重组蓖麻毒素a链与天然蓖麻毒素免疫效果比较分析研究

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1、分类号：S816.4单位代码：10193密级：公开学号：2012612硕士学位论文重组蓖麻毒素A链与天然蓖麻毒素免疫效果比较分析研究EffectComparativeStudyofRecombinantRicinAChainwiththeNaturalRicin作者姓名：曲英龙学位类别：农学硕士专业名称：临床兽医学研究方向：动物免疫指导教师：钱爱东教授刘林娜副研究员所在学院：动物科技学院2015年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成

2、果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不

3、同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要本论文从以下两个方面对重组蓖麻毒素A链与天然蓖麻毒素免疫效果进行了比较分析研究。1.制备具有生物活性的重组蓖麻毒素A链（r-RTA）并与天然蓖麻毒素（n-RT）进行毒性比较。根据NCBI公布的RTA序列合成基因片段，并将其克隆于pET-28a载体后，利用大肠杆菌进

4、行原核表达，镍柱亲和层析纯化上清，500mmol/L咪唑溶液洗脱获得可溶性r-RTA蛋白，通过SDS-PAGE及Westernblotting对其进行鉴定并用ELISA测定其免疫原性后，对r-RTA与n-RT进行动物和细胞试验毒性比较研究。结果显示，该r-RTA在上清中表达率为31.2%；每升细菌培养物纯化后可得20mg目的蛋白，纯度≥90%，大小为32kD。其免疫原性约为天然RT的1.27倍；通过获取的n-RT细胞半抑制浓度（IC50为0.01μg/mL）及动物半数致死量（LD50为3.27±0.44μg/kg），以相同浓度进行细胞感染和动物攻毒试验，结果显示，同等剂量下，在细

5、胞试验中，n-RT毒力是r-RTA的2700倍；在动物试验中，n-RT组对动物致死率为40%，r-RTA组动物无死亡。结果表明，单独RTA，在没有RTB协助下，具有一定的毒性作用，但毒力将显著降低。2.本实验进行了重组蓖麻毒素A链（r-RTA）、重组突变蓖麻毒素A链(m-RTA)和天然蓖麻毒素(n-RT)毒力及免疫效果分析。细胞试验中，n-RT毒力约是m-RTA与r-RTA的2700倍。腹腔注射免疫无佐剂的r-RTA、m-RTA和n-RT，免疫过程中小鼠体重均有所减轻，相较于r-RTA组和n-RT组，m-RTA组小鼠体重变化最小。4次免疫以后血清抗体效价均达到10-4以上，以60

6、00μg/kgm-RTA免疫小鼠可对20×LD50剂量蓖麻毒素提供完全保护。该结果表明r-RTA、m-RTA和n-RT对小鼠均有一定毒性，m-RTA刺激小对免疫鼠能提供更好的保护。该研究结果将为开发基于RTA的蓖麻毒素疫苗提供重要数据和理论支撑。关键字：原核表达；重组；突变；蓖麻毒素；毒性比较；免疫效果IAbstractThisresearchsystematicallystudiesimmuneeffectcomparativestudyofrecombinantricinAchainwiththenaturalricinfromtwoaspects.Inthefirstexp

7、eriment,thestudywasaimedtoproducerecombinantricinA-chain(r-RTA)withhighbiologicalactivityandcompareitstoxicitywithnativericin(n-RT).WesynthesizedthepublishedRTAgenesequenceonNCBIandcloneditintothepET-28avector,andthenprokaryoticlyexpressedbyt