＩ剪ＮＮ—ＩＩＺ堅Ｏｑ一—ＩＩＩＩ孩ＮＩＺａｕｐｏｓｓＢ巧ｅｏ１Ｌ．ｒ－ＯＯＪｘ９５Ｓ々ｓ２５Ｓ沪ＮＮＮ种ＮＮＮ３ｎｎＮＮ＞Ｖ３ｓｓＳＳ￡￡ｓｒＺＬｒｓ一内ＳＯｅ＞５Ｓｓ９ＵＮＮＮＮＮｎ知ＮｎＮＮ睐Ｇ！號ｕｕｓＳ５Ｓｄ＂含ｓ巧ｓ壽＞．－ｑ￡片；，Ｓ５ＳＳｋＷ３ｎ＾ＮｎＮ３％ＮＮｎ驾ｐｗ运ｅｊｑｓＳ孩ｓｗＳ巧巧Ｌｓ￡．－．一ｅ巧ＳＸＳｓ０３９和ｋ耸ｏＶ３ＮＮＮｎＮｎＮＮｎｏ握占或方ｓｓｓ展ｚ￡－台巧泛扣Ｚ巧ｒ．７？ｏｊｅ£ｓ９Ｘ５，ＰＶｎ３ＮＮ＾ｎＮｎ２遊３３Ｓ趕嚮ｕＡｓｓＳＳＳ谷Ｓ抑ｐ一－ｒ＂巧Ｖ￡Ｚ８昭００ｊＸ＞ｓ２，Ｓ中ｄ。Ｖ３ＺＮｎＮＮ＾ＮＮｎ吗＞■巧９抑或巧々￥。ｌ巧＆Ｓ％巧巧巧Ｓ身齊Ａ．．ｃＶＳＳｅ￡Ｓ２２Ｓ？Ｐ括沪Ｎ２ＮｎＮ的ｎＮＮ＆Ｎ喔Ｏ為Ａ０蛾Ｖ皂３一Ｓｓ扣巧巧巧ｓＳＳ．．ＷＸｓＫｓＺ展石Ｑ３９２Ｓ．田萬ＮＮＮＮＮ的ｎＮＮｎＮ威浮巧芭證公ｗＳｓＳ古巧＂巧々ｃｅ々３２３Ｓ５Ｓ八ｓｚＮｎＮ知的ｎＮｎＮ巧巧０－ｅ皂｜齡ｓＳＳ§ｒ５Ｓｓ的資巧£－．．資３Ｏ＂內３々９ＳｋＳＮＮ的ＮＮ＾听甲Ｎｎ听民ｓＳ剪巧＂ｓ％Ｓ巧資－．肖９ＱＩｅ９ＳＸｓ跋ｓＮＮＮ种心＾ｙＮＮｎ軒玄娘挥巧Ｓｓ證巧兵．ＺＳｓＩ．．－ＱＩＸｅＳ９Ｓ３ＳｘＳＨＳＮＮＮｚＮＮＮｎＮｎＮ巧口口巧巧口口載口口口口ｍ２Ｓ》Ｉ０一＾｛的也Ａ１Ｉ一Ｎ＾１資Ｎ｝桓鸣嗔热跋巧哦雙Ｉ ＣＤ－３、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病Ｓ联弱毒疫苗制备３．３．７兰联活疫苗与市场销售的同类商品苗的比较研究结果３．３．７．１安全性比较结果－Ｈ联活疫苗和五联活疫苗免疫犬均无局部接种反应和临床感染症状发生。，表３２４表３－２４安全性比较试验结果Ｔａｂ３－２４ｏｍｎｅｌｅＣｐａｒｉｓｏｏｆｓａｆｔｙ疫苗接种犬数接种剂量局部反应体温升高呕吐腹泻减食三联苗５只１０头份０／５０／５０／５０／５０／５五联苗５只１０头份０００／５０／５０／５＾＾３．３．７．２免疫效力比较试验结果病毒含量测定结果：Ｈ联苗（批号：２０１２０５０２）和五联苗（批号：２０１２０７０２）病毒－２５含量测定结果，见表３。表３－２５两种疫苗病毒含量测定结果Ｔａｂ－２５Ｖｒｕｓｒｗｏｖａｃｃｎｅｌｅ３ｉｔｉ化ｏｆｔｉｓ疫苗＂＂５６犬；联苗１０ＴＣＩＤ／头份１０ＴＣＩＤ／头份１〇ｔＣＩＤ／头份５０ｓ〇ｍ）３ｓＳＳ５２犬五联苗１〇ＴＣＩＤ／ｌＯＴＣＩＤ／１〇了（：瓜３〇头份ｓｏ头份５〇／头份３．３．７３攻毒保护结果ＣＤＶ攻毒保护结果亡犬出现－：二者均能对犬提供１００％保护，无发病和死，见表３２６０表３－２６ＣＤＶ攻毒保护结果Ｔ－ａｂｌｅ３２６ＩｍｍｕｎｅｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓｃｈａｌｌｅｅｂｙＣＤＶｐｇｇ疫苗接种剂量免疫犬数发病数死ｔ数保护率Ｈ験苗１头份／犬５（Ｖ５０／５１００％五联苗Ｉ头份／犬５０／５（Ｖ５１００％—对照ＩｍＬ盐水５５片２／５ＣＰＶ攻毒保护结果：Ｈ联苗能对犬提供１００％保护，五联苗有１只犬发病，但没有－２７死亡，且，３。；攻毒組全部发病有１只死亡见表表３－２７ＣＰＶ攻毒保护结果Ｔ－２７ａｂｌｅ３Ｉｍｍｕｎｅｒｏ化ｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓｃｈａｌｌｅｅｂＣＰＶｐｇｇｙ疫苗接种剂量免疫犬数发病数死亡数保护率Ｈ联苗１头份／犬５（Ｖ５０／５１００％五联苗１头份／犬５Ｗ０／５１００％－对照ＩｍＬ盐水５５６１／５ＣＡＶ攻毒保护结果：兰联苗的保护率为１００％，五联苗有Ｉ支出现临床感染症状，－但未死亡对照组１００％发病，见表３２８。－４７－ 东北林业大学博±学位论文３－２８表ＣＡＶ攻毒保护结果Ｔａｂ－ｌｅ３２８ＩｍｍｕｎｅｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｓｃｈａｌｌｅｅｂＡＶｐｇｇｙＣ疫苗接种剂量免疫犬数发病数死亡数保护率三联苗１头份／犬５０／５０／５１００％五联苗１头份／犬５１／５０／５１００％－对照ＩｍＬ盐水５０＾＾３．３．７．４免疫持续期比较结果：６和７个月时保护率均为１００％ＣＤＶ组攻毒保护结果免疫后第５、，对照组均全部发病－。，其中对照组在第５和第７个月的发病犬中各有１只死ｔ。表３２９一表３－２９免疫持续期比较试验ＣＤＶ攻毒保护结果Ｔａｂ－２９－ｌｅ３ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｄｕｒａｔｉｏｎＧｒｏｕＣＤＶ（ｐ）免后月份组别犬数发病数死亡数保护率王験试验组５０／５０／５１００％５五联试验组５０／５０／５１００％对照组５５店一１作Ｈ联试验姐５０／５０／５１００％６五联试验组５０／５０／５１００％５／－对照组５５１／５；联试验组５０／５０／５８０％７五联试验组５０／５０／５８０％对照组５０－单＾ＣＰＶ组攻毒保护结果：免疫后第５和第６个月时二者保护率均为１００％，对照组均全部发病，其中对照组在第５和第个月的发病犬中各有１只死亡；７个月时２个试验组－巧有１只犬出现临床症状，但都未死亡，对照组１００％发病。见表３３０。一表３－３０免疫持续期比较试验ＣＰＶ攻毒保护结果－－Ｔａｂｒｌｅ３３０ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｄｕａｔｉｏｎＧｒｏｕＣＰＶ（ｐ）免后月份组别犬数发病数死亡数保护率三联试验组５０／５０／５１００％５五联试验组５０／５０／５１００％对照组－５５／５＼１５Ｈ联试验沮５０／５０／５１００％６五联试验组５０／５０／５１００％对照组—５５／５Ｗ王联试验组５１／５０／５１００％７五験试验组５１／５０／５８０％对照组５Ｖ５－＾ＣＡＶ组攻毒保护结果：兰联活疫苗后第５、６和７个月时保护率均为１００％；五联－４８－ ３ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶ－Ｉ病Ｈ联弱毒疫苗制备５１－００％，第７，３３１活疫苗第和第６个月时保护率均为个月时有１只发病见表。一３－３表１免疫持续期比较试验ＣＡＶ攻毒保护结果Ｔ３－３ｍｍｍｕｎｅ－ａｂ１ｉｕｒａｏｎｒＣＡＶｌｅＣｏｐ祉ｓｏｎｏｆｉｄｔｉＧｏｕ（ｐ）免后月份组别犬数发病数死亡数保护率兰联试验组５０／５０／５１００％５五联试验组５０／５０／５１００％５５Ａ５０５—对照组／兰联试验组５０／５０／５１００％６五联试验组５０／５０／５１００％５５５一对照组／Ｉ巧兰联试验组５０／５０／５１００％７五联试验组５１／５０／５８０％５－对照组１＾＾３．３．７．Ｓ保存期比较结果－从各组分病毒含量检测结果显示：二者无明显差异，见表３３２。表３－３２两种疫苗Ｈ种病毒含量测定结果°Ｔａ３－３２－ｂｉｒｕｓｔｉｔｅｒｏｆｔｗｏｖａｃｃｉｎｅｓａｆｔｅｒ１２ａｎｄｔｔｒｎ２０ＣｌｅＶ１Ｓｍｏｏｈｓｓｏａｇｅｄｉ组别保存时间犬Ｈ联犬五联＾＾５３ｌＴＣＤ１２ＯＩｓｏ１〇ｔＣＩＤ５〇ＣＤＶ５４＾＇１８１〇ｔＣＩＤＩＴＣＩＤ５〇Ｏｏｓ５６５５１２１〇ｔＣＩＤ１〇ｔＣ瓜５〇５ＤＣＰＶ５５５４１ｔＣＩＤ１８〇５〇Ｉ〇ｔＣ瓜扣５６＂１〇ｔＣＩＤ１２５〇１０ＴＣ瓜０５ＣＡＶＳ５Ｓ５５＂５ＩＱｔＣＩＤ１０ＴＣＩＤｓｏ０３＾３．４讨论ＣＤＶ１９％９７８５，、ＣＰＶ和ＣＡＶ分别于年、１年和１９２年首次被发现是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。ＣＤ不仅危害养犬业，而且严重危害骆、貂和狐等毛皮动物养殖业发展ＣＰＶ引起犬出血性肠炎与也肌炎－Ｉ；ＣＡＶ；引起犬传染性肝炎等，ＣＡＶ－ＩＩ引起犬的传染性喉气管炎。为预防与控制这几种传染病，己研制出多种商品用单苗与联苗。常规弱毒联苗产品－－－有：Ｇａｂｃａｙ６ＭＰＨＬ、ＦｅｖｒａｃＤ、ＦｒｏｍｍＤ和犬四联弱毒疫苗等。Ｇａｌｘａｙ６ＭＰＨＬ和一ＦｏｒｍｍＤ为苏威动物保健公司生产Ｇａ－Ｌｌａｘ６ＭＰＨ，ｙ为种犬多价弱毒联苗，内含犬痘热病毒一、细小病毒、腺病毒和副流感病毒弱毒株。ＦｏｒｍｍＤ为种禽源性家犬和雪貂ＵＭ１专用犬弱毒疫苗。据文献报道，该疫苗除对家犬和雪貂抗犬痘热病毒感染既安全又有效外ｅｒｖａｃ－，对鬟毛狼、丛林狗和大耳狐抗犬痘热感染也具有安全性和有效性。ＦＤ为一种禽源性雪貂专用犬多价弱毒联苗，文献报道小熊猫接种该疫苗后的抗体效价都有不同水平的提高。基因工程多价苗方面：有研究者，扩增ＣＤＶＨ基因、ＣＰＶＶＰ１基因、－－ＲＥＳＶＰ－ＣＡＶＩＩＦ基因ＩＲＣＤＶＨＩｌｃＣＡＶＦ３个真。，分别构建了ｐ，ｐ和ｐ核表达质粒３种－４９－ 东北林业大学博±学位论文免疫质粒经纯化后分别按２００雌、４０（Ｈｉｇ和８００峭Ｈ种浓度混合，免疫９ｗ（ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ中和抗体效价含２）的犬，并在第Ｈ次接种４ｗ后，对全部实验犬进行用ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ－Ｉ。强毒株进行攻毒实验结果显示：２次免疫后犬体即可产生较高的抗体水，攻毒后犬除有１只发病，，其余都能抵抗Ｈ种强毒的攻击照犬发病平但症状较轻；对一ｉＷｔ。严重，证明所构建的核酸疫苗在定程度上可抵抗强毒的攻击本实验室也曾开展ＣＤＶ核酸疫苗联合免疫的研究，２００８年，张莉扩增了狐狸源ＣＤＶ的Ｆ基因，将其克－隆至ｐｃＤＮＡ３．１＋真核表达载体，构建了ｃＤＮＡＦ真核表达质粒。该质粒与之前实验（）ｐｃＤＮＡ－ｃＤＮＡ－Ｈ共同免疫昆明鼠３室构建的ｐＮ和ｐ，评价其免疫效力。实验结果显示：＋＋个基因混合免疫组其ＣＤ４Ｔ和ＣＤ８Ｔ细胞的百分含量明显高于单基因和双基因免疫＋＋组，接近于弱毒疫苗组ＣＤ４Ｔ和ＣＤＳＴ淋己细胞的百分含量。血清中能检测出特异性抗ＣＤＶ抗体。表明Ｈ、Ｆ、Ｎ基因的重组质粒ＤＮＡ免疫鼠可诱导产生特异性细胞免疫＾６７］１）和相应的体液免疫。与传统的常规疫苗相比，基因工程疫苗具有许多优点：（制备简单，，。生产比传统的灭活疫苗和弱毒疫苗等要简单成本要低省时省力。口）更有效的免疫，。不仅可Ｗ诱导针对保守抗原的保护性抗体产生同时细胞内蛋白的表达提供了内源性多肤，激发了ＣＴＬ介导的细胞免疫，送样对病毒及胞内菌感染的防制就更加有一，基因疫苗接种后效。而且，抗原在细胞内的表达与病毒自然感染过程致，这对于Ｗ构象型抗原表位诱发中和抗体产生极为重要。（３）联合免疫。相当于多价疫苗，接种后就可Ｗ产生针对多种病原体的联合免疫效果。（４）同种异株交叉保护。可通过对基因表达载体所携带的铅基因进行改造一病原体的编码保守蛋白的，从而选择抗原决定簇，选择某一核酸序列作为基因疫苗，，，因其变异性小故可对同种病原的不同毒株产生交叉免疫起到保护作用。（５）疫苗仅仅含有核酸成分而没有蛋白质等其他辅助成分，无病毒感染复制的危险，而减毒活疫苗除了主要成分蛋白质外还含有核酸感染因子，有可能出现病毒的复制，从而引起感染。（巧可诱导出较强的免疫反应，而且很少受或不受母源抗体的影ｉＷ一ｔ些问题响。：如产生免疫耐受但犬用基因工程疫苗还存在，出现免疫反应低或免疫无反应抗原长期在体内表达带来难Ｗ预测的后果，使抑癌基因；激活细胞原癌基因失活，诱发肿瘤的产生及安全性等，还，因此目前尚处于研究探索阶段未应用到临床。一一目前国内应用的弱毒联苗部分是国外疫苗的复制品，另部分种毒直接来自于国外ｔｗｗｗ。这与目前国内流行的野毒株在核昔酸及氨基酸水平＾＞１［及病毒抗原性等生物学特性方面存在显著差异，不能够对我国犬的ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ所引发的疾病进行有效防控。因此本研究筛选我国的ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ优势流行毒株，经过致弱而制备成Ｈ联一，活疫苗，并对其免疫效为进行了系列评价。制备半成品单苗时对种子毒种的使用代－，２５次应严格控制在１０代Ｗ内，毒种应冻干低温保存使用时复壮扩增代，毒价测定一合格后方可作为次级毒种。接毒后注意观察细胞病变般来说ＣＰＥ达７０％－８０％时收毒，可获得最佳收毒期。病毒与稳定剂配比的研究结果显示：明胶廉糖冻干保护剂的效果最。好，因而选取明胶庶糖作为本产品的冻干保护剂（数据未列出）不同比例的配比实验１结果显示：将病毒液与稳定剂９：的比例冻干后，疫苗中各病毒的损耗最小，免疫比格犬后的对犬的保护率均为１００％，完全符合质量标准要求。因此我们将各病毒液等量海合后，按９：１的比例作为冻干条件。－５０－ －Ｈ联弱毒疫苗制备３ＣＤ、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ病Ｈ联活疫苗安全性研究结果显示：各批疫苗试验犬均无因注苗引起的不良反应，采食和精神状态都与对照犬无明显差异，证明疫苗安全性良好。为了避开母源抗体的干扰，２一一采取仔兽断奶２周后进行首免，间隔周加强免疫次；成兽次性免疫即可产生坚强的免疫力，目的是通过母源抗体保护仔兽。Ｈ联活疫苗对怀孕；种兽应在配种前注苗ＣＤ－、ＣＰＶ病和ＣＡＶＩ母犬的安全性研巧结果显示；病Ｈ联活疫苗分别经单剂量安全性试验、单剂量重复安全性试验和大剂量安全性试验法射怀孕母犬后，不会出现呕吐、腹湾、局部热反应等症状，采食和精神状态都正常，母犬产仔正常，幼仔无弱胎、死胎，均健活。证明该疫苗对怀孕母犬是安全的。王联活疫苗最小免疫剂量研究结果显示：４＇°〇１〇ＴＣＩＤｓｏ／犬组对这兰种病保护率均为１００／〇。因此，我们将该疫苗的最小免疫剂量定４０为１〇ＴＣＩＤｓｏ／犬，但由于疫苗在运送和使用过程中可能会使效价降低，所Ｗ我们将使４５用剂量定为１０ＴＣＩＤ５０／犬。Ｈ联活疫苗免疫持续期研究结果表明：在免疫后第５、６和７个月时，分别用强毒进行攻击，在第５和６个月时用Ｈ种病毒攻击后的保护率均为１００％，只有攻击ＣＤ强毒组在第７个月的保护率为８０％，对照组犬均１００％发病，考虑到现场应用的个体差异等因素，将免疫持续期定为６个月。且本疫苗仅用于健康动物的预防接，对己感染发病或处于潜伏期的动物无治疗作用，甚至用可能加重患病动物的病情。Ｈ联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果显示：兰联苗与相应单苗在抗体的消长规律上是相一致的。攻毒保护结果表明Ｈ联苗与单苗均能抵抗住相应强毒的攻击。Ｈ联活疫苗与同类商品苗的比较研究结果显示；在安全性和免疫效力方面与商品化五联活疫苗的一致效果基本；在病毒含量和免疫持续期方面略好于商品化疫苗；而且Ｈ联活疫苗可用于怀孕母犬的免疫，这是目前商品化疫苗所达不到的，是本Ｈ联苗的绝对优势。－５－１ 东北林业大学博±学位论文结论１．本研究分别成功从国内临床发病犬的病料组织中分离到ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ野毒－－－。株，其中ＣＤＶ属于ＡｓｉａＩ亚型，ＣＰＶ属于ＣＰＶ２ａ亚型，而ＣＡＶ属于ＣＡＶＩ型且３株病毒分离株均与目前广泛应用的商品化疫苗株核巧酸同源性相差较大，提示我们可能导致目前疫苗免疫失败的原因，及适用于目前优势流行毒株的疫苗的研制。－２－．本研巧创新性地分别将ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ野毒株在ＣＥＦＶｅｒｏＣＥＦ、ＣＲＦＫ及ＭＤＣＫ连续传代致弱，成功培育出细胞适应性和免疫原性良好的弱毒疫苗候选株，为。一Ｖ－３．ＣＤ、ＣＦＶ和ＣＡＶＩ弱毒株按定比例与稳定剂混合后，成功制备Ｈ联活疫苗。该疫苗具有良好的安全性和免疫原性。与商品化五联活疫苗相比，两者在安全性基本一一致；在免疫效力方面Ｈ联苗略胜筹，并且在病毒含量和免疫持续期方面Ｈ联苗均优于商品化疫苗。目前商品化的疫苗不适合于怀孕母犬的免疫，而本研究中制备的Ｈ联活疫苗免疫怀孕母犬则具有绝对的安全优势。－５２－ 参考文献参考女献［１］ＡｐｐｅｌＭＪ，ＹａｔｅｓＲＡ，ＦｏｌｅｙＧＬ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｌ；ｅｍｐｅｒｅｐｉｚｏｏｔｉｃｉｎｌｉｏ打Ｓ，ｔｉｇｅｒｓ，ａｎｄｒｔｈＡｍ－ｔＩｔ４２７７２８８ｌｅｏａｒｄｓｉｎＮｏｅｒｉｃａ？ＪＶｅＤｉａｎ打ｖｅｓ．１９９６３：ｐ口］ｇ，（）Ｋｕ－２ＫｅｎｎｅｄＳｉｋｅ打ＴＪｅｓｏ打ＰＤｅｔａｌ．ＭａｓｓｄｉｅｏｆｏｆＣａｓｉａｎｓｅａｌｓｃａｕｓｅｄｂｃａｎｉｎｅ［］ｙ，，ｐ，ｐｙ＊－ｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓ．２．ＥｍｅｉＩｎｆｅｃｔＤｉｓ０００６６：６３７６３９ｐ阴ｇ，（）－－３ＣｈａｕｉｓＧ．Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔ．Ｖ．１４４ｃａｎｉ打ｅｄｉｓｅｍｅｒＪｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ９９５４：３５１３５８［］ｐｐｐ口］，口）４刘彥，张旭，郑策等．我国毛皮动物养殖现状与发展对策研究机．中国畜牧杂志，［］，２０４６１－１１０８：１０３，（）５刘君君．Ｊ．中［］，卢亚楠，金礼吉，等中国毛皮动物养殖现状及发展趋势［］国皮革，２００７３６１１１８－２１：，（）６ＳａｋａｉＫＮａａｔａＮＡｍｉＹｅｔａｌ．Ｌｅｔｈａｌｃａｎｉ打ｅｄｉｓｔｅｕｓ；ｅｉｎｒｖｉｍｓｏｕｔｂｒｅａｋｉｎｃｎｏｍｏｌ［］，ｇ，，ｐｙｇ－ｍｏｎｋｅｓｉｎＪａａｎｉｎ２００８Ｊ．ＪＶｉｒｏｌ２０１３１１０５１１１４．８７：ｙｐ［］，口）Ｚｔ－７ＳｕｎＬｉＡＹｅＨｅａｌ．Ｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｗｉｔｈｃａｎｉ打ｅｄｉｓｌ；ｅｍｅｒｖｉｍｓｉ打ｈａｎｄｆｅｅｄｉｎｇ［］，，，ｐ－－ＲｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓｉｎＣｈｉ打ａ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０１４１４：３７４３７８口］，口）８ＹａｎｇＳＷａｎｇＳＦｅｎＨｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｌｉｎｅａｎｌｅｕｋｏｅｎｉａ［］，ｇ，ｐ，ｐ－－ｖｉｍｓｆｒｏｍａｄｉａｒｒｈｅｉｃｍｏｎｋ巧阴．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０１４３４：１５５１５９，口）［９］ＭｏｎｔｅｉｒｏＧＳ，ＦｌｅｃｋＪＤ，ＫｌｕｇｅＭ，ｅｔａｌ．Ａｄｅ打ｏｖｉｒｕｓｅｓｏｆｃａｎｉｎｅａｎｄｈｕｍａｎｏｒｉｇｉｎｓｉｎｓｔｏｏａｍｌｅｓｆｒｏｍｆｒｅｅ－ｌｉｖｉｎａｍａｓｆｏｘｅｓ＜ｉｔａｌｉｃ＞Ｌｃａｌｏｅｘｍｎｏｃｅｒｃｕｓ＜／ｉａｌｉｃ＞ｌｓｐｇｐｐ（ｙｐｇｙｔ）ａｎｄｃｒａｂ－ｅａｔｎｓ＜ａｃ＞ｅｒｄｏｃｏｎｔｈｏｕｓ＜ａｃ＞ｉ打ａ〇Ｆｒａｎｃｓｃｏｅａｕａｉｇｆｏｘｅ（ｉｔｌｉＣｙ／ｉｔｌｉ）ＳｉｄＰｌＲｉｏ，＂ｓｓａｓｉｎｒａｚｉｏｌ２０２ｕｌ－ｄｏＳｉｎｏｂＪ：１１１６．ＢＪＢ．１５７５Ｓ［］，（ｐｐ）＇－－Ｎ－１０ＲｕｂｉｏＧｕｅｒｒｉＣＧａｒｃｉａＰｄｒｒａａＤｉｅ１；ｏＰｅｌｅｎＥｅｔａｌ．Ｎｏｖｅｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ［］，ｇ，ｇｒｉ，ｔｅｔ－ｃａｉｖｂｏｔｌｅｎｏｓｅｄｏｌｐｈｉｎｓＴｕｒｓｉｏｐｓｔｒｕｎｃａｔｕｓｓｕｆｆｅｒｉｎｇｆｒｏｍｓｅｌｆｌｉｍｉｔｉｎｇｐ（）ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓＪ．ＢＭＣＶｅｔＲｅｓ．２０１５，７１１：５３［］（）１１Ｇ含１ＪＨｏｍｄｋＡｅｔａｌ．１ｔＭａｎｄｏｋｉＭＮｏｖｅｌｍａｓ；ａｄｅｎｏｖｉｍｓｉｎｆｅｃｉｏ打ａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌ［］，，，ｙｄｉｓｅａｓｅｉｎａｐｙｇｍｙｍａｒｍｏｓｅｔＣａｌｌｉｔｈｒｉｘＣｅｂｕｅｌｌａｍａｅａＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３（［］ｐｙｇ）［］，－１６７３－４（）：６９５６９９１２韩磊斬兴军郭峰等．虎犬瘋热病毒的分离与初步鉴定［Ｊ．中国兽医杂志０４，２０，［］，，，］４０２：３０（）＇１；３ＶａｎｄｅＢｔｉｋｅｎＶｉｓｅｅＡＭｅｔａｌ．Ｄｉｓｔｅｍｅｒｏｕｔｂｒｅａｋａｎｄｉｔｓｅｆｅｃｔ０打ｉｌｄＭＷＫｕＴ［］，，，ｐ２００２２－ｃａｎｗｉｌｄｄｏｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏ打？ＥｍｅｒＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．８：２１１２１３Ａ任ｉｇ口］ｇ，（）Ｋ＂［１４ｕ化ｅｎＫｅｎｎｅｄｙＳＢａｒｒｅｔｔＴ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅ２０００ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｅｐｉｄｅｍｉｃｉｎＣａｓｐｉａｎ］，ｓｅａｌｓＰｈｏｃａｃａｓｉｃａ：ａｔｈｏｌｏａｎｄａｎａｌｓｉｓｏｆＣＯ打ｔｒｉｂｕｔｏｒｆａｃｔｏｒｓ．ＶｅｔＰａｔｈｏｌ．２００６（ｐ）ｐｇｙｙｙ口］，－４３３：３２１３３８（）－ＭＬｔＡｔ１５民ｏｅｌｋｅＰａｒｋｅｒＥＭｕｎｓｏｎＰａｃｋｅｒＣｅａｌ．ｃａｎｉｎｅｄｉｓｅｍｅｒｖｉｍｓｅｉｄｅｍｉｃｉｎ［］，，ｐ，ｐｔ－ＳｅｒｅｎｇｅｔｉｌｉｏｎｓＰａｎｔｈｅｒａｌｅｏＪ．Ｎａｕｒｅ．１９９６３７９６５６４：４４１４４５（）［］，（）１６ＧｒｉｆｆｉｎＤＥ．ＧｌｏｂａｌｍｅａｓｌｅｓｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎＪｔ４２ＭｏｓｓＷＪ．ＮａＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６１：［］，［］，（）９００－９０８－５３－ 东北林业大学博±学位论文１７Ｖ０打ＭｅｓｓｌｉｎＶＳｎｆｅｌｄＣ，ＤｅｖａｕｘＰｅｔａｌ．Ａｆｅｒｒｅｔｍｏｄｅｌｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍ巧ｖｉｒｕｓ［］ｇ，ｐｒｉｇ，ｐｓｏｎｒｏ２００－ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ：ａｎｄｉｍｍｕｎｏｕｐｐｒｅｓｓｉ？ＪＶｉｌ．３７７２３１２５７９１２巧１饥，（）１８ＴａｌｏｒＪＷｅｉｎｂｅｒＲ，ＴａｒｔａｌｉａＪｅｔａｌ．ＮｏｎｒｅＫｃａｔｉｎｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｏｔｅｎｔｉａｌ［］ｙ，ｇｇ，ｐｇｐｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃａｎａｔｙｐｏｘｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎＦａｎｄｇ（）ｈｅｍａｒｏ－ｌｕｔｉｎｉｎＨＡｌｃｏｒｏｔｅｉｎｓＪ．Ｖｉｌ．１９９２１８７１：３２１３２８ｇｇ（）ｇｙｐ［］，（）１９ＤｅｅｍＳＬＳｅｌｍａｎＬＨＹａｔｅｓＲＡｅｔａｌ．Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｉｎｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ：江［］，ｐ，，ｐｒｅｖ－ｉｅｗ？ＪＺｏｏＷｉｌｄＭｅｄ．２０００３１４：４４１４５１饥，（）０ｖｏｎＭｅｓｓｌｉｎＶＱｅｚｕｅｎＮＺｈｅｎｅｔａｌ．ＮｅａｒｂｃｌｕｓｔｅｒｓｏｆｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＫｓｉｄｕｅｓ口］ｇ，，ｇｇＱ，ｙｇｇｔａ－ｔｓｔｅｓｕｓｉｎＳＬＡＭｄｅｅｎｄｅｎｃａｎｉｎｅｄｉｍｅｒｖｉｒｕｓｅｎｔｒｉｎｅｒｉｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｐｐｙｐｐｃｅ－ｌｌｓＪ．ＪＶｉｒｏｌ．２００５７９９：５８５７５８６２［］，（）口１ＩｔａｋｕｒａＣＮａｋａｍｕｒａＫＮａｋａｔｓｕｋａＪ巧ａｌ．Ｄｉｓｔｅｍｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｉｎｌｅｓｓｅｒａｎｄａｓｄｕｅ化］，，，ｐｐａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏ打ｏｆ泣ｃａｎｉ打ｅｄｉｓｔｅｍｅｒｌｉｖｅｖａｃｃｉ打ｅＪ．ＮｉｈｏｎＪｕｉａｋｕＺａｓｓｈｉ．１９７９４１：ｐ［］ｇ，口）５６－１５６６Ｍｏｎｉｔ－２２ＢｕｓｈＭｔａｌｉＲＪ目ｒｏｗｉｓｔｅｉｎＤｅａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｉｎａｌｅｓｓｅｒ［］，，，ｐａｎｄＪ－ａ．ＪＡｍｅｔＭｅｄＡｓｓｏｃ．１９７６１６９９：％９９６０ｐ［］Ｖ，（）２３ＫｏｔａｎｉＴＪｏＭＯｄａｉｒｉＹｅｔａｌ．Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｉｎｌｅｓｓｅｒａｎｄａｓ［］，ｙ，ｇ，ｐｐＡ－ｉｌｕｒｕｓｆｏｌｅｎｓ．ＮｉｈｏｎＪｕｉａｋｕＺａｓｓｈｉ．１９８９５１６：１２６３１２６６（ｇ）阴ｇ，（）２４ＥｖｅｒｍａｎｎＪＦ，ｅａｔｈｅｒｓＣＷＧｏｒｈａｍＪＲｅｔａｌ．Ｐａｔｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆｌｉｏｎ［］Ｌ，，ｇＰａｎｔｈｅｒａｌｅｏｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｉｎｆｅｒｒｅｔｓＭｕｓｔｅｌａｕｔｏｒｉｕｓｆａｒｏＪ．ＶｅｔＰａｔｈｏｌ．２００１３８３：（）（）［］，（ｐ）３－１１３１６ａｒｅｒ８Ｂｅ—口５］ＢａｕｍｔｎｅｒＷＡｌｌｄｉｎｉｎｅｋｅＡｅｔａｌ．Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓａｎａｅｎｔｇ，ｇ，，ｐｇ－ｌｏｏｋｉｎｆｏｒｎｅｗｈｏｓｔｓ［Ｊ．ＤｔｓｃｈＴｉｅｒａｒｚｔｌＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．２００３１１０４：１３７１４２ｇ］，（）［２６］ＲｉｍａＢＫ，ＤｕｐｒｅｘＷＲＭｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅ阴？ＪＰａｔｈｏｌ．２００６，２０８（２）：９９－１２１４－２７蔡宝祥．：３５［］．家畜传染病学（第兰版）［Ｍ］北京中国农业出版社．２００１３４７１，［２巧ＭａｅｓＲＫ，ＷｉｓｅＡＱＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＳＤ，ｅｔａｌ．ＡｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｏｕｔｂｒｅａｋｉｎＡｌａｓｋａ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｓｔｒａｉ打ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＪＶｅｔＤｉａｇｎＩｎｖｅｉｓｔ．－２００３１５３：２１３２２０，（）口９］ＨａａｓＬ，ＬｉｅｒｍａｉｍＨ，Ｈａｒｄｅｒ了Ｃ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＨｇｅｎｅ，ｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄＫ－ｇｉｏｎａｎｄ化ｅｐｒｏｘｉｍａｌｃｏｄｉｎｇｐａｒｔｏｆ化ｅＦｇｅｎｅｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅａｎｄｖａｃｃｉｎｅｃａｎｉｎｅｄｉｓｅｍｅｒ－－ｔｖｉｒｕｓｅｓ机．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９６９２：１５１８ｐ，（１）ａａｓＬａｒ－口０］ＨＭｔｅ打ｓＷＧｒｅｉｓｅｒＷｉｌｋｅＩ巧ａｌ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｈａｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｅｎｅｏｆ，，，ｙｇｇｇｃｕｒｒｅｎｔｗｉｄ－ｅｃａｎｉｎｅｄｉｓｅｍｅｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＧｅｒｍａｎｅｓｌｔｙｐｔｐｒｙＪ，ＶｉｒｕｓＲ．１９９７［］，－４８２：１６５１７１．（）口１ＩｗａｔｓｕｋｉＫＭｉａｓｈｉｔａＮＹｏｓｈｉｄａＥ巧ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｈｌｏｅｎｉｃａｎａｌｓｅｓｏｆｔｈｅ］，ｙ，，ｐｙｇｙｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＨｒｏｔｅｉｎｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓｆｒｏｍｎａｔｕｒａｌｌｉｎｆｅｃｔｅｄｄｏｓＪ．（）ｐｐｙｇ［］７８－ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．１９９７：３７３３８０，巧。）３２ＩｗａｔｓｕｋｉＫＴｏｋｉｏｓｈｉＳＨｉｒａａｍａＮｅｔａｌ．ＡｎｔｉｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅＨｒｏｔｅｉｎｓｏｆ［］，ｙ，ｙ，ｇｐｅ－－ｃａｎｉｎｅ出ｓｔｅｍｒｖｉｒｕｓｅｓＪＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００７１３４：２８１２８６ｐ［可，（）－５４－ 参考文献［３３］ＵｅｍａＭ，ＯｈａｓｈｉＫ，ＷａｋａｓａＣ，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅ打ｅｔｉｃａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｏｌｍｏｒｈｉｓｍａｎａｌｓｅｓｏｆｈｅｍａｌ山ｉｎｉｎＨｒｏ１；ｅｍｏｆｃａｎｎｅｄｉｓｌ；ｅｍｅｒｖｒｕｓｔｅｓｐｙｐｙｇｇ（）ｐｉｐｉｉｓｏｌａｆｒｏｍｄｏｍｅｓｔ－ｉｃｄｏｇｓｉｎＪａｐａ打Ｊ．Ｖｉｍｓ民ｅｓ．２００５１０９１：５９６３［］，（）３４ＭｏｃｈｉｚｕｋｉＭ，ＨａｓｈｉｍｏｔｏＭ，ＨａｇｉｗａｒａＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ［］ｄｅ１；ｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅｓｏｆｒｅｃｅｎｔｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｄｏｇｓｉｎＪａｐａｎ２９％－Ｊｌｉｎｉｃｒｏｂｉｏｌ１９９９９：２９４２［］．ＪＣＭ．３７，（）－ｕｅｎｃｅｍｏｄｕ３５ｖｏｎＭｅｓｓｌｉｎＶＣａｔａｎｅｏ民．Ａｍｉｎｏ１；ｅｒｍｉｎａｌｒｅｃｕｒｓｏｒｓｅｌａｔｅｓｃａｎｉｎｅ［］ｇ，ｐｑ－ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓｆＵｓｉｏｎｒｏ１；ｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎＪ．ＪＶｉｒｏｌ．２００２７６：４１７２４１８０ｐ［］，巧）－３６ＳｃｈｅｉｄＡ？仁ｈｏｐｐｉ打ＰＷＴｗｏｄｉｓｕｌｆｉｄｅｌｉｎｋｅｄｏｌｅｔｉｄｅｃｈａｉ打ｓＣＯ打ｓｔｉｔｕｔｅｔｈｅａｃｔｉｖｅＦ［］，ｐｙｐｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｒａｍｘｏｖｉｒｕｓｅｓＶｉ－ｐＪ．ｒｏｌ．１９７７８０１：５４６６ｐｙ［］，（）－３７ＡｌｋｈａｔｉｂＱＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＣＳｈｅｎＳＨ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｌｃｏｓｌａｔｉｏｎａ打ｄｃｅＵ［］，ｇｙｙ，，ｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅａｓｌｅｓｖｉｍｓｆｉｉｓｉｏ打ｐｒｏｔ：ｅｉ打（Ｆ）ｅ打ｃｏｄｅｄｂｙａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖ－ｉｒｕｓＪＶｉｒｏｌ１７５１：２６２２７０］．．１９９０［，（）３８ＣａｍｐｂｅｌｌＪＪ，ＣｏｓｂｙＳＬ，ＳｃｏｔＪＫ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐａｒｉｓｏ打ｏｆｍｅａｓｌｅｓａｎｄｃａｎｉ打ｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒ［］－ｖｉｍｓｏｌｔｉｄｅｓ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．１９８０４８：１４９１５９ｐｙｐ巧［Ｊ，］ｙ）Ｗａ－３９ＧｈｏｓｈＳｌｋｅｒＪＪａｃｋｓｏ打ＤＣＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆｃａｎｄ打ｅｈｅｌｅｒＴｃｅｌｌｅｉｔｏｅｓｆｒｏｍｔｈｅ［］，，ｐｐｐｆｔ－ｉｓｉｏｎｒｏｔｅｉｎｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ２００１０４１：５．１８６６ｐｐ口］ｇｙ，（＾）［４０ＢｏｌｔＱＪｅ打ｓｅ打ＴＤ，ＧｏｔｔｓｃｈａｌｃｋＥ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅａｔｔａｃｈｍｅｎｔＨ）ｐｒｏｔｅｉｎ］（ｇｅｎｅｏｆｃｕｒｒｅｎｔ打ｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｂｍｐｅｒｖｉｍｓ［？！］．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．１９９７，７８（Ｐｔ２）：－３６７３７２４１ｖｏｎＭｅｓｓｌｉｎｇＶ，ＺｉｍｍｅｒＱＨｅｎｉｅｒＱｅｔａｌ．Ｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉ打ｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ［］ｄｒｔｅｒｍ＾－ｉｎｅｓｔｒｏｉｓｍａｎｄｃｔｏａｔｈｏｅｎｉｃｉｔＶｉｒｏｌ１４：６４１ｐｙｐｇｙ［Ｊ］．Ｊ．２００１，（）８６４２７４２ＨｉｒａｙａｍａＮ，ＳｅｎｄａＭ，ＮａｋａｓｈｉｍａＮ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏ化ｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏ打ａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［］ａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌｃａｎｉｎｅｄｉｓｔ；ｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ口．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．１９９１７２Ｐｔ１１：］，（）２８２７－２８３０４３ＳｃｈａｄｅｃｋＥＢ，ＰａｒｔｉｄｏｓＣＤＦｏｏｋｓＡＲ，ｅｔａｌ．ＣＴＬ巧ｉｔｏｐｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｉ化ａｄｅｆｅｃｔｉｖｅ［］，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅａｓｌｅｓｖｉｍｓｎｕｃｌｅｏｒｏｔ：ｅｉｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏ打ｏｆｔｈｅｉｒｐｒｏａｃ－ｔｉｖｅｃａａｃｉｔｉｎｍｉｃｅＪＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９９６５：ｐｐｙ．１八８６［］，（）４４ＹｏｓｈｉｄＥＳｈｉｎＹＳＩｗａｔｓｕｋｉＫ，ｅｔａｌ．Ｅｏｅｓａｎｄｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｓｅｓｏｆ［］，，ｐＵｐｙｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓｎｕｃｌｅｏｃａｓｉｄｒｏ１；ｅｉｎｂｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｏｆｉｔｓｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓＶｅｔｐｐｐｙｐ［Ｊ］．Ｍ－ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９６６４：３１３３２０，（）４５ＹｏｓｈｉｄａＥ，Ｉｗａｔｓｕｋｉ艮ＭｉｙａｓｈｉｔａＮ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆ化ｅ打ｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ［］，ｒｏ１；ｅｉ打ｏｆｒｅｃｅ打ｔｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓｉ打ＪａａｎＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１ｐｐ［］．９９８ｐ，－－５９２３：２３７２４４（）４６ＢｅｌｌｉｎｉＷＪＥｎｇｌａｎｄＧＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＣＤｅｔａｌ．Ｍａｔｒｉｘｅｎｅｓｏｆｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓａｎｄｃａｎｉｎｅ［］，，ｇ，ｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓ：ｃｏｎｎｎｕｃｅｏｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｓａｎｄｅｄｕｃｅａｍｉｎｏａｃｉｄｅｕｅｎｃｅｓＪ．Ｊｐｌｉｇ，ｌｔｑ，ｄｄｓｑ［］Ｖｒｏｌ１９８６５８－４１６ｉ．：４０８，（巧［４７］Ｏｌｓｏ打Ｐ，ＨｅｄｈａｍｍａｒＡ，ＫｌｉｎｇｅｂｏｍＢ．Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｉ打ｆｅｃｔｉｏ打，ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒａｎｄｉ打ｆａｃｔｉｏｕｓｃａｎｉｎｅｈｅａｔｔｓ：ｉ打ｃｌｉｎａｉｏ打ｔｏｃｃａｅａｎｄａｎｔｉｂｏｄｅｓｏｎｓｅｔｈｅｐｉｉｔｖａｉｎｔｙｒｐｉｎ－５５－ 东化林业大学博±学位论文ｓｏｕａＡｃ－Ｓｗｅｄｉｈｄｏｇｌｔｉｏ打Ｊ．ｔａＶｅｔＳｃａｎｄ．１９９６３７４：４３３４４３ｐｐ［］，（）４８Ｄｉａｒｉｖｒｕｓｒｏｕ：ｅｎｏｍｅｏｒａｎａｔｉｏｎａｎｄｒｔｅｉｎｓ，ｉｃｒｏ．ｌｌｏＡ．ＭｏｂｉｌｌｉｇｉｓｏＪＶｅｔＭｂｉｏｌ［］ｐｇｇｐ［］－－１９９０２３１４：１巧１６３，（）４９ＳｉｄｈｕＭＳＭｅｎｏｎｎａＪＰＣｏｏｋＳＤｅｔａｌ．ＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓＬｅｎｅ：ｓｅｕｅｎｃｅａｎｄ［］，，，ｐｇｑａｓｏｎ－ｃｏｍｒｉｗｉｔｈｒｅｌａｔｅｄｖｉｒｕｓｅｓｉｒｏｌ：ｐ．Ｖ．１９％巧３１５０６５．饥，（）夏咸柱？５．犬癌热的诊断及其预防免疫的研究进展Ｊ动物医学进展２００１［巧何洪彬，［，］，－２２１：１２１４（）５Ｃｈａａｎｅｅｍｅｒｃｒｏｂｏ－－ｕｉｓＧＣｏｎｔｒｏｌｏｆｃｉｎ出ｓｔ．ＶｅｔＭｉｉｌ．１９９５４４４：３５１３５８［Ｕｐｐｐ阴，口）５２ＡｎｄｅｒｓｏｎＳＬＣａｖｅｎｄｅｒＪｅｔａ－ＷｉｌｌｉａｍｓＥＳｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｌａｃｋｆｏｏｔｅｄ［］，，，ｆｅｒｒｅｔＭｕｓｔｅｌａｎｉｒｉｅｓｘＳｉｂｅｒｉａｎｏｌｅｃａｔＭ．ｅｖｅｒｓｍａｎｎｉｈｂｒｉｄｓａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃｆｅｒｒｅｔｓ（ｇｐ）ｐ（）ｙＭ－．ｕｔｏｒｉｕｓｆｉｉｒｏａａｉｎｓｔｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｉｎｅｒＪ．ＪＷｉｌｄＤｉｓ．ｌ９９６３２：４１７＾３（ｐ）ｇｐ［＾］，９）５３ＭｏｎｔａｌｉＲＪ呂ａｒｔｚＣＲＴｅａｒｅＪＡｅｔａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｗｉｔｈｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖａｃｃｉｎｅｓｉｎ［］，，，ｐ妨ｏｔＡ－ｉｃｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ．ＪＡｍＶｅｔＭｅｄｓｓｏｃ．１％３１８３１１：１１６３１１６７阴，（）料］ＳｈｅｐａｒｄＳＬ，ＣｏｏｐｅｒＲＪ，ＭｃＣｌｕｒｅＪ．Ｔｈｅｅｆｅｃｔｏ打ｃｈｉｃｋｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉ化ａｒａｍＪ－ｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．ＪＰａｔｈｏｌ．１９９６１７９４：４４８４５２ｐｙ［］，（）口５］ＳｃｈｍｉｄｔＰ，ＨａｆｈｅｒＡ，ＲｅｕｂｅｌＧＨ，巧泣１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ打ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ化ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｍｓｉｎｃｈｉｃｋｅ凸ｅｓｆｏｒｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒＪ．ＺｅｎｔｒａｌｂｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄＢ１９８９３６ｇｇｙ［］，，９－：６６１６６８（）［５巧夏咸柱，池元斌，余春，等？犬癌热病毒高压灭活疫苗的制备与应用的．中国兽药２０００３４２－８杂志：６，，（）［５７］ＮｏｒｒｂｙＥ，ＡｐｐｅｌＭＪ．Ｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ化ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｏｆ－ｄｏｓｗｉ化ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄａｎｄｌｉｖｅｍｅａｓｌｅｓｖｉｍｓ？ｒｃｈＶｉｒｏｌ．１９８０６６：７７ｇ…Ａ，。）１６９１５８Ｏｌｓｏｎ巧ＨｅｄｈａｍｍａｒＡＫｌｉｎｅｂｏｍＢ．Ｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒ［］，ｇｐ，ｐａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃａｎｉｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ｉｎｃｌｉｎａｔｉｏ打化ｖａｃｃｉｎａｔｅａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏ打ｓｅｉｎｔｈｅｐ－Ｓｗｅ化化ｄｏｏｕｌａｔｉｏｎ口］．ＡｃｔａＶｅｔＳｃａｎｄ．１９９６３７４：４３３４４３ｇｐｐ，（）５９ＭｃＣａｗＤＬＴｈｏｍｓｏ打ＭＴａｔｅＤｅｔａｌ．Ｓｅｒｕｍｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓａｎｄａｒｖｏｖｉｍｓ［］，，，ｐｐｐａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓａｍｏ打ｇｄｏｇｓｂｒｏｕｇｈｔ化ａｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｈｏｓｐｉｔａｌｆｏｒｒｅｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＡｍｅ－ＶｔＡｓｓｏｃ．１９９８２１３（１）：７２７５，６０ＧｉｌｌｅｓｐｉｅＪＨ．Ｔｈｅｓｉｎｉ打ｃａｎｃｅｏｆａｓｓｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｉｃａｌｔｅｓｔｓｕｓｅｄｉ打ｔｈｅ［］ｇｐｙｇｍ－ｓｔｕｄｏｆｄｉｓｔｅｍｅｒ？ＪＡＶｅｔＡ巧ｏｃ．１９６６１４９（５：６２３６３２ｙｐ阴，）－６蔡宝样？：？３０４？家畜传染病学（第Ｈ版）［Ｍ北京中国农业出版社１９９９３０１［Ｕ］，６２何洪彬．犬遍热病致弱、Ｈ基因变异及其与病毒病原性相关性的研究Ｄ．解放军［］［］军需大学，２０００６３ＶａｎｄｅｖｅｌｄｅＭ，ｕｒｂｒｉｅｎＡ．Ｄｅｍｅｌｉｎａｔｉｏｎｉｎｃａｎｉ打ｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏ打：泣［］Ｚｇｇｙｐｒｅｖ－ｉｅｗＪ．ＡｃｔａＮｅｕｒｏａｔｈｏｌ２００５１０９：５６６８［］ｐ，，。）［６４］ＳｔｒａｓｓｅｒＡ，ＭａｙＢ，ＴｅｌｔｓｃｈｅｒＡ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｅｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈ－ｖａ－ｐｏｌｙｌｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｉｎｄｏｓ…？ＶｅｔＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００３，９４（３４）：１１３１２１ｇ６５ＲｏｓｓＰＳｄｅＳｗａｒｔＲＬ，ＶｉｓｓｅｒＩＫ巧ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｖｅｉｍｍｎｎｏｃｏｍｅｔｅｎｃｅｏｆｔｈｅｎｅｗｂｏｒｎ［］，，ｐｈａｒｂｏｕｒｔ－－化ａｌＰｈｏｃａｖｉｔｕｌｉｎａ．ＶｅｔＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏａｈｏｌ．１９９４４２４：３３１３４８，…ｐ，口） 参考文献６６ｌｉｄａＨＦｕｋｕｄａＳＫａｗａｓｈｉｍａＮｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｏｆｔｌｍａｅｒｎａｌｌｄｅｒｉｖｅｄａｎｔｉｂｏｄｅｖｅｌｓｏｎ［］，，，ｙｙ＊化ｍａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｎｓｅｓｔｏｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｃａｎｉ打ｅｄｉｓｅｒｖｉｍｓａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃａｎｉｎｅｙｐｐ，ｐ—ｈｅａｔｉｔｔｔ．１１ｉｓｖｉｍｓａｆｔｅｒｖａｃｃｉ打ａｉｏ打ｓｉｎｂｅａｌｅｕｉｅｓＪ．ＪｉｋｋｅｎＤｏｂｕｓｕ９９０３９１：９９ｐｇｐｐｐ［］，（）Ａｎｏ＇６７Ｌｉｎｃｏｌ打ＪｔｈｔｔｔｔＪ．ＪＡｍＶｅｔ．ｅｒｉ打ｅｒｒｅｔａｉｏｎｏｆｆｅｒｒｅｓｒｅａｃｔｉｏｎｔｏｖａｃｃｉｎａｉｏ打Ｍｅｄ［］ｐ［］Ａｓｓｏｃ．２００３２２３８：１１１２，（）６８ＢｅａｕｖｅｒｅｒＰＣａｒｄｏｓｏＡＩＤａｖｉｅｔＬｅｔ过１．Ａｓｉｓｏｆ山ｉｏｎＴＬｔｓｎａｌ化ｅｃｏｎｔｒｉｂＣｅｉｏｅｉｎ［］ｇ，，，ｙｐｐ－１Ｖｉ１１３３１；ｈｅｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｏｆｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．ｒｏｌ．１９９６２１９：３９ｇｙ［］，（＾）［６９］ＮｏｒｒｂｙＥ，ＵｔｔｅｒＱＯｒｖｅｌｌＣ，巧ａｌ．Ｐｒｏ化ｃｔｉｏ打ａｇａｉ打Ｓｔｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓｉｎｄｏｇｓ－ａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｓｏｌａｔｅｄｆｌｔ．５８５３５４ｉｓｉｏ打ｒｏ；ｅｉ打．ＪＶｉｒｏｌ１９８６：６１ｐ口］，口）７０ＤｅＶｒｅｓｅｓｔｅｒａｕｓＡａｎ打ｅｔｅｍｅｖｓ－ｓｔｍｕａｔｎｉＰＵｙｔｄｈａａｇＦＱＯｈＤ．Ｃｉｄｉｓｒｉｍｉｍｍｕｎｅｉｌｉ［］，ｐｇｃｏｍｐｌｅｘｅｓＩｓｃｏｍｓｂｕｔ打ｏｔｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｉｓｃｏｍｓｒｏｔｅｃｔｄｏｓａａｉｎｓｔＣＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏ打．（）ｐｇｇ饥Ｊｅｎ－ＧＶｉｒｏｌ．１９８８６９Ｐｔ８：２０７１２０８３，（）－７１７孔庆波？犬癌热免疫预防研究进展［Ｊ．动物医学进展．２００２８６：６９７５［］］，（）７２ＳｉｘｔＮＣａｒｄｏｓｏＡＶａｌｌｉｅｒＡｅｔａｌ．ＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓＤＮＡｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓ［］，，，ｐｈｕｍｏｒａｌａ打ｄｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｔａｎｄｒｏ１ｔｔｔｔｒＪ．Ｊｙｐ：ｅｃｓａｇａｉｎｓａｌｅｈａｌｉｎａｃｅｒｅｂｒａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ［］Ｖ－ｉｒｏｌ．１９９８７２１１：８４７２８４７６，（）－７３ＣｈｅｒｉｌｌｏｄＴｉｏｌｄＡＧｒｉｏｔＷｅｎｋＭｅｔａｌ．ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅ打ｃｏｄｉｎｍｉｃｌｅｏｃａｓｉｄａｎｄ［］ｐｐ，，ｇｐｓｕｒｆａｃｅｐｒｏ１：ｅｉｎｓｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｍｓｐｒｏｋｃｔｓｉｔｓｎａｔｕｒａｌｈｏｓｔａｇａｉｎ巧ｄｔ２９２７－ｉｓｅｍ巧．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００１８６：２Ｗ６ｐ阴，口）Ｍ－７４ＦｉｓｃｈｅｒＬＴｒｏ打ｅｌＪＰｉｎｋｅＪｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆｕｅｓｗｉｔｈａｌｉｉｄｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ［］，，，ｐｐｐｉｐｌａｓｍｉｄｖａｃｃｉ打ｅｒｏ１；ｅｃｔｓａａｉｎｓｔａｓｅｖｅｒｅｃａｎｉｎｅｄｉｓ：ｅｍｅｒｖｉｍｓｃｌｅｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｐｐ１ｐｈａｌＪ］ｇｇ［－２００３－２２１１１１：１０９９１１０２，（）［７５］ＤａｈｌＬ，Ｊｅ打ｓｅｎＴＨ，Ｇｏ行ｓｃｈａｌｃｋＥ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ打ｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎ呂ｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄ化ｅ打ｕｃｌｅｏｐｒｃｒｔｅｉｎｃｏｎｆｅｒｓｒｏｂｕｓｔｐｒｏｔ：ｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔａｌｅ化ａｌｃａｎｉｎｅ－ｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓｃｈａｌｌｅｎｅＶａｃｃｉｎｅ４２２２７２８－ｄ：；ｐ［Ｊ．．２００３６４２３６４８ｇ］，（）７６徐向明，崔治中，殷俊，等．犬痘热病毒中国分离株囊膜糖蛋白基因免疫小鼠诱发［］－的抗体应答Ｊ．中国预防兽医学报２００３２５：４１９４２３［］，，巧）７７徐向明朱善元张泉等．犬癌热病毒ＤＮＡ疫苗接种犬的免疫保护Ｊ，中国兽医［］，，，［］２８９－学报２００８：１０１１１０１４，，（）７８徐向明，朱善元，薛整风，等．犬痘热病毒基因免疫的探索Ｊ，扬州大学学报，［］［］－２００８巧３：４２４５，（）．７９孙建涛．基于甲病毒复制子的犬癌热核酸疫苗的构建及表达特性研究［Ｍ］天津农［］学院，硕±论文，２０１３８０－徐向明朱善元张泉等．ＣＧＯＤＮ増强表达犬痘热病毒Ｈ蛋白重组质粒免疫［］，，，ｐ－效果的分析的．畜牧兽医学报２００８３９１２：１７３７１７４２，，（）［８１］ＴａｙｌｏｒＪ，ＰｉｎｃｕｓＳ，ＴａｒｔａｇｌｉａＪ，ｅｔａｌ．ＶａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｉｔｈｅｒｔｈｅｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎｏｒｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｌｃｏｒｏｔｅｉｎｒｏｔｅｃｔｄｏｓａａｉｎｓｔｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｇｙｐｇｇｐｐｅＪ－ｖｉｒｕｓｃｈａｌｌｅｎｇ．ＪＶｉｒｏｌ．１９９１６５８：４２６３４２７４［］，（）［８２］ＷｉｌｄＴＦ，ＢｅｒｎａｒｄＡ，ＳｐｅｈｎｅｒＤ，ｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｅａｇａｉ打ｓｔｃａｎｉｎｅｄｉｓｋｍｐｅｒ－５７－ 东北林业大学博±学位论文－ｃｅｄｅｎｃｅｖｉｒｕｓｉｎｄｕｈａｌｉｔｉｓｗｉｔｈｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｎｃｏｄｉｎｍｅａｓｌｅｓｏｒｃａｎｉｎｅｐｇ－ｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓａｎｔｉｇｅｎｓ？Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９３１１４：４３８４４４ｐ口］，（）８３ＪｏｎｅｓＬＴｅｎｏｒｉｏＥＧｏｒｈａｍＩｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆ拓ｒｒｅｔｓａａｉｎｓｔｃａｎｉｎｅ［］，，，ｇ出ｓｔｅｍｅｒｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｘｖｉｍｓｖａｃｃｉｎｅｓｅｘｒｅｓｓｉｎｔｈｅＨｏｒＦｅｎｅｓｏｆｒｉｎｄｅｒｅｓｔｐｐｐｇｇｐ５８６－巧３ｖｉｍｓ．ＡｍＪＶｅｔＲｅｓ．１９９７：巧０口］，（）巧句ＳｔｅｐｈｅｎｓｅｎＣＢＷｅｌｔｅｒＪＴｈａｋｅｒＳＲ巧ａｌ．ＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｖｉｍｓＣＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆ，，，ｐ（）＂ｆｅｒｒｅｔｓａｓａｍｏｄｅｃｃｅ－ｌｆｏｒｔ；ｅｓｔｉｎＭｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｖａｉｎｓｔｒａｔｅｉｅｓ：ＮＹＶＡＣａｎｄＡＬＶＡＣｇｇｂａｓｅｄＣＤＶ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｐｒｏｔｅｃｔａａｉ打ＳｔｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．ＪＷｏＬ１９９７７１２：ｇ［］，（）－１５０６１５１３Ｗｅ＇８５ＴａｌｏｒＪｉｎｂｅｒ民ＴａｒｔａｌｉａＪｅｔａｌ．ＮｏｎｒｅＫｃａｔｉｎｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｏｔｅｎｔｉａｌ［］ｙ，ｇ，ｇ，ｐｇｐｖａｃｃ＾ｉｎｅｓ：ｉｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓｅｘｒｅｓｓｉｎｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｆｕｓｉｏｎＦａｎｄｐｇ（）ｈｅｍａ－ｌｕｔｉｎｉｎＨＡｌｃｏｒｏｈｉｎｓＪ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２１８７１：３２１３２８ｇｇ（）ｇｙｐ［］，（）８６ＰａｒｄｏＭＣＢａｕｍａｎ祀ＭａｃｋｏｗｉａｋＭ．Ｐｒｃｒｔｅｃｔｉｏ打ｏｆｄｏｓａａｉｎ巧ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｅｒｂ［］，，ｇｇｐｙｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈ江ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｍｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅ巧ｉｎｇｃａｎｉｎｅ出ｓｔｅｍｐｅｒｖｉｍｓｆｕｓ－ｉｏｎａｎｄｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｌｙｃｏｒｏｔｅｉｎｓＪ．ＡｍＪＶｅｔＲｅｓ．１９９７５８：８３３８３６ｇｇｇｐ［］，巧）８７ＷｅｌｔｅｒＪＴａｌｏｒＪＴａｒｔａｌｉａＪｅｔａｌ．Ｍｕｃｏｓａｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｘｖｉｒｕｓ［］，ｙ，ｇ，ｐｖａｃｃｉｎｅｒｏｔｅｃｔｓｆｅｒｒｅｔｓａａｉｎｓｔｓｍｔｏｍａｔｉｃＣＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．Ｖａｃｃｉｎｅｓｙ．１９９９１７４：ｐｇｐ［］，（）３０８－３１８８８Ｆ－［］ｉｓｃｈｅｒＬＴｒｏｎｅｌＪＰＰａｒｄｏＤａｖｉｄＣｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆｕｉｅｓｂｏｍ化ｉｍｍｕｎｅｄａｍｓ，，，ｐｐｐ－ｂａｓｄｖａｃｃｗｉｔｈ江ｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔ泣ｃａｎｉ打ｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓｃｈａ－－ｌｌｅｎｅ？Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２２０２９３０：３４８５３４９７ｇ…，（）［８９］ｖｏｎＭｅｓｓｌｉｎｇＶ，ＺｉｍｍｅｒＱＨｅｒｒｌ巧Ｇｅｔａｌ．Ｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｏｆｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｔｅｒｍｉｎｅｓ－ｖｉｒｕｓｄｅｔｒｏｉｓｍａｎｄｃｔｏａｔｈｏｅｎｉｃｉｔＪ．ＪＶｉｒｏｌ．２００１４：６４１８６４２７ｐｙｐｇｙ［］，）９０ＢａｔｉｌａｎｉＭＳｃａｌｉａｒｉｎｉＡＣｉｕｌｌｉＳｅｔａｌ．Ｈｉｈｅｎｅｔｉｃ出ｖｅｒｉｔｏｆｈｅＶＰ２ｅｎｅｏｆａ［］，ｓｔ，ｇ，ｇｇｙｇｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖ－ｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎａｄｏｍｅｓｔｉｃｃａｔＪ．Ｖｉｒｏｌ．２００６３５２：２２２６［］，ｙ）ｐ口１］ＡｅｌＭＪＳｃｏｔＦＷＣａｒｍｉｃｈａｅｌＬＥ．Ｉｓｏｌａｔｉｏ打ａｎｄｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆａｃａｎｉｎｅｐｐ，，－ａｒｃｏ－ｌｉｋｅｖｉｒｕｓｆｒｏｍｄｏｇｓｗｉｔｈｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＶｅｔＲｅｃ．１９７９１０５８：１５６ｐ，（）１５９９２－梁±哲渠川攻魏喜仁等．犬传染性肠炎的研究Ｉ腹泻犬粪便中检出的细小病［］，，，毒颗粒［可上海畜牧兽医通迅１％２２４：１７２，，（）［９３］徐汉坤，郭保发，金淮，等．血凝和血凝抑制试验在犬群暴发犬细小病毒肠炎中的应８３４－．中国畜禽传染病：４３４５阴，１９，（）９４ＤｅｃａｒｏＮＤｅｓａｒｉｏＣＰａｒｉｓｉＡｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｔｅ２ｃＪ．［］，，，ｙｐｙｐ［］３８５－Ｖｉｒｏｌ．２００９１：５１０，（）［９５］ＤｏｋｉａＭ，ＦｕｊｉｔａＫ，ＭｉｕｒａＲ，ｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＶＰ２ｇｅｎｅｏｆｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｏｍｅｓｔｉｃｄｏｇｓｉｎＪａｐａｎｉｎ１９９９ａｎｄ２０００［Ｊ］．ＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ－ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２９４：１９９２０６．２００６（，）［９６］ＣｈａｐｍａｎＭＳ，ＲｏｓｓｍａｎｎＭＧＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓａｍｏｎｇ－ａｒｖｏｖ＊ｉｒｕｓｅｓｉｒｏｌ９ｐｍ．Ｖ．１９５３１９４：４１５０８，口）－－５８ 参考文献［９７］ＩｋｅｄａＹ，ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＭｉｙａｚａｗａＴ，ｅｔａｌ．Ｆｅｌｉ打ｅｈｏｓｔｒａｎｇｅｏｆｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：Ｒｅｃｅｎｔ－ｅｍｅｒｅｎｃｅｏｆｔｔｓ．ＥＩｎｆｅｃｔ４３１４６ｎｅｗａｎｉｅｎｉｃｔｅｓｉｎｃａＪｍｅｒＤｉｓ．２００２８：４３ｇｇｙｐ［］ｇ，（）＇Ｆ［９８ＰｅｒｅｚＲ，ｒａｎｃｉａＬ，ＲｏｍｅｒｏＶ，ｅｔａＬＦｉｒｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｃｉｎ］－－ＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２００７１２４１２１４７１５．：２［］，（）［９９］ＤｅｃａｒｏＮ，ＥｌｉａＱＭａｒｔｅｌｌａＶ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏ打ｏｆｔｈｅｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２Ｖ－ｖａｒｉａｎｔｓｕｓｉｎｇｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｂｉ打ｄｅｒｐｒｏｂｅ１；ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ．ＪｉｒｏｌＭｅ１；ｈ．２００６１３３１：９２］，（）９９－１００ＰａｒｒｉｓｈＣ民ＡｕａｄｒｏＣＦＳｔｒａｓｓｈｅｉｍＭＬｅｔａｌ．Ｒａｉｄａｎｔｉｅｎｉｃｔｅｒｅｌａｃｅｍｅｎｔａｎｄ［，，，ｇｙｐｐ］ｑｐ－ｕｅｎｃｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆ．ＪＤＮＡｓｅｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓＪＶｉｒｏｌ．１９９１６５１２：６５４４６５５２ｑｐ［］，（）１０１ＳｔｅｉｎｅｌＡｖａｎＶｕｕｒｅ打Ｍｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ打ｏｆＭｕｎｓｏｎＬｆｅｌｉ打ｅａｒｖｏｖｉｒｕｓ［］，，，ｐ＇巧－ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｃａｍｉｖｏｉｅｓＪ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．２０００８１２：３４５３５０［］，（）１０２ＭｏｃｈｉｚｕｌｄＭＨａｒａｓａｗａ民Ｎａｋａｔａｎｉｅｔ江１．Ａｎｔｉｅ打ｉｃａ打ｄｅｎｏｍｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｉｅｓａｍｏｎ［］，，，ｇｇｇｒｅｃｅｎｔｒｅｖａｌｅｎｔａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓｏｆｃａｎｉｎｅａｎｄｆｅｌｉｎｅｏｒｉｉｎｉｎＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｌｙｐｐｇＪａｐａｎ［Ｊ］．－－１９９３３８２：１１０，ｙ）［１０３］Ｇｒｅｅ打ｗｏｏｄＮＭ，ＣｈａｌｍｅｒｓＷＳ，ＢａｘｅｎｄａｌｅＷ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｂｍｏｎｏｃｌｏ打ａｌａｎｔａｎｄｔｔｏｎｅｎｚＶｔ民．１ｉｂｏｄｒｅｓｒｉｃｉｍｅａｎａｌｓｉｓＪ．ｅｅｃ９９６ｐｙｙｙｙ［］，－１３８２０；４９５４９６（）１０４Ｔｍｙｅ打ＵＰｌａｔｚｅｒＰａｒｒｉｓｈＣ民ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｅｎｉｃｔｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ａｍｏｎｃａｎｉｎｅ［］，Ｑ，ｇｙｐｇａｒｖｏｖ－ｉｒｕｓｅｓｉｎｄｏｇｓａｎｄｃａｔｓｉｎＧｅｒｍａｎｙ［Ｊ］．ＶｅｔＲｅｃ．１９９６１３８１５：３６５３６６ｐ，（）１０５ＴｍｅｎＵＳｌｉｎｄＡＢ．Ｄｉ：ｅｒｕｃｋｎｅｒＬｅｔａｌｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ打ｏｆａｎｔｉｅｎｃｔｅｓｏｆｃａｎｉｎｅｙ，，［］，ｇｙｐｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｉｎＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ＡｕｓｔｒｉａａｎｄＧｅｒｍａｎｙ［Ｊ］．ＳｃｈｗｅｉｚＡｒｃｈＴｉｅｒｈｅｉｌｋｄ．２０００，－１４２３：１１５１１９（）［１０６］ＢｕｏｎａｖｏｇｌｉａＣ，ＭａｒｔｅｌｌａＶ，ＰｒａｔｅｌｌｉＡ，ｅｔａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏ打ｏｆｃａｎｉｎｅ－ａｒｖｏｖｉｒｕｓｔｅ２ｉｎＩｔａｅｎＶｒｏ．２１：２１ｙｐｌｙＪ．ＪＧｉｌ００８２巧１２３０３０２５ｐ［］，（）１０７ＷａｎｇＨＣＣｈｅｎＷＤ，ＬｉｎＳＬｅｔａｌ．ＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓＶＰ２［］，，ｙｇｙｐ－ｅｎｅｉｎＴａｉｗａｎＪ．ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ．２００５３１２１７１１７４：ｇ［］，（）１０８ＳｔｅｉｎｅｌＡＶｅｎｔｅｒＥＨＶａｎＶｕｕｒｅｎＭｅｔａｌ．Ａｎｔｉｅｎｉｃａｎｄｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｃａｎｉｎｅ［］，，，ｇｇｙｔｅｒｎ－ａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓｉｎｓｏｕｈＡｆｒｉｃａＪｔｅｔＶｅ１ｐ．ＯｎｄｅｒｓｏｏｒＪｔ民化９９８６５４：２３９２４２［］ｐ，（）１０９苏建青孙明赵铁柱等．聚合酶链式反应在犬细小病毒分型鉴定中的应用Ｃ．［］，，，［］第七次小动物疾病学术讨论会论文集２００２９５－９８，，＊＊Ｍｅｈｎｅ［１１０ＰｅｉｅｉｒａＣＡＭｏｎｅｚｉＴＡ，ｒｔＤＨ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｄｅｒｉｚａｔｉｏ打ｏｆａｒｖｏｖｉｒｕｓｉｎ］，ｐ－ＢｒａｚｉｌｂｏｌＪ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２０００２１２７１３３ｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａ．＾：ｐｙｙ［］，（）１１１ＨｉｒａｓａｗａＴＫａｎｅｓｈｉｅＴＭＨｃａｚｕｋｉＫ．ＳｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓＤＮＡ［］，ｇ，ｐｔ－－ｂｈｅｎｅｓｔｅｄｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４４１１２：１３５１４５ｙｙ［叮，ｐ（＾）［１１２］ＣｈｉｎｃｈｋａｒＳＲ，Ｍｏｈａｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ目，ＨａｎｕｍａｎｔｈａＲａｏＮ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＶＰ２ｅｎｅｓｅｕｅ打ｃｅｓｏｆｃａｎｅａｒｖｏｖａｔｅｓ打ＩｎｄｉａＡｒ１１－ｉｎｉｒｕｓｉｓｏｌｉＪ．ｃｈＶｉｒｏｌ．２００６１５１９：８８ｇｑｐ［］，（）１８８７１１３ＤｏｋｉＭＦｕｉｔａＫＭｉｕｒａ民ｅｔａｌ．ＳｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆＶＰ２ｅｎｅｏｆｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓ［］，ｊ，，ｑｙｇｐｔ１ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｏｍｅｓｉｃｄｏｇｓｉ打Ｊａｐａｎｉｎ９９９ａｎｄ２０００Ｊ．ＣｏｍＩｍｍｕｎｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ［］ｐ－５９－ 东北林化大学博±学位论文ｎｆｅｃ－ＩｔＤｉｓ．２００６２９４：１９９２０６，（）４民ｅＡＰ＾ＥＶｅｒＴＪ．Ｎｕｃｅｏｔｅｓｅｕｅｎｃｅａｎｄｅｎｏｍｅｏｉａｎｚａｔｏｎｃａｎ１１ｅｄＪｏ打ｅｓＭｉｌｌｌｉｄｉｉｏｆｉｎｅ［］ｊ，ｑ呂ｇａｏｖｒｕｓＪＶｉｒｏｌ－ｒｖ．：２７６ｐｉＪ．１９８８６２１２６６［］，（）－１１５ＢｅｃｅｒｒａＳＰＫｏｃｚｏｔＦＦａｂｉｓｃｈＰｅｔａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ［］，，，ｐｒｏｔｅｉ打ｓｒｅｑｕｉｒｅｓｂｏｔｈａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍＲＮＡｓｐｌｉｃｉ打呂ａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｉ打ｉｔｉａｔｉｏ打ｓｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｔＪ．ＪＶｉｏｌ６２７４５２７５４．１９８８８：２ｐ［］，（）１１６ＴａｔｔｅｒｓａｌｌＰＣａｗｔｅＰＪＳｈａｔｋｉｎＡＪｅｔａｌ．Ｔｈｒｅｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｏｌｅｔｉｄｅｓｃｏｄｅｄｆｏｒｂ［］，，，ｐｙｐｐｙ－ｅｖｉｒｕｏｆ？Ｖｉ．ｍｉ打ｕｔｓｍｉｃｅ过ａｒｖｏｖｉｒｕｓＪｒｏｌ１９７６２０：２７３２８９，口］，。）ｐ１ｈｎｓｏｎＦＢＯｚｅｒＨＬＨｏａｎＭＤ－１７Ｊｏ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏ化ｉｎｓｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ］，［，ｇｇｐ－ｖ．ｉｒｕｓｅｓｔｅ３Ｊ．ＪＶｉｒｏｌ１９７１８：８６０ｙｐ，６％３［］（）１１８ＣｏｔｍｏｒｅＳＦＴａｔｅｒｓａｌｌＲＴｈｅａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｒｅｌｉｃａｔｉｎａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓＪ．［］，ｙｐｇｐ［］ＡｄｖＶｉｕｓ民ｅｓ７－ｒ：１．１９８３３９１７４，１１９ＰｅｒｅｉｒａＣＡＬｅａｌＥＳＤｕｒｉｇｏｎＥＬ‘Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｉｍｅｎｓｈｉｆｔａｎｄｄｅｍｏｒａｃｒｏｗｔｈ［］，，ｇｇｐｈｉｇ打ｃｒｅａｓｅａｓｓｏｃａｔｅｄｗｔｔｅｅｍｅｒｅ打ｃｅｏｆｈ－ｆｉｔｎｅｓｓｖａｒｉａｎｔｓｏｆｃａｎｉ打ｅａｒｖｏｖｕｓＪｉｉ．ｉｈｈｇｈｉｇｐｉｒ［］ｎｆｅｃｅｎｅｖｏ－ＩｔＧｔＥ：ｌ．２００７７３３９９４０９，（）－１２０ＥｕｓｔｅＡ．ｕａｏｖｔｃａｔｒｔｔ：ｒＫＮａｉｎＣＤｉａｒｒｈｅａｉ打ｉｅｓ：ｒｖｉｒｕｓｌｉｋｅａｒｉｌｄｅｍｏｎｓａｅｄｉｎｈｅｉｒ［］ｇ，ｐｐｐｐｐｆａｃｅｓＪｏｕｔｈｗｅｓｔＶｅｔ７７－．Ｓ．１９３０：５９６０［］，１２１ＬａｎｅｖｅｌｄＪＰＣａｓａｌＪＩＯｓｔｅｒｈａｕｓＡＤｅｔａｌ．Ｆｉｒｓｔｅｔｉｄｅｖａｃｃｉｎｅｒｏｖｉｄｉｎｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［］ｇ，，，ｐｐｐｇｐａａｉ打巧ｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｉｎｔｈｅｔａｒｅｔａｎｉｍａｌ：ｓｔｕｄｉｅｓｏｆｃａｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｉｎｄｏｓＪＶｉｒｏｌｇｇｐｇ［］．Ｊ．－４１９９４６８７：４０６５５１３，（）２ｉ１２ＰａｒｒｉｓｈＣ民〇ＣｏｎｎｅｌｌＰＨ￡ｖｅｒｍａｎｎＪＦｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏ打ｏｆｃａｎｉ打ｅａｒｖｏｖｉｒｕｓ［］，，，ｐＪ－．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８５２３０：１０４６１０４８，４７２９［］（）１２３ＪｉａｎＷＢａｋｅｒＨＪＳｗａｎｇｏＬＪｅｔａｌｕｃｌｅｉｃａｃｄｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ打ｒｏ１：ｅｃｔｓｓａａｎｓｔｇ．Ｎｉｉｄｏｇｉ［］，，ｐ，ｇ－ｃｈａｌｌｅｎｅｗｉ１：ｈｖｉｒｕｌｅｎｔｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓＪ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９８１６６：６０１６０７ｇｐ［］，（）一１２４邱薇范泉水李作生等．犬细小病毒核酸疫苗及其实验免疫研究Ｃ．第十次［］，，，［］全国养犬学术研讨会论文集２００５１９５－１９８，，１２５王瑞－２基因表达质粒对犬细小病毒ＶＰ２ＤＮＡ疫苗的免疫增强作用．白细胞介素［］Ｍ．河北农业大学２０１２［］，硕±论文，－１２６．犬白细胞介素７基因对犬细小病毒ＤＮＡ疫苗的免疫增强作用Ｍ孙岩．河北农［］［］业大学±论文２０１２，硕，－Ｍ１２７．河北贾启恒．犬ＧＭＣＳＦ对犬细小病毒ＶＰ２ＤＮＡ疫苗免疫增强作用的研究［］［］农业大学，硕±论文，２０１２－－１．２ＶＰ２ＤＮＡ２８陈慧慧忙与忙７基因对犬细小病毒疫苗的协同免疫增强作用［Ｍ．［］］河北农业大学，硕±论文，２０１３１２９ＨａｒｒａｃｈＢＢｅｎｋｏＭ．Ｐｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｓｓｅｕｅｎｃｅ，Ｍｅｔｈｏｄｏ［］，ｙｇｙｑＪｓＭｌ［］Ｍｅｄ－．２００７１３１９９３３４：２，ｅａｅｎｏｖｅｓａｒＪｔＢｌｌｔｉ－１３Ｋｏｔｏｏｕｏ．ａｎｉｎｄ．Ｖｎ．Ｉ５１１３５１４２．０ｌｓＧＣｉｒｕｓ：ｅｖｉｅｗｅｕｅＷｌ３：［］ｐｐ［］，（）－１３１ＡｅｌＭ．ｅａｄｅｎｏｖｔｙｅ１ｅｃｔｏｎｃａｎｔｔ．ＩＣａｎｉｎｉｒｕｓｐｉｎｆｉｉｎｅｈｅａｉｉｓｖｉｒｕｓｎ：Ｖｉｒｕｓ［］ｐｐ（ｐ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｏｆｃａｎｉｖｏｒｅｓＪ．ＡｅｌＭｅｔａ．ＡｍｓｔｅｒＳＰｕｂｌｉ１，ｌｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒｃｉｅ打ｃｅｓｈｅｒｓ９８７［，］ｐｐ，－６０－ 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东北林业大学博±学位论文８２３１５２ＰｅｅｖｎａｋＦＬ，ＴａｌｏｒＰＡ，ＷａｌｋｅｒＶＣ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃａｎｉｎｅｈｅａｔｉｔｉｓｍｏｄｉ打ｅｄｌｉｖｅｖｉｒｕｓ［］ｐｙｐｎ－ｖａｃｃｉｎｅｒｏｄｕｃｅｄｉｆｅｒｒｅｔｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓＪ．ＣａｎＶｅｔＪ？巧６０１：１８６１９３ｐ［］，巧）［１５３］周向阳殿军王忠海等．犬传染性肝炎（ＩＣＨ）弱毒细胞苗的临床应用效果，杨，，Ｊ－［］，中国养犬杂志１９９２８３：２２２３，，（）［１５４］张开霞．犬传染性肝炎核酸疫苗对Ｂｅａｇｌｅ犬的细胞免疫效果及免疫机制研究Ｍ，［］河北医科大学，硕±论文，２００９１５５邱薇范泉水李作生等．犬腺病毒基因疫苗及实验免疫研究［Ｃ］．中国畜牧兽医［］，，，学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会论文０５３－集，２０，１７３１９ＷｒｉｇｈｔＮＧＣｏｍｗｅｌｌ助，ＴｈｏｍｐｓｏｎＨ，巧ａｌ．Ｃａｎｉｎｅ化ｓｔｅｍｐｅ。ｃｕｒｒｅｎｔｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎ－ｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｎｏｓｉｓ［Ｊ］．ＶｅｔＲｅｃ．１９７４，９４（５）：８６９２ｇ５７培富．犬痘热病毒南京分离株的生物学特性鉴定［１］陈郭爱珍．中国兽，陆承平，等，３－医学报：２３１２３４，２０００２０，（）５８刘忠华钟领张侄等．ＰＣＲ方法检测犬细小病毒生长动态及与其它方法的比较［１］，，，－Ｊ．上海实验动物科学２０００２２：２０２２［］，，（１）［１５９］魏巍，李肖裝帅江冰，等犬细小病毒肥０７６１株的分离与鉴定化畜牧与兽医，－２００８４０７：１４，（）［１６０］符子华李淑霞呼西旦等．犬细小病毒新疆株的分离与初步鉴定［Ｊ，中国兽医，，，］－科技２４１１：２１２３，巧９４，（）［１６Ｕ李六金，李秦，张海，等．犬细小病毒流行毒株的分离与鉴定［Ｊ］．青海科技，２０００，７６－：９１２（）［１６２］杨涛，刘明，张云等．重组Ｈ５Ｎ３禽流感疫苗株在ＭＤＣＫ细胞中大规模増殖条，－Ｊ７巧３：１９０２０３件研究［．中国预防兽学报］，２００，（）［１６３］李秦金昌德李六金等．犬腺病毒Ｉ型流行毒株的分离与鉴定Ｊ．第四军医大，，，［］－学学学报２０００２１６：７３４７３５，，（）［１６４］王雷，夏咸柱，卫广森，等．犬腺病毒、犬细小病毒联合ＰＣＲ方法的建立与应用－２００３１９３：２拍２６５化病毒学报，（）。６引ＳｈｅｎＤＴＧｏｒｈａｍＪＲＥｖｅｒｍａｎｔｉＦＪ巧ａｌ．Ｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｎｄ，，，ｐｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｍｉｎｉｓｒｔａｔｉｏｎｏｆａｌｉｖｅａｔｅｎｕａｔｅｄ化ｓｔｅｍｅｒｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｉｎｆｅｒｒｅｔｓＶｅｔｐ町ｅｃ－Ｒ１９８４１１４：４２４３，，口）［１６６］郑颖邱薇李丽红，等．ＣＤＶＣＰＶＣＡＶＨ联ＤＮＡＪ．云南，，，，疫苗的实验免疫研巧［］２００７２９５－大学学报：５２９５３５，，（）１６７］张莉．狐絡源大痘热病毒分离株Ｆ基因序列分析及Ｈ、Ｆ、Ｎ基因联合免疫小鼠诱［导的免疫应答［Ｍ］．东北林业大学，硕±论文，２００８［１６８］李六金，金昌德清林等．狂犬病犬肠炎犬黯热犬腺病毒病犬副流感，类，Ｊ１９％２６１－五联弱毒冻干疫苗的研巧［，：５８］中国兽医科技，，（）＇Ｐｍｄｈｏｍｍｅ－口的］ＧＪ．ＤＮＡｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａａｉｎｓｔｔｕｍｏｒｓ…．ＪＧｅｎｅＭｅｄ２００５７１：３１７ｇ，，（）［１７０程世鹏金珍等．狐絡犬癌热、细小病毒性肠炎和脑（肝）炎Ｈ联疫苗研制］，吴威，憂，－６２－ 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攻读学位期间发表的学术论文攻读学位期间发表的学术论文ＬｉｕＤＦＬｉｕＣＱ扣打ＴｌａｎＪｉａｎＹＴＺｈａｎＸＺＣｈａｉＨＬＹａｎＫＹｉｎＸＣＺｈａｎＨＹ，，，，ｇｇ，，ｇＴ，，ｇＨｕａＹＰｕｔａｓｅ打ｔｏｆａｖｅｅｔａｓｃｒｔｏ打ｏｏ－ｍｅ姐ａｔｔＬｉｕＭＬＤ．ＥｓＷｉｈｍｒｓｒｎｉｉｌｅｄ；ｓｏｈｅｒｍａｉ，，Ｑｐｐａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅ打ｔｉａｔｉｏｎｏｆｃａｒｄ打ｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄａｎｄ＝ｖａｃｃ打ａｅｄａｎｍａ打ｆｅｅｅ打ｅｔｖｏ－ｉｔｉｌｓ．ＩｔＧＥｌ．２０１５３２１０２１０６．３．２６４，，巧扩）２ＬｉｕＣＬｉｕＬｉｕＤｉｕＺＴｉａｎＪ，ＧｕｏＤ，ＬｉＺ，ＬｉｕＭＬｉｕＬ．ＣｏｍｌｅｔｅＧｅｎｏｍｅ［］，乂，Ｑ，，义Ｑｐｔｒ－ｍＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆＦｅｌｉｎｅＰａｎｌｅｕｋｏｐｅｎｉａＶｉｒｕｓＳａｉｎＨＲＢＣＳｌ，ＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏａＤｏｍｅｓｔｉｃＣａｔｉｎｅａｎｏｍｅ－ＮｏｒｔｈｓｔｅｒｎＣｈｉｎａＡｎｎｏｕｎｃ：ｅ．Ｇｅ．２０１５３２Ｏｌ５５６１４，（）［３］ＬｉｕＣ，Ｌｉｕ乂ＬｉｕＤ，ＧｕｏＤ，ＬｉｕＭ，Ｙ，ＱｕＬ．ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆＦｅｌｉｎｅ－ＣａｌｉｃｉｖｉｍｓＳｔｒａｉｎＨＲＢＳＳｆｒｏｍａＣａｔｉｎＨｅｉｌｏ打ａｎｒｅａｓ．ｉｇＰｏｖｉｎｃｅＮｏｒｔｈｔｅｒｎＣｈｉｎａ資，＊ｅ－ＧｉｉｏｍｅＡｎｎｏｕｎｃ．２０１４２５：ｅ００６９８１４．，（）４ＬｉＺＪＳｈａｏＹＨＬｉｕＣＬｉｕＤＦＧｕｏＤＣｉｕＺＴｉａｎＪＺｈａｎＸＺＬｉｕＳＷ，ｕＬＤ．［］，，Ｑ，，Ｑ，，ｇ，ＱＩｓｏｌａｔｉｏ打ａｎｄａｔｈｏｅ打ｉｃｉｔｏｆｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓＭＰＣ／０４ｆｒｏｍｍａｓｋｅｄｃｉｖｅｔｐｇｙｃａｔｓ．ＩｎｆｅｃｔＧｅｎｅｔＥｖｏｌ．２０１５ｄｏｉ：１０．１０１６／．ｍｅｅｉｄ．２０１５．０８．０３７．，ｊｇ［５］ＷｕＨ，ＺｈａｎｇＸ，ＬｉｕＣ，ＬｉｕＤ，ＬｉｕＪ，ＷａｎｇＱＴｉａｎＪ，ＱｕＬ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｔｍｃｔ－ｉｏｎａｃｈａｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｅｌｉ打ｅＭＡｅｓ０１５ｄｏｉ／ｓｌｌｔｅｒｉｚａＹＳ．ＩｍｍｕｎｏｌＲ．２：１０．１００７２０２６，－０５８６８２－９１［６］ＷｕＨ，ＺｈａｎｇＸ，ＬｉｕＣ，ＬｉｕＤ，ＬｉｕＪ，ＴｉａｎＪ，ＱｕＬ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌｅｆｅｃｔｏｆｌｉｔｈｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｏｎ－－ｆｅｔｒ－ｌｉｎｅｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｉｎｖｉｏ．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ．２０１５ｄｏｉ；１０．１００７／ｓ００７０５０１５２５３４８，７ＬｉｕＣＬｉｕＭ，ＬｉｕＦＬｖ民ＬｉｕＤＦｕＬＤＺｈａｎＹＥｍｅｒｉ打ｍｕｌｔｉｌｅＫａｓｓｏｒｔａｎｔ［］Ｑ，，，Ｑ，ｇｇｇｐ－Ｈ５Ｎ５－ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｄｕｃｋｓＣｈｉｎａ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３１６７３４：２９６３０６，，（），［８］ＬｉｕＣＱＬｉｕＭ，ＬｉｕＦ，ＬｉｕＤＦ，Ｚｈａｎｇ乂ＰａｎＷＱ，Ｃｈｅ打Ｈ，ＷａｎＣＨ，Ｓｕ打臣Ｃ，ＬｉＨＴ，ＸｉａｎＷＨ．巨ｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌａｄｕｖ站Ｉｔｓｉｎａｖｉａｎｉ打ｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉ打ｅｔｏｃｈｉｃｋｅ打ｓａｎｄｇｊｄｕｃｋｓ．ＶｉｒｏｌＪ．２０１１８：３２１．，９，王瓣，刘春園，柴洪亮，张洪英，程景，旨健，华育平，曲连东。同时检［］刘大飞测猫鋪小病毒、杯状病毒。中團预防兽援学、樞疹病毒Ｉ型多重ＰＣＲ方法的建立。２０（－。报１４，３６１）；３１３３１０刘春團，刘明，刘飞，玉伟，刘大飞，刘彦宏，畏让，相文华。Ｈ３Ｎ８亚型马流感［］病毒ＨＡ基因重组腺病毒的构建及生物学特性研究。中團舊医科学。２０１４，４４（０４）－：３６２３６６，一ｙｉ］刘大飞，姜瞳，杨天阔，林欢，刘春国，柴洪亮，王挪，崔英玲，姜晓飞，马旭＊＊青，刘大程，。，华育平，曲连东张洪英同时检测ＣＤＶ和犬细小病毒双重ＰＣＲ－方法的建立。２０１２，３４（３）；２１１２１３。。中国预防兽医学报２Ｖ－＾杨天阔，刘大飞，姜寨，张洪英，曲连东。ＣＤ野毒株与疫苗株鉴别检测民Ｔ］ＬＡＭＰ方法的建立。２（－。中国预防兽医学报。２０１，３４６）；４６０４６３［１３］刘大飞，王牟平，曲连东，离巧，刘立奎，柴洪亮，刘春国，杨天阀，华育平，张－６４－ 攻读学位期间发表的学术论文ＣＡＶ－Ｈ洪英。Ｉ型犬腺病毒黑龙江株（）的分离、鉴定及致弱的研究。中国预防兽３２－医学报。２０１０，（１２）：９％９巧。４飞，林，刘大［１］刘大，王牟平，司微，曲连东，高艳，刘立奎，柴洪亮欢，刘春国－ＹＮ）的分离程，华育平，张洪英。犬细小病毒黑龙江株（ＣＰＶ、鉴定及致弱的研－巧。中国预防兽医学报。２０１０。３２（１１）：８７５８７８。获得的专利［Ｕ刘大飞；张洪英：曲连东；刘春国；王牟平。犬痘热强弱毒疫苗株及其应用；ＺＬ２０１０１０２４４９６４．一瞳洪英戚亭。犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用巧刘大飞：姜；张；林欢；；ＺＬ２０１０１０２４４８３８．［３］刘大飞；张洪英；曲连东，王牟平；刘立奎。犬腺病Ｉ型弱毒疫苗株及其应用；ＺＬ２（Ｈ０１０２４４９６１．一４刘大飞、、Ｉ［］：姜瞳：张洪英；程景；戚亭。用于同时检测ＣＤＶ犬细小病毒和ＩＩ型犬腺病毒的多重ＰＣＲ检测引物。ＺＬ２０１２１００６３４６１．一５瞳洪英戚亭－。用于ＣＤＶ巧毒株与疫苗株鉴别诊断ＲＴ［］刘大飞；姜；张；程景；ＬＡＭＰ检测引物及其应用。ＺＬ２０１２１００６３４６２．一刘大飞。ＣＤＶ、犬细小病毒和犬腺病毒Ｉ型Ｈ联［巧；姜瞳；张洪英；高艳；刘大程活疫苗及其制备方法。ＺＬ２０１０１０２４４９６５．－６５－ 致谢致谢值此论文完稿之际，首先向我的博±导师华育平研巧员和实验指导老师张洪英副研！两位老师在生活中给予无微不至的关怀究员致Ｗ崇高的敬意和由衷的感谢，在学习和、的指导实验中给予精屯，在两个实验室通力协作和共同努力下，我的博±课题得Ｗ顺利完成。衷必感谢哈尔滨兽医研巧所的曲连东研巧员在实验上给予的支持和帮助。衷也感谢东北林业大学的柴洪亮副教授，感谢本实验室所有师弟、师妹历年来的辛勤汗水。衷屯感谢刘春国博±在论文撰写和修改方面给予的意见与帮助！向兽医生物技术国家重点实验室孔宪刚研巧员、王笑梅研巧员、步志髙研巧员和王云峰研究员表示深深的谢意与崇髙的敬意，感谢他们所提供的良好实验条件及宽松、自由、互助的工作环境。、感谢东北林业大学的马建章院衷屯：ｔ、张明海教授、肖向红教授、徐艳春教授、郑、和帮助冬教授和李和平教授等老师的关屯。向戚亭博±、杨天阔硕±、王挪硕±和刘蹇硕±等在实验中帮助表示感谢！一许多老师一一、同学也提供了大量的帮助，未能提及，在此并向他们表示我诚挈的感谢。再一次，向培养我的东北林业大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所所有老师们和所有曾经帮助、关也和支持过我的亲人、老师、同学和朋友们致Ｗ衷也的谢意，谢谢您们！－６６－ 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取。得的研究成果据我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不巧含为获得东北揀业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同王作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字曰期：八＞／＾年月曰ｉ＼ｊ户＼学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北袜业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北抹业大学可Ｗ将学位论文的全部、或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存。、汇编学位论文（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名；签字曰期：年月曰签字曰期：人月／知／｝＾戶曰学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编： 东北林业大学博±学位论文修改情况确认表姓名刘大飞导师华育平入学时间２０１０．９院（室、中也）野生动物资源学院学科致生动植物保护与利用Ｉ型论文题目犬痘热、细小病毒病、腺病毒病（）Ｈ联活疫苗的研制意见１，．论文摘要部分要条理性清楚结论明确。修改，（ｉ，；犬遍热（ＣａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒＣＤ）、犬细小病毒ＣａｎｉｎｅａｒｖｏｖｒｕｓＣＰＶ）病ｐ及犬腺病毒（Ｃａｎｉｎｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＣＡＶ）病是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损失惨重。犬痘热病毒（Ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｍｓ，ＣＤＶ）可Ｗ感染包括大熊猫、小熊猫Ｗ及狮、虎、豹等食肉目所有８个科、灵长目的擲猴属、偶蹄目猪科和館足目海豹科等多种动物。ＣＰＶ可引起犬出血性肠炎与也肌炎，此外，ＣＰＶ还可引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。ＣＡＶ不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于致生的狐、熊、郊狼和镜熊等动物中。＾疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施，广泛应用的主要有单价或多价。当前弱毒苗，，化。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用但是还时有疫情发生的报道。同时目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品，其使用的疫苗株与我国优势流行株么Ａ间抗原差异显著。因此，研制适合国内流行毒株的疫苗已迫在眉睫。鉴于此，开展Ｗ下研妃文ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ的分离鉴定；将发病犬的病料组织等经过处理后，分别接种鸡胚修成纤维细胞（Ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＥＦ）、ＣＲＦＫ及ＭＤＣＫ细胞进行传代培养，并进行病毒形态学一、ＰＣＲ及动物回归试验鉴定等系列鉴定。ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ的细胞培改养物上清电镜观察分别可见典型的副黏病毒粒子、细小病毒粒子和腺病毒粒子。动物回归一试验显示，三种分离株分别可导致犬出现明显的相应的临床症状。ＰＣＲ和序列分析进－步确定分离株分别为ＣＤＶ－、ＣＰＶ和ＣＡＶ的野毒株，并分别命名为ＣＤＶＹＢ、ＣＰＶＹＮ和ＣＡＶ－ＨｏＣＤＶＤＶ－、ＣＰＶ及ＣＡＶ的致弱研究：ＣＹＢ株分别经Ｃ即、Ｖｅｒｏ和ＣＥＦ细胞连续传７０、２０５－－和，１代ＣＰＶＹＮ和ＣＡＶＨ分别经ＣＲＦＫ和ＭＤＣＫ细胞连续传至１１０代，病毒＂６＂滴度逐渐提高并分别稳定在１０ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ、１０ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ和１０ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ左右。并且Ｈ种病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐降低一。动物回归试验结果进步表明－－－成功获得致弱毒株，分别命名为ＣＤＶＹＢＲ、ＣＰＶＹＮＲ和ＣＡＶＨＲ。ＣＤＶ、ＣＰＶ及ＣＡＶ致弱毒巧的免疫原效力评价：分别将兰种致弱毒株免疫犬，并用亲本强毒株进行攻毒保护试验，结果表明三种致弱毒株均可诱导犬产生理想的中和抗体，Ｉ 并对同源强毒株的攻击提供完全保护。－ＹＢＲ－ＣＤ（Ｉ型）Ｈ联活疫苗研制：ＤＶ、ＣＰＶＹＮＲ、ＣＰＶ病及ＣＡＶ病将致弱毒株Ｃ－ＨＲ按照比例混匀和ＣＡＶ，加入稳定剂制备Ｈ联弱毒疫苗，并对其开展免疫学评价。结果表明：三联活疫苗具有良好的安全性和免疫性原性。与相应单苗相比，二者在免疫效力一，两者在安全性基本致方面无明显差异；本研巧中Ｓ联。与同类商品化五联活疫苗相比一筹苗在免疫效力方面略胜；在病毒含量和免疫持续期方面均优于商品化疫苗；此外对怀孕母犬进行免疫具有绝对的安全优势。一一目前，国内应用的弱毒联苗部分是国外疫苗的复制品，另部分疫苗种毒直接来自于国外，送与国内目前流行的野毒株在基因水平和抗原性等生物学特性方面存在显著差异，而且，目前商品化疫苗均不适合于怀孕母犬的免疫。而本研究王联弱毒苗的疫苗株均来源于国内优势流行株经致弱而成，有独立知识产权，且制备的疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并对怀孕母犬绝对安全，目。该三联苗己申报新兽药批号前处于复核试验阶段。本研究填补了我国犬类国产疫苗的空白，为我国犬的重要病毒病的防控提供了物质基础和。技术储备，并将产生良好的经济效益和社会效益意见２．作者有没有疫苗稳定性实验数据？如有可Ｗ放为第４章増加内容。．２．．４修改：在论文第Ｈ部分的３７中有疫苗稳定性试验数据的内容。意见３．每章讨论部分要扩展深化，Ｗ使论文内容有所増加。修改论文第二部分讨论：ＣＤ、ＣＰＶ病及ＣＡＶ病是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。经常引起大批动物发病死亡，经济损失惨重。包括大熊猫、小熊猫レ：Ａ及狮、虎和豹等食肉目所有８个科、偶蹄目猪科、灵长目的擲猴属和鑽足目海豹科等多种动物均有感染ＣＤ的报道，发病率可达１００，病死率达８０％％。对于大熊猫，目前全世界巧生不足１６００只，其安全也越来越受到威胁。２００７年，国内首次出现ＣＤ临床感染报道。２０１４年９月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心接连出现４只大熊猫感染ＣＤ死ｔ，ＣＰＶ、－病可引起犬出血性肠炎与屯１肌炎。９８４年２００９年先后从我国上海、桂林、哈尔滨、郑州、长春和北京等地的虎、狮、果子狸和猴等动物体分内离获得病毒，经鉴定除果子狸源病毒为犬细小病毒，虎和狮源病毒为细小病毒，猴源病毒为变异细小病毒。ＣＡＶ病不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和統熊等动物中。截至２００４年底，我国家养宠物达８０００万只，而且还在不断增加。我国毛皮动物的养殖主要集中在山东、河北、迂宁和黒龙江等地。目前，我国狐狸的饲养量达１０００万只，水貂７００万只１，絡００万只，年产水貂皮６００万张００、狐狸皮２万张，其中狐狸皮占世界总产量３５％，水貂皮占世界总产量的１２％。因而疫苗的市场需求将非常巨大，应用前景十分广阔随着野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密切，因此增加了人类感染动物源性疾 。病的潜在风险，、毛疫苗。因此加强对犬皮动物和野生动物主要疾病的防控是当务之急免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施。当前，广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用，但是还时有疫情发生的报道、疫苗效价及使用不当。除去母源抗体和其它病毒干扰这些的疫苗大外等原因外，疫情是否由病毒变异株出现引起亟需验证，目前使用的。同时レ，部分为国外疫苗的复制品，毒种背景不清ッ及在细胞上传代次数较多免疫原性和安全性均难Ｗ得到保证，。因此研制适合国內流行毒株的疫苗已迫在眉睫。ＣＤＶ对环境光和热都敏感，因此野毒株很难分离成功。目前用于ＣＤＶ分离的的主要；犬和貌的肺巨隨细胞包括原代细胞和传代细胞系。原代细胞主要包括、外周血琳己细胞、肾细胞、鸡成纤维细胞。其中Ｗ鸡成纤维细胞最为常用。传代细胞系主要包括：ＭＤＣＫ、Ｖａ、Ｈ即－２、ＦＥ、Ｈｅ。ＤＶ的ｅｒｏ、ＢＷｌａ和ＲＫ１３等有用动物的肺巨座细胞成功分离Ｃ报＂６［］道，ｅｒｏ细胞是分离ＣＤＶ的敏感细胞系Ｆ，又有研究报道Ｖ。我们采用ＣＥ细胞在°３３Ｃ低温条件下成功分离ＣＤＶ。形态学鉴定和ＲＴ－ＰＣＲ鉴ＤＶ经过ＲＴ－ＬＡＭＰ和动定结果证实分离毒毒株为Ｃ，物回归一ＤＶＨ：试验等进步鉴定，确认分离株为Ｃ野毒株该毒株与。对基因全长序列分析显示目前广泛应用的商品化疫苗株Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株、Ｌｅｄｅｒｌｅ株、ＣＤＶ３株和Ｃｏｎｖａｃ株处于不－９１同分支，且核昔酸序列同源性在９０．２％．４％之间。－ＹＢ７０上传２０代分离的ＣＤＶ连续接种ＣＥＦ传至代ｅ，之后继续在，后在Ｖｒｏ细胞Ｃ即连续传代至５ＤＶ－１０代，我们通过对病毒的形态进行了鉴定发现，分离的ＣＹＢ株传代稳定，病毒的形态未发现改变和异常。对传代的病毒进行的病毒含量测定试验我们发现，－病毒的滴度整体上呈上升趋势，说明毒株较适应细胞ＹＢ株。致弱评价试验结果中ＣＤＶ从第６代到第７０代毒对犬的发病率和死ｔ率呈明显的下降趋势，发病率从第６代的６０％９０２０－到第代开始发病率降为０１Ｖ；接种犬的死ｔ率从第６代的％到第０代降为０。ＣＤＹＢ株第９０代和第１０５代的免疫效力试验中，两代毒均对强毒的攻击提供了良好的保护效果。－ＣＤＶＹＢ株已经致弱。通过＾上试验数据充分说明了，可＾作为疫苗株使用硏巧表明，ＣＰＶ在ＦＫ８１细胞中増殖后可引起圆缩，而２Ｋ、脱落等在ＭＤＣＫ、ＢＨＫＩｓｓＶＣＥＦ细胞中生长ＰＥＩｉＭＤＣＫｅｒｏ细胞及时不能观察到明显的Ｃ。本研究曾选用细胞和Ｖｅｒｏ细胞进行病毒分离，但效果不理想，后选用ＣＲＦＫ细胞分离，则可见明显的细胞病一变，与之前的研巧结果致巧其原因可能是因为ＣＰＶ对不同细胞系的敏感性不同造成的，病毒的接种最好采用同步接种。ＣＰＶ完全依赖宿主细胞ＤＮＡ的复制机制进斤复制ｉｓＩｗ方式Ｖ－ＹＮＦＫ。本研究将ＣＰ株同步接种ＣＲ，ＣＰＥ出现比较规律，即接毒后７２ｈ，细胞开始圆缩、凝集成团。有研巧发现接毒的猫肾细胞培养物与兔抗ＣＰＶ高免血清，按５０：１的比例浪合，容易观察到凝集的免疫复合体。如果不加高免血清而单纯负染观察，只能观察到单个粒子或一２－３个粒子集在起，并且很难找到，。即使找到病毒粒子也很难确认。可ｔｉｌ肯定，猫肾细胞培养中含有大量的ＣＰＶ粒子，兔抗ＣＰＶ高免血清５０倍稀释为宜，这给其它血清Ｉ ｉｔＷ学检测方法提供了参考依据。形态学鉴定，确认分、ＰＣＲ鉴定和动物回归试验等鉴定２，离株为ＣＰＶ野壽株。测得ＶＰ基因全长部分序列，与ＧｅｎＢａｎｋ参考序列比对发现该毒－－９９株ＣＰＶＹＮ株与ＣＰＶ．５％ｔ上化亚型中国野毒株核巧酸同源关系较近，可达到，而与商晶化疫苗株（Ｍｅｒｉａｌ株和Ｐｆｉｚｅｒ株）核昔酸同源性在９８．５％左右。ＣＰＶ２ａ、２ｂ和２ｃ亚型的分型主要依据ＶＰ２基因４２６位氨基酸位点，即４２６位力Ａｓｎ即为２ａ亚型：Ａ巧即为－州亚型ＹＮ株ＶＰ２基因为Ａｓｍ显示该毒株为ＣＰＶ２ａ；Ｇｌｕ即为２ｃ亚型。本研巧的ＣＰＶ亚型。ＰＶ－ＹＮ株ＣＲＦＫ细施连续传将Ｃ接种代至１１０代，在传巧过程中，病毒的滴度逐渐６提高到１０ＴＣＩＤ５〇／ｍＬ。同时，ＣＰＶ对犬的致病力逐渐降低。免疫效为试验结果表明，－ＣＰＶＹＮＲ可Ｗ对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用，可作为理想的疫苗候选毒株。目前，细胞培养法分离和増殖腺病毒，比较容易常见。而细胞培养过程中，巧水解蛋白酶或赎蛋白酶处理病毒样晶，或在培养液中加入适靈族酶，则更有利于病毒在细胞单层ｗｓ上适应和増殖ｔｉ。我们应用同步接毒方法，并在吹打膜酶消化细胞块时对残留嫉酶不作一彻底洗涂，，并获成功。微量膜酶残留，是否是病毒分离成功的主要因素有待进步试验证肿＊气ＣＡＶ－Ｉ和ＣＡＶ－ＩＩ在Ｅ３区的元放阅读框架分别编码１９５个氨基酸和４２５个氨基酸的多ｉＭｉｌ－－肤，在Ｅ３区ＣＡＶＩＩ比ＣＡＶＩ多５００ｂ左右据此我们设计用于亚型鉴定的扩増引物。ｐ，形态学鉴定、ＰＣ民鉴定巧动物回归试验等鉴定，确认分离株为ＣＡＶ野毒株。将ＣＡＶ－Ｈ株ＣＫ细胞连续传０代接种ＭＤ代至，在１１传代过程中，病毒的滴度逐渐提７５’０－高到１ＴＣ瓜５／ｍＬ。同化ＣＡＶ对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表化ＣＡＶＨ艮〇可Ｗ对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用，可作为理想的疫苗候选毒株。４ＣＤＶ攻毒剂量确定ＣＤＶ－ＹＢ株１：０ＴＣＩＤｗ攻击犬即可Ｗ使犬１０００％发病，因此我们４蒋攻毒荆量定为１０ＴＣＩＤ５０的第５代次种毒。ＣＰＶ攻毒剂疊确定－：ＣＰＶＹＮ株的第３代和第５代毒的不同接种剂量，接种试验犬的结果可Ｗ看出４，接种１０ＴＣＩＤ的剂翼就可抖使犬８０％发病５０，依据试验结果，我们将攻毒＾剂量定为ｌＯＴＣＩＤｓｏ的第５代次种毒。ＣＡＶ－攻毒剂量确定：ＣＡＶＨ株的第５代和第８代毒的不同接种剂量接种试验犬的结，果可抖看出，接种１０吁（：１〇〇的剂量就可＾＾吏犬％发病５１〇〇，１因此将攻毒剂量定为３１〇ｔＣＩＤ５ｃ的第８代次种毒我们对ＣＤＶ－ＹＢ株第６、８９、９０和１０５代病毒的Ｈ基因进行测序，并推导其氨基酸序列，比对结果表明：与第６代和８９代相比，９０代病毒有１６处氨基酸发生变异，分别位于编码框的第３０、１５５、１紀、２２３、２３８、２７７、３０９、３６７、４０１、４１５、４６７、４８７、５１７、５３０、５５０和如６粒该变异稳定遗传至１０５代，由此可朗ｔ断，这些位点对病毒的致弱具有重要的贡献。ＣＰＶ－ＹＮ株，与第５代和４９代相比，１１０代病毒在致弱前后ＶＰ２氨基酸序列有７个位点发生变异，分則位于第４４、１０１、１６５、２９７、３００、３０５和３２４位，该变异可能导致毒株Ｉ 的分子生物学特性发生改变，进而导致病毒毒力减弱。ＣＡＶ－Ｈ株第７０和１１０代毒的氨基酸序列，我们发现，第５代和第６９代核巧酸序列与第７０代和第ｎｏ代纤突基因氨基酸序列在第１２、３２和２２８位发生变异。由此可能引起毒株的分子生物学特性发生改变，进而导致病毒毒力减弱。本研巧中对Ｈ种病毒的部分基因片段进行了遗传分析，发现了致弱毒株与亲本野毒株在氨基酸位点上具有一些能够稳定遗传的变异，但这些位点对病毒致弱的贡献仍有待进一步深入硏巧。修改论文第Ｈ部分讨论、ＣＰ：ＣＤＶＶ和ＣＡＶ分别于１９％年、１９７８年和１９２５年首次被发现，是当前对我国养犬业危害严重的３种病毒性传染病。ＣＤ不仅危害养犬业，而且严重危害絡Ｐ、－、貂和狐等毛皮动物养殖业发展，ＣＶ引起犬出血性肠炎与屯肌炎；ＣＡＶＩ引起犬传染性肝炎等－，ＣＡＶｎ引起犬的传染性喉气管炎。为预防与控制这几种传染病，己研制出多种商品用单苗与联苗。常规弱毒联苗产品有：Ｇ－－－ｍｍＤａｌｘａ６ＭＰＨＬ、ＦｅｖｒａｃＤ、ＦｒｏｍｍＤ和犬四联弱毒疫苗等。Ｇａｉｘａｙ６ＭＰＨＬ和Ｆｏｒｙ一为苏威动物保健公司生产ａｘＭＰＨ－，Ｇａｌｙ６Ｌ为种犬多价弱毒联苗，内含犬適热病毒、一细小病毒、腺病毒和副流感病毒弱毒株。ＦｏｒｍｍＤ为种禽源性家犬和雪貂专用犬弱毒疫苗据文献报道，该疫苗除对家犬和雪貂抗犬搞热病毒感染既安全又有效外，对囊一毛狼Ｆｅｒｖａｃ－Ｄ为种禽源性雪貂、丛林狗和大耳狐抗犬瘋热感染也具有安全性和有效性。专用犬多价弱毒联苗，文献报道小熊猫接种该疫苗后的抗体效价都有不同水平的提高。基－因工程多价苗方面：有研究者，扩増ＣＤＶＨ基因１ＩＩＦ基因，分别、ＣＰＶＶＰ基因、ＣＡＶ－３－构建了ＩＲＣＤＶＨ，ＩＲＥＳＶＰｌ和ｐｃＣＡＶＦ３个真核表达质粒。种免疫质粒经纯化后分ｐｐ别按２０〇Ｈ、４００８００三种浓度混合，免疫９ｗ（ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ中和抗体效价谷）ｇ惦和帖４ｗ、－，ＣＤＶＣＰＶ和ＣＡＶＩ强毒株进行攻的犬，并在第Ｈ次接种后对全部实验犬进行用２１，毒：，攻毒只发病。实验结果显示次免疫后犬体即可产生较高的抗体水平后犬除有，证明所构建的核酸疫苗在但症状较轻，其余都能抵抗Ｈ种强毒的攻击；对照犬发病严重一ＵＷ验室也曾开展ＣＤＶ核酸疫苗联合免疫的研巧，定程度上可抵抗强毒的攻击。本实２００８年，张莉扩増了狐狸源ＣＤＶ的Ｆ基因，将其克隆至ｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体，构ｐ－－建了ｃＤＮＡ－Ｆ真核表达质粒ｃＤＮＡＮ和ｃＤＮＡＨ共同免ｐ。该质粒与之前实验室构建的ｐｐ＋＋：３Ｄ，评价其免疫效力４Ｔ和ＣＤ８Ｔ细疫昆明鼠。实验结果显示个基因混合免疫组其Ｃ＋＋胞的百分含量明显高于单基因和双基因免疫组，接近于弱毒疫苗组ＣＤ４Ｔ和ＣＤＳＴ淋巴细胞的百分含量。血清中能检测出特异性抗ＣＤＶ抗体。表明Ｈ、Ｆ、Ｎ基因的重组质ＮＵＷＩＡ免粒Ｄ疫鼠可诱导产生特异性细胞免疫和相应的体液免疫。与传统的常规疫苗相比１），基因工程疫苗具有许多优点：（制备简单。生产比传统的灭活疫苗和弱毒疫苗等要简单，成本要低，省时省力。（巧更有效的免疫。不仅可Ｗ诱导针对保守抗原的保护性抗，体产生，同时细胞内蛋白的表达提供了内源性多肤，激发了ＣＴＬ介导的细胞免疫这样对病毒及胞内菌感染的防制就更加有效，，抗原在细胞内的表达与。而且基因疫苗接种后 一病毒自然感染过程，运对于Ｗ构象型抗原表位诱发中和抗体产生极为重要３致。（）联合免疫。相当于多价疫苗，接种后就可Ｗ产生针对多种病原体的联合免疫效果。（４）同种异株交叉保护，，。可通过对基因表达载体所携带的報基因进行改造从而选择抗原决定簇选一一择某病原体的编码保守蛋白的核酸序列作为基因疫苗，因其变异性小，故可对同种病，起到保护作用５原的不同毒株产生交叉免疫。（）疫苗仅仅含有核酸成分而没有蛋白质等其他辅助成分，无病毒感染复制的危险，而减毒活疫苗除了主要成分蛋白质外还含有核酸感染因子，有可能出现病毒的复制，从而引起感染６可诱导出较强的免疫反应，而且。（）ＵＷ一很少受或不受母源抗体的影响。但犬用基因工程疫苗还存在些问题：如产生免疫耐受，出现免疫反应低或免疫无反应外源抗原长期在体内表达带来难Ｗ预测的后果激活细；；胞原癌基因，使抑癌基因失活，诱发肿瘤的产生Ｗ及安全性等，因此目前尚处于研究探索阶段，还未应用到临床。目前国内应用的弱毒联苗一一部分是国外疫苗的复制品，另部分种毒直接来自于国外ｅｗｉｗｆ。这与目前国内流行的野毒株在核巧酸及氨基酸水平Ｗ及病毒抗原性等生物学特性ＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ所引发的疾病进行有效防控。方面存在显著差异，不能够对我国犬的Ｃ因此本研巧筛选我国的ＣＤＶ、ＣＰＶ和ＣＡＶ优势流行毒株，经过致弱而制备成Ｈ联活疫苗，一并对其免疫效力进行了系列评价，。制备半成品单苗时对种子毒种的使用代次应严格控１－０１＾５制在代＞１内，毒种应冻干低温保存，使用时复壮扩增２代，毒价测定合格后方可作一为次级毒种ＰＥ７０％－８０％。接毒后注意观察细胞病变，般来说Ｃ达时收毒可获得最佳收毒期：明，因而。病毒与稳定剂配比的研究结果显示胶庶糖冻干保护剂的效果最好选取明）：胶漁糖作为本产品的冻干保护剂（数据未列出。不同比例的配比实验结果显示将病毒液与稳定剂９：１的比例冻干后，疫苗中各病毒的损耗最小，免疫比格犬后的对犬的保护率１００％，完全符合质量标准要求，９：１的比例作均为。因此我们将各病毒液等量混合后按为冻干条件。Ｈ联活疫苗安全性研巧结果显示：各批疫苗试验犬均无因注苗引起的不良反应，采食和精神状态都与对照犬无明显差异，证明疫苗安全性良好，。为了避开母源抗体的干犹采取２一一仔兽断奶周后进行首免，间隔２周加强免疫次；成兽次性免疫即可产生坚强的免疫力，目；种兽应在配种前注苗的是通过母源抗体保护仔兽。三联活疫苗对怀孕母犬的安－全性研究结果显示：ＣＤ１、ＣＰＶ病和ＣＡＶ病Ｈ联活疫苗分别经单剂量安全性试验、单剂，不会出现呕吐量重复安全性试验和大剂量安全性试验注射怀孕母犬后、腹泻、局部热反，采食和精神状态都正常，，幼仔无弱胎，应等症状母犬产仔正常、死胎均健活。证明该４＇Ｄｌ疫苗对怀孕母犬是安全的：〇ＴＣＩＤ组对。Ｈ联活疫苗最小免疫剂量研究结果显示ｓｏ／犬４０这Ｈ种病保护率均为００％。因此，我们将该疫苗的最小免疫剂量定为１〇ＴＣＩＤＷ犬，１４＇５，所Ｗ我们将使用剂量定为〇但由于疫苗在运送和使用过程中可能会使效价降低１ＴＣＩＤ：５７，Ｗ犬。Ｈ联活疫苗免疫持续期研巧结果表明在免疫后第、６和个月时分别用强毒进行攻击，在第５和６个月时用Ｈ种病毒攻击后的保护率均为１００％，只有攻击ＣＤ强毒组在第７个月的保护率为８０％，对照组犬均１００％发病，考虑到现场应用的个体差异Ｉ ，等因素，将免疫持续期定为６个月对已感染发病或。且本疫苗仅用于健康动物的预防接处于潜伏期的动物无治疗作用，甚至用可能加重患病动物的病情。三联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果显示：三联苗与相应单苗在抗体的消长规律上是相一致的Ｈ联活疫苗与。攻毒保护结果表明Ｈ联苗与单苗均能抵抗住相应强毒的攻击。同类商晶苗的比较研巧结果显示：在安全性和免疫效力方面与商品化五联活疫苗的效果基一且Ｈ联活疫苗可用于怀孕母本致：在病毒含量和免疫持续期方面略好于商品化疫苗；而犬的免疫，这是目前商品化疫苗所达不到的，是本Ｈ联苗的绝对优势。学生（签字月日＾导师确认（主要确认学生是否做了有针对性地、合理地、充分地修改）：东已你Ａ＞／＾导师（签字）：Ｖ之分６年＾月产曰学科带头人／负贵人审核学科带头人月日户学位评定分委会审阅’签字学位评定分委员会主（）义乂１）年ｊ月ｆ曰注：１．此表由学生填写，导师结合评审意见修改情况确认签字，＾科带头人／负责人审核，学位评定分委员会主席审阅。２一．并装订此表与博±学位论文。
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