铜绿假单胞菌毒性噬菌体φpa-hf17的分离鉴定及生物学特性的分析

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1、铜绿假单胞菌毒性噬菌体φPA-HF17的分离鉴定及生物学特性的分析CharacterizationandBiologicalFeaturesofVirulentBacteriophageφPA-HF17InfectingPseudomonasaeruginosa作者姓名：韩放专业名称：病原生物学指导教师：孙延波教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月22日中文摘要铜绿假单胞菌毒性噬菌体φPA-HF17的分离鉴定及生物学特性的分析铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是假单胞菌属的主

2、要成员，为革兰染色阴性的非发酵菌，广泛分布于自然界的土壤和水中，亦可存在于医院潮湿的环境内。铜绿假单胞菌是引起医院内感染主要的致病菌之一。特别是当机体免疫功能下降时，可引起多种疾病，如呼吸机相关性肺炎、急性下呼吸道炎症、囊性纤维化患者的慢性呼吸道炎症、角膜炎、导尿管置留引起的尿道炎以及皮肤和伤口的感染等。由于铜绿假单胞菌适应性极强，常成为医院内爆发性感染的元凶。此外，铜绿假单胞菌多重耐药（multidrug-resistant）菌株的不断出现和生物膜的形成给临床治疗带来严重困难。噬菌体是能够感染并杀死细菌的

3、病毒，且存在于土壤、海洋、湖泊甚至动物的肠道内。鉴于目前耐药性细菌的严峻形势，噬菌体疗法（PhageTherapy）重新引起一些科学工作者们的兴趣和有关国家及一些国际机构的重视。本研究以27株铜绿假单胞菌临床分离株为宿主菌，采用传统的双层琼脂噬斑法从生活污水和医院污水中初步分离出16株毒性噬菌体，从中选择4株噬菌体（分别命名为φPA-HF7、φPA-HF12、φPA-HF17和φPA-HF20）进行电镜观察。结果显示，噬菌体φPA-HF7属于有尾噬菌体目（CaudoviralesOrder）、长尾病毒科（S

4、iphoviridae）噬菌体,噬菌体φPA-HF12属于有尾噬菌体目的肌尾病毒科(Myoviridae)噬菌体，φPA-HF17和φPA-HF20则属于有尾噬菌体目的足尾病毒科（Podoviridae）噬菌体。通过对噬菌体φPA-HF17生物学特性的研究I及基因组的初步分析发现：(1)φPA-HF17的头部呈立体对称、直径约50nm，尾部较短、长约5～10nm；(2)φPA-HF17的基因组为双链DNA，限制性内切酶图谱分析表明，基因组含有NdeI、XhoI、XbaI、PstI、HindIII和EcoRI

5、的多个酶切位点，初步推算基因组大小约为38kb；(3)φPA-HF17具有较高的裂解活性，能裂解12株铜绿假单胞菌分离株（裂解率为44.0%）；(4)噬菌体φPA-HF17的最佳感染复数（Multiplicityofinfection,MOI）为0.01；（5）一步生长曲线显示，φPA-HF17的潜伏期为10分钟，爆发期持续60分钟，爆发量为218PFU/cell；（6）吸收试验表明，当MOI＝0.01时，在4分钟内超过90%的φPA-HF17吸附或穿入宿主细胞内；（7）SDS-PAGE蛋白电泳可观察到3种

6、主要蛋白和至少8种次要蛋白，其中位于40kDa的主要蛋白带可能是噬菌体φPA-HF17的衣壳蛋白；(8)稳定性试验发现，噬菌体φPA-HF17在60℃30min和pH4～10的范围内仍具有较高的裂解活性；（9）全基因组测序发现噬菌体PA-HF17基因组由39208个碱基组成，GC含量达到49.68%，共有46个编码蛋白质的基因，不具备tRNA和rRNA。根据上述的研究结果，得出下列结论：1.4株铜绿假单胞菌噬菌体（φPA-HF7、φPA-HF12、φPA-HF17和φPA-HF20）为毒性噬菌体，属有尾噬菌

7、体目，其中φPA-HF7为长尾病毒科噬菌体，φPA-HF12属于肌尾病毒科噬菌体，φPA-HF17和φPA-HF20则属于足尾病毒科噬菌体。2.φPA-HF17基因组大小为39208碱基，GC含量百分比为49.6%。3.φPA-HF17是一种潜伏期短、裂解效率高、裂解谱宽以及在60℃和pH4～10的范围仍具有裂解活性的噬菌体，可考虑用于耐药性铜绿假单胞菌感染的噬菌体生物制剂的开发。II关键词：噬菌体，噬菌体疗法，铜绿假单胞菌，细菌耐药性IIIAbstractCharacterizationandBiolog

8、icalFeaturesofVirulentBacteriophageφPA-HF17InfectingPseudomonasaeruginosaPseudomonasaeruginosa,animportantmemberofthepseudomonadandnon-fermentation,gram-negativerod,iswidelydistributedinsoilandwater.Similarly