口蹄疫病毒非结构蛋白2b、3a对细胞凋亡的影响及干扰3d基因对病毒抑制的观察

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1、分类号：密级：学号：2012108022单位代码：10759石河子大学硕士学位论文口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A对细胞凋亡的影响及干扰3D基因对病毒抑制的观察学位申请人曹丽娟指导教师陈创夫教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月Theeffectofnonstructuralprotein2B、3Ainfoot-and-mouthdiseasevirusoncellapoptosisandtheobserva

2、tionof3Dgeneinterferenceinthevirus’inhibitionADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByCaoLiJuan(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:ChenChuangFuJune,2015I课题来源抗口蹄疫

3、病毒转基因猪育种新材料的研究转基因生物新品种培育国家重大专项编号：2009ZX08005---003BII摘要口蹄疫是由口蹄疫病原引发的主要侵害偶蹄动物组织的一种动物传染性疾病，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物传染病之一，有7种血清型,含有超过70多个亚型，几乎所有的类型间缺乏保护性免疫，因此给口蹄疫的防控带来了较大的困难。近几年在口蹄疫病毒的复制、细胞识别、病毒结构与功能之间关系等方面取得了较大的进展，但对病毒的致病机理仍然不是很清楚。针对口蹄疫病毒感染诱导宿主细胞凋亡的研究在国内外相对

4、较少。为了防治口蹄疫病毒的暴发，人们已经开始着力培育抗病毒转基因动物模型，我们实验室也先后培育出了5头抗O型口蹄疫病毒的转基因猪。为验证其抗病毒能力，在细胞水平上对抗口蹄疫病毒的效率进行评价。1.口蹄疫病毒非结构蛋白2B、3A的表达活性验证：利用分子生物学方法，按照基因库中提供的FMDV非结构蛋白2B、3A全长序列设计引物，提口蹄疫病毒总RNA，反转录成cDNA,以cDNA作为PCR扩增模板，通过PCR扩增得到2B、3A基因的DNA序列。将回收产物连接至克隆载体上，测序验证准确后，再将含有目的基因

5、3A、2B的克隆载体用双酶切切割后，连接至真核表达载体pEGFP-N1中，经序列测定和双酶切验证得到重组质粒pEGFP-N1-3A、pEGFP-N1-2B。用该质粒进行转染仓鼠肾细胞（BHK）,分别提取转染48h后正常组细胞、pEGFP-N1和实验组组细胞，加入蛋白裂解液进行裂解，裂解充分后收集蛋白上清，进行蛋白印记验证及电泳分析。实验表明：在转染24小时后的细胞在倒置荧光显微镜下发出绿色荧光，说明该质粒转染成功。经Westernblotting验证，在41KD处可见一条亮带，证明了融合蛋白3A-

6、EGFP、2B-EGFP在仓鼠肾细胞中可以成功表达。2.口蹄疫病毒非结构蛋白对感染细胞凋亡的影响：用细胞流式仪检测3A-EGFP、2B-EGFP融合蛋白对细胞凋亡的影响。结果显示：转染24h后的细胞在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光，经过流式检测仪显示：3A-EGFP融合蛋白对细胞凋亡有促进作用，与对照组相比差异显著（P＜0.01）。而融合蛋白2B-EGFP对细胞产生的凋亡效果与对照组相比差异不明显（P＞0.05）。3.转基因猪成纤维细胞的分离以及抗口蹄疫病毒（FMDV）的效应研究：干扰片段SiRN

7、A在抗口蹄疫病毒的转基因猪体细胞内的抗病毒效果，采用胶原酶消化法和动物组织块法两种分离细胞的方法，成功获得了抗病毒的转基因猪成纤维细胞，提取细胞基因组DNA,对含有shRNA片段的基因序列进行PCR验证。检测出在400bp处有亮条带的出现，正常猪却没有亮条带出现，测序结果表明：转基因猪体内含有一段外源的抗FMDV的3D的SiRNA片段。并在分离出的两种成纤维细胞上接种了定量的口蹄疫病毒。通过产生的细胞病理变化（CPE）以及实时定量PCR计算出了病毒在细胞中的含量,结果表明：接种相同剂量的病毒原液，

8、抗口蹄疫病毒的转基因猪和同日龄的正常猪成纤维细胞在抵抗病毒的效率有明显的差异，转基因猪的成纤维细胞发生病变的时间要比正常猪发生病变的时间长，而且通过对两种细胞进行病毒含量的检测，在18h时，病毒在转基因猪成纤维细胞的拷贝数要低于正常猪成纤维细胞的，说明该靶向FMDV干扰片段有良好的抗病毒能力。关键词：口蹄疫病毒；非结构蛋白2B、3A；真核表达；拷贝数；IIIAbstractFootandmouthdiseaseisanacuteinfectiousdiseasecausedbyan