诱导人脐带间充质干细胞向角膜上皮样细胞分化的实验研究

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：诱导人脐带间充质干细胞向角膜上皮样细胞分化的实验研究Differentiationofhumanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcellsintocornealepithelial–likecellsinvitro作者姓名：曹贤芬指导教师姓名及学位、职称：侯光辉博士教授学科、专业名称：眼科学眼表与角膜病学位类型：专业学位论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：独创性声明本人声明所呈交的学

2、位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或

3、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：暨南大学硕士学位论文摘要目的研究人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells，hUCMSCs）向角膜上皮样细胞分化的可行性研究。方法1.IV型胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞(hUCMSCs

4、)，对其进行形态学观察。并通过细胞表型和多潜能诱导分化鉴定hUC-MSCs。2.分别采用胰酶消化法和组织块贴壁法获取兔角膜上皮细胞（cornealepithelialcellsRECEs），倒置显微镜观察其形态和生长状态，CCK8法测定RECEs的增殖活性，免疫荧光检测其角膜上皮细胞特异性角蛋白CK3+12的表达。3.将脐带间充质干细胞与兔角膜上皮细胞通过Transwell体系进行隔离共培养7天，诱导过程中倒置显微镜和原子力显微镜对比观察hUC-MSCs形貌的改变；qRT-PCR检测诱导前后人脐带间

5、充质干细胞CK3mRNA,PAX6mRNA表达量的变化；免疫荧光检测角蛋白抗体CK3+12,CK14,CK19,PNCA的表达。设定共培养组为实验组，常规培养hUC-MSCs为对照组。结果HUCMSCs形态比较均一，呈典型的梭形和成纤维形；hUCMSCs高表达间充质干细胞表型CD13、CD29、CD73、CD90，不表达内皮细胞和造血细胞表型CD14、CD31、CD45、HLA-DR；特定的条件培养液下，hUC-MSCs成功向成骨成脂定向分化。RECEs呈类圆形、多边形；增殖快，融合后呈铺路石样外观

6、；CCK8法测定RECEs的生长曲线呈S形；免疫组化检测RECEs表达角膜上皮细胞特异性角蛋白CK3+12。HUC-MSCs与RECEs共培养诱导七天后，倒置显微镜下体积变大，核浆比变小；原子力显微镜下观察hUC-MSCs胞体宽大，胞膜表面立体感减弱；CK3mRNA和PAX6mRNA表达量均比诱导前显著增加（P<0.05）；免疫荧光检测CK3+12，CK14,CK19,PCNA表达阳性。结论在Transwell共培养体系下，人脐带间充质干细胞可以向角膜上皮样细胞分化。关键词人脐带间充质干细胞，兔角膜

7、上皮细胞，共培养，诱导I暨南大学硕士学位论文AbstractObjectiveToinvestigatethedifferentiationpotentialofhumanumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells(hUC-MSCs)inducingintocornealepithelial-likecellsintranswellculturesystem.MethodsMesenchymalstemcellswereculturedfromhumanumb

8、ilicalcordusingcollagenaseIVdigestionmethod，hUC-MSCssurfacemarkerswereexaminedbyflowcytometry，thethirdpassagecellsweretransferredintoadifferentmediumandosteogenicdifferentiation,adipogenicdifferentiationwereassessed.Weobtainedrabbit'sco