植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立及评价 硕士毕业论文

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1、单位代码10475学号104753081328分类号Q93硕士学位论文植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立及评价学科、专业：微生物学研究方向：微生物遗传与基因工程申请学位类别：理学硕士申请人：指导教师：二〇一一年五月53ESTABLISHMENTANDEVALUATIONOFTRANSPOSONINSERTIONMUTANTLIBRARYFORENDOPHYTICBIOCONTROLSTRAINBacillusCereus0-9ADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUnive

2、rsityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByPengLingSupervisor:AssociateProfessorWangGangMay,201153关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使

3、用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人（学位论文作者）签名：201年月日关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文（纸质文本和电子文本）以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复

4、制手段保存、汇编学位论文（纸质文本和电子文本）。（涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书）学位获得者（学位论文作者）签名：201年月日学位论文指导教师签名：201年月日53摘要生物防治是一种环境友好型的植物病害综合治理方法，在农业生产上具有重要的应用价值。目前，对于利用微生物进行生物防治的研究中，不再局限于被动地从自然界中寻找生防菌株，而是通过建立生防菌株的突变体库，筛选生物防治相关功能基因缺失突变株，利用分子生物学技术研究该功能基因，进而揭示生防菌生防机制。植物内生生防细菌0-9是一株从小麦根部分离获得的内生蜡样芽孢杆菌，具有生物薄膜形成能力，能稳

5、定有效的防治小麦纹枯病，而且能在小麦根际稳定定殖。为了全面解释0-9的生防机制，本研究利用转座子TnYLB-1，构建了野生菌株0-9的转座插入突变体库。通过测定生防菌0-9的生长曲线，探索菌体培养条件，选取0-9对数生长期中期的菌体制备原生质体；并通过比较不同的破解细胞壁的反应条件，最终确定制备原生质体的破壁条件为：溶菌酶终浓度0.25mg/mL，42℃反应45min；在成功获得0-9的原生质体后，通过电击转化方法，在电阻400Ω，电容5µF，1.0kv电击参数条件下，成功完成了质粒pMarB（携带转座子TnYLB-1）对生防菌株0-9的转化。根据质粒p

6、MarB上复制子repG+ts的温敏特性，利用高温诱导转座技术使转座子TnYLB-1转座插入到0-9基因组上，成功构建了含有1125株突变株的突变体库；另外，通过对不同高温诱导转座条件的比较，确认最佳转座条件为：46℃处理10h，在此条件下，转座效率高达90.38%。获得0-9的突变体库后，通过初步比较突变株与野生菌株0-9菌落形态特征，从突变体库中筛选获得202株菌落形态突变株；之后从202株突变株中选取菌落形态特征与野生菌株有明显差异的5株突变株：539、573、609、629、638，进一步通过比较5株突变株和野生菌株0-9菌落形态特征、运动能力、

7、小麦根际定殖能力、对小麦纹枯病生物防治能力以及在非生物表面形成生物薄膜的能力来对突变体库进行表型评价；并利用分子生物学手段PCR技术和Southern杂交技术对突变体库进行分子水平上的评价。表型评价结果证实，5株突变株与野生菌株在表型特征上存在着明显差异；PCR扩增结果说明5株突变株基因组上具有转座子TnYLB-1的同源序列，但在野生菌株0-9基因组上没有；利用Southern杂交技术，检测到TnYLB-1在突变株539、609、629基因组上具有不相同的插入位点，但是，在突变株573和638基因组上并没有检测到TnYLB-153插入序列。综合表型评价和

8、分子生物学评价结果，我们初步认为所建立的突变体库是由转座子TnYLB-1随机插入