马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的分离纯化与鉴定

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1、分类号:5917.4密级：公开UDC?639.4学号：2111201130户瘃海洋太摩硕士学位论文马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的分离纯化与鉴定朱家萍指导教师：梁海鹰教授串请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产无脊椎动物增养殖与珍珠培育学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人

2、完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□。√（请在以上相应方框内打“√”）马氏珠母贝血清抗菌活性蛋白的分离纯化与鉴定摘要马氏珠母贝（Pinctadamartensii）是我国人工海水育珠的主要珍珠贝之一，近年来因沿海水质的日趋恶化，各

3、种病害也频繁发生，导致马氏珠母贝因病害发生大量死亡，对我国珍珠产业造成了巨大的经济损失。因此，了解马氏珠母贝免疫机制并在此基础上提高马氏珠母贝抗胁迫能力是目前亟需解决的问题。抗菌肽是贝类生物免疫机制中最重要的一个环节，但目前对马氏珠母贝抗菌肽的报道甚少。本实验采用多步高效液相色谱结合质谱分析，对马氏珠母贝血清中具有抑菌活性的蛋白质开展了分离纯化及鉴定研究，从中获得三种具有抑菌活性的蛋白质成分，分别将这三种抗菌活性蛋白命名为PmECSOD（马氏珠母贝超氧化物歧化酶，P.martensiiextracellularsuperoxidedismutase），PmCLEC-1（马氏珠母贝C-型凝集素

4、，P.martensiic-typelectin），PmAMP-1（马氏珠母贝抗菌肽，P.martensiiantimicrobialpeptide-1）。为了进一步了解这三种活性蛋白的基因组成，通过在马氏珠母贝的基因组和NCBI提供的珠母贝数据库中搜索同源核酸序列并以之为模板设计引物，运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术，成功克隆得到这三种蛋白质的cDNA全序列，运用实时荧光定量PCR进一步研究了三者的组织特异性分布以及细菌诱导后基因丰度变化情况。结果如下：1、马氏珠母贝超氧化物歧化酶（PmECSOD）基因cDNA全长序列为1864bp，开放阅读框（ORF）为1422bp，编码473个

5、氨基酸，N-末端有信号肽，有20个氨基酸，成熟肽有453个氨基酸。氨基酸序列分析显示，PmCESOD的氨基酸序列具有典型的SOD结构域，在它的N端还有FRI和IGc2两个结构域。同源性分析显示PmECSOD与其它两种贝类的ECSOD相似性很低，与海湾扇贝太平洋长牡蛎的相似度是分别是36.42%和28.32%。荧光定量分析发现，该基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、鳃、性腺以及血淋巴六个组织中均有表达，在鳃中的表达量最高，在闭壳肌中的表达量最低。经过诱导刺激之后，48h在血淋巴中表达含量达到最高，具有显著性差异。2、马氏珠母贝C-型凝集素（PmCLEC-1）基因cDNA全长序列为636bp，开放阅读

6、框（ORF）为450bp，编码149个氨基酸，其中有19个信号肽，成熟肽为130个氨基酸，具有C-型凝集素典型的结构域——糖结合识别位点（CDR）。与马氏珠母贝其他两种的C-型凝集素PoLEC-1和PoLEC-2对比，发现与两者的相似度很低。空间结构显示PmCLEC-1除了有紧凑结构，在N端还有两个Cys。荧光定量分析发现，在外套膜和肝胰腺的含量最高，而血淋巴中的含量最低。细菌诱导之后，12h在血淋巴中的表达含量最高。I3、马氏珠母贝抗菌肽（PmAMP-1）基因cDNA全长为700bp，其中开放阅读框为306bp，编码了101个AA。空间结构显示PmAMP-1为α-螺旋结构。通过电镜进一步观

7、察了PmAMP-1对细菌的作用机制。荧光定量分析发现，在闭壳肌中表达含量最高，血淋巴中含量最低；经细菌刺激之后，8h在血淋巴中表达量最高。本实验首次从马氏珠母贝血清中获得三种具有抗菌活性的蛋白质成分，为了解马氏珠母贝体液免疫相关因子鉴定了基础，对研究马氏珠母贝的免疫机制蛋白具有重要意义。关键词：马氏珠母贝；高效液相色谱；超氧化物歧化酶；C-凝集素；抗菌肽IIPurificationandidentifiedc