二穗短柄草gf 14-a-like基因的克隆、表达分析及遗传转化研究

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1、分类号学号M201371621学校代码10487密级硕士学位论文二穗短柄草GF14-A-like基因的克隆、表达分析及遗传转化研究学位申请人：吴春来学科专业：生物工程指导老师：汪越胜副教授答辩日期：2015年5月17日AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofBiologicalEngineeringCloning,ExpressionAnalysisandGeneticTransformationofGF14-A-like

2、GenefromBrachypodiumdistachyonCandidate:ChunlaiWu：Major:BiologicalEngineering：Supervisor:Assoc：ProfYueshengWangHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果

3、。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签

4、名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文摘要小麦是重要的粮食作物之一，由于小麦的基因组较为复杂，研究较为困难。二穗短柄草属于早熟禾亚科，与禾本科的粮食作物小麦有比较近的亲缘关系，因此研究二穗短柄草对于了解小麦具有重要的参考价值。二穗短柄草本身具有生长周期短、基因组小、易于遗传转化的优势，并且基因组测序已经完成，可以从基因组水平上开展更好的研究，已经成为了一种新的模式生物。14-3-3蛋白普遍存在于植物体内，可形成同源或异源二聚体，通过与磷酸化的靶蛋白互作改变其活性，参与植物基础代谢、响应非生物胁迫、调节体内物质运输、参

5、与多种激素介导的信号转导等重要生理过程。然而，目前有关新型禾本科模式生物二穗短柄草14-3-3蛋白功能的研究还少有报道。本研究克隆得到了二穗短柄草14-3-3基因家族的一个基因，通过序列分析，将其命名为BdGF14-A-like。本研究主要结果如下：（1）BdGF14-A-like基因位于二穗短柄草三号染色体上，编码区由三个外显子和两个内含子组成，ORF长度为753bp，编码250个氨基酸。将该基因编码蛋白与模式生物水稻和拟南芥中14-3-3家族成员进行进化树分析，发现该蛋白与模式植物拟南芥GRF1和水稻中GF14a同源性最高。（

6、2）使用巢式PCR成功克隆了该基因，构建表达载体，通过基因枪法介导的洋葱亚细胞定位，进行瞬时表达分析，发现BdGF14-A-like在细胞核、细胞质、细胞膜中都有表达。（3）对二穗短柄草的根、茎、叶、果实进行组织表达水平分析，发现BdGF14-A-like在根中表达量最低，在叶和果实中表达量较高。（4）通过半定量RT-PCR技术，分析了根和叶器官受到多种非生物逆境处理后该基因的表达水平，结果显示BdGF14-A-like基因表达水平在根中ABA下调诱导，受NaCl上调诱导，在叶中受Ethrel(ETH)上调诱导。I华中科技大学硕士

7、学位论文（5）将构建的植物过表达载体pBI121-BdGF14-A-like和空载pBI121利用农杆菌介导的方法遗传转化烟草，成功获得了22株转基因过表达阳性植株，将小苗移栽至温室，经过培养成功收取了T1代种子。通过研究二穗短柄草BdGF14-A-like基因，可为小麦等重要粮食作物14-3-3蛋白抗逆性研究奠定一定的理论基础，并为提高小麦抗性，改良其某些农艺性状等提供一定理论基础。关键词：二穗短柄草；14-3-3；BdGF14-A-like；亚细胞定位；表达分析；遗传转化II华中科技大学硕士学位论文AbstractWheati

8、soneoftheimportantfoodcrops.Itsresearchisstillachallengeduetothecomplexityofitsgenome.BrachypodiumdistachyonbelongstoPooidea