植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立与评价

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1、摘要生物防治是一种环境友好型的植物病害综合治理方法，在农业生产上具有重要的应用价值。目前，对于利用微生物进行生物防治的研究中，不再局限于被动地从自然界中寻找生防菌株，而是通过建立生防菌株的突变体库，筛选生物防治相关功能基因缺失突变株，利用分子生物学技术研究该功能基因，进而揭示生防菌生防机制。植物内生生防细菌0-9是一株从小麦根部分离获得的内生蜡样芽孢杆菌，具有生物薄膜形成能力，能稳定有效的防治小麦纹枯病，而且能在小麦根际稳定定殖。为了全面解释0-9的生防机制，本研究利用转座子TnYLB．，，构建了野生菌株0-9的转座插入突变体库。

2、通过测定生防菌0-9的生长曲线，探索菌体培养条件，选取0-9对数生长期中期的菌体制备原生质体；并通过比较不同的破解细胞壁的反应条件，最终确定制备原生质体的破壁条件为：溶菌酶终浓度0．25mg／mL，42℃反应45min；在成功获得0-9的原生质体后，通过电击转化方法，在电阻400Q，电容5laF，1．0kv电击参数条件下，成功完成了质粒pMarB(携带转座子TnYLB一』)对生防菌株0-9的转化。根据质粒pMarB上复制子repG怕的温敏特性，利用高温诱导转座技术使转座子TnYLB-1转座插入到0-9基因组上，成功构建了含有112

3、5株突变株的突变体库；另外，通过对不同高温诱导转座条件的比较，确认最佳转座条件为：46℃处理10h，在此条件下，转座效率高达90．38％。获得0．9的突变体库后，通过初步比较突变株与野生菌株0．9菌落形态特征，从突变体库中筛选获得202株菌落形态突变株；之后从202株突变株中选取菌落形态特征与野生菌株有明显差异的5株突变株：539、573、609、629、638，进一步通过比较5株突变株和野生菌株0．9菌落形态特征、运动能力、小麦根际定殖能力、对小麦纹枯病生物防治能力以及在非生物表面形成生物薄膜的能力来对突变体库进行表型评价；并利

4、用分子生物学手段PCR技术和Southem杂交技术对突变体库进行分子水平上的评价。表型评价结果证实，5株突变株与野生菌株在表型特征上存在着明显差异；PCR扩增结果说明5株突变株基因组上具有转座子TnYLB一．，的同源序列，但在野生菌株0．9基因组上没有；利用Southem杂交技术，检测到Tn儿良J在突变株539、609、629基因组上具有不相同的插入位点，但是，在突变株573和638基因组上并没有检灏IJTnYLB．J插入序列。综合表型评价和分子生物学评价结果，我们初步认为所建立的突变体库是由转座子TnYLB—J随机插入到野生菌株

5、0．9基因组上获得的，可以作为下一步研究野生菌株0．9生防机制的基础。关键词：生物防治，遗传转化，转座插入，突变体库IIABSTRACTBiologicalcontrolplaysanimportantroleinagricultureaSanenvironment—friendlymethodofcomprehensivecontrolofplantdiseaSe．Nowadays，thestudyofbiologicalcontrolisnolongerconfinedtOpassivelyseparatebiocontrol

6、bacteriafromnature，buttofindthemechanismofbiocontrolbacteriabyestablishmutantlibraries．Bacilluscereus0-9，isolatedfromthehealthwheatrootbyourlaboratory，showedtheabilityofformingbiofilmonnon-biologicalmaterialsandtheeffectivefunctiononcontrollingthewheatsharpeyespotinth

7、egreenhouse；andcouldcolonizethewheatrhizospherewell．Inthisstudy，wemeasuredthegrowthcurveofO·9，andaccordingtothecurve，wechoosethecellsof0-9，whichisinthemid—logarithmicphase，asthematerialofmakingprotoplasts．Aftercomparingtheeffectiveofmakingprotoplastsunderdifferentcond

8、itions，weultimatelychosethefollowingcondition：breakingthecells’wallat42℃45minbyusinglysozyme(0．25mg／mL)，andwegottheprotoplas